示和纯化，进行phage梯度 稀释ELISA实验鉴定phage-abs的亲和力，方法同实施例3中3. 1。结果显示筛选出的几 株不同的噬菌体抗体均能与PDl进行结合，亲和力相差不是很大（图13)，其中DFPD1-9， DFPD1-10, DFPD1-11，DFPD1-12, DFPD1-13略好，选择这几种单链抗体进行后面试验。
[0108] 实施例 5、抗 PD-I 全抗体 DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13 亲和 力鉴定
[0109] 5. 1抗ro-i全抗体的制备
[0110] 将上述抗体的重链VH和轻链VK基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载 体pTSE (图14)，编码人恒定区γ 4 (见SEQ NO. 14)和K链（见SEQ NO. 15)的PTSE载体 中（pTSE载体结构如图14所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段）。 瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达。使用AKTA仪器protein A亲和柱纯化获得全抗 体蛋白。
[0111] 5. 2BIAcore XlOO测定全抗体的亲和力
[0112] 采用捕获法测定全抗体的亲和力。将抗人IgG偶联到CM5芯片表面，分别稀释 DFPD1-9, DFPD1-10, DFPD1-11，DFPD1-12 和 DFPD1-13 保证大约 300RU 左右的抗体被抗人 IgG 捕获。将 PD-I 设置一系列的浓度梯度（ΙΟΟΟηΜ，500ηΜ，250ηΜ，125ηΜ，62. 5nM，31. 25nM， 15. 625nM，7. 8125nM，3. 9063nM, I. 9531nM，0. 9766nM)流经固定相表面，测定抗体的亲和力。 结果发现筛出的抗体的亲和力相差不是太大（表3)。
[0113] 表3、抗PDl全抗体亲和力常数测定数值
[0114]
[0115] 5· 3全抗体与ro-i的结合实验
[0116] 用pH9. 6的碳酸盐缓冲液包被ro-1-His，60ng/孔/100yl，4°C过夜包被。用 300 μ 1/孔PBST洗五次，再加入1% BSA-PBS在37°C封闭2h。加入不同稀释度的全抗 DFPD1-9, DFPD1-10, DFPD1-11，DFPD1-12 和 DFPD1-13。五种全抗体最高浓度是 16ug/ml， 4倍稀释做11个梯度，最后一个孔作为阴性对照一一即只加稀释液PBS，37°C孵育lh。用 300 μ 1/ 孔 PBST 洗五次，再加入用 1 % BSA-PBS 1:40000 稀释的 Anti-Human Fc-HRP 二抗 37°C孵育lh。TMB显色试剂盒显色，100μΙ/孔，室温显色8min，然后用2Μ H2SO4终止显色， 50 μ 1/孔。450nm/630nm读数。实验结果如图15所示，所有抗体均能很好的与Η)-1分子 结合。
[0117] 5. 4全抗体竞争抑制ro-Ll与ro-i结合
[0118] 用pH9. 6的碳酸盐包被PDLl-Fc，4°C包被过夜。PBST洗涤五次，1 % BSA-PBS 37°C 封闭 2h。用 4μg/ml 的 PDl-His 分别稀释 DFPD1-9, DFPD1-10, DFPD1-11，DFPD1-12 和 DFPD1-13这五种全抗体，全抗体与Η)-1的摩尔比从10 :1开始，五倍梯度稀释，每个样品 做9个稀释度，37°C孵育lh。PBST洗五次，加入用1 % BSA-PBS稀释的HRP标记的小鼠抗 His抗体，37°C孵育lh。TMB显色试剂盒显色，100 μ 1/孔，室温显色8min。用10% H2SOgI 止显色，50μ1/孔。450nm/630nm 读数。结果如图 16 所示，DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11， DFPD1-12和DFPD1-13均能抑制Η)-1与I3D-Ll的结合（结果见图16)。
[0119] 实例6、抗ro-i抗体与细胞表面ro-i结合试验
[0120] 先构建过表达的I3D-I的CHO稳定细胞系，将它命名为roi-CH〇。用明胶包被96孔 板后，PDl-CHO细胞胰酶消化后中止，离心重悬，稀释至2 X IO5细胞/ml，每孔IOOul铺于96 孔板中，共12孔X6排，即2X104细胞/孔，5% C02,37°C培养过夜。第二天弃去培养基， 用350ul预冷的PBS洗一遍，2%新鲜配制的PFA固定5min，PBS洗2遍。
[0121] 细胞板中加入倍比稀释好的抗Η)-1全抗，稀释液为含0. 5% BSA的PBS。样品浓 度从100ug/ml起，8倍稀释，共12稀释度，室温孵育30min。然后弃去上清，350ulPBS洗3 遍后，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗人二抗，室温孵育15min。
[0122] 再用350ulPBS洗3遍，每孔加入lOOulTMB显色液，室温显色15-30min。每孔加入 50ul2M H2S04中止显色，酶标仪450nm读数。用Graphpad prism软件处理结果，计算结合 常数（见图17)。
[0123] 对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述， 显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案 进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合 的，均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗ro-i的单克隆抗体，其特征在于；包括：轻链和重链；所述轻链的互补决 定区 CDRl、CDR2 和 CDR3 分别用 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 表示；LCDRl 包含 RASQNIHSYLD、 RASQNVSNWLD、RASQSIHNYLD、RASQDINNWLD RASQDVRTYLD、RASQGINSWLD 或 RASQSVSNYLD 中 的任一种；LCDR2 包含 EASTRAS、DASNRAT、NASTRAT、DASTLAT、GASTRAT 或 DASTRAT 中的任一 种；LCDR3 包含 QQALKLPIT、QQSRHIPLT、QQELHLPLT、QQNVNLPLT、QQDIDLPLT、QQSYRLPLT 或 QQNMQLPLT中的任一种。2. 根据权利要求1所述的抗ro-i的单克隆抗体，其特征在于；所述轻链可变区氨基酸 序列包含 SEQ NO. 5、SEQ NO. 6、SEQ NO. 7、SEQ NO. 8、SEQ NO. 9、SEQ NO. 10 或 SEQ NO. 11 中 的任一种。3. -种抗ro-i的单克隆抗体，其特征在于；包括：轻链和重链；所述重链的互补决定 区 CDRl，CDR2 和 CDR3 分别用 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 表示；HCDRl 包含 SNNGMH 或 SNYGMH ; HCDR2 包含 VIWYDGSKK、VIWYDSSRK 或 VIWYDSTKK 中的任一种；HCDR3 包含 TAVYYCATNNDYW 或 TAVYYCATNTDYffo4. 根据权利要求3所述的抗ro-i的单克隆抗体，其特征在于；所述重链可变区氨基酸 序列包含 SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3 或 SEQ NO. 4 中的任一种。5. -种抗体、多肽或蛋白，其特征在于；所述抗体、多肽或蛋白包含权利要求1-4任一 所述的轻链或重链。6. -种多核苷酸序列或组合，其特征在于；所述多核苷酸序列或组合包含权利要求 1-4任一所述的轻链或重链。7. -种重组DNA表达载体，其特征在于；所述重组DNA表达载体包含权利要求6所述 的多核苷酸序列或组合。8. -种宿主细胞，其特征在于；所述宿主细胞在转染所述重组DNA表达载体时用到，所 述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞。9. 根据权利要求1-4任一所述的抗ro-i的单克隆抗体，其特征在于；所述抗体为全人 源抗体；所述抗体的重链恒定区包含IgGU IgG2、IgG3或IgG4 ;所述抗体的轻链恒定区包含 Ck或 Cx 〇10. -种全抗、单链抗体、单域抗体、双特异抗体、抗体药物偶联物或嵌合抗原受体T细 胞免疫疗法，包含权利要求1-4任一所述的轻链或重链。11. 一种单克隆抗体、人工载体、药物或药物组合物，其特征在于；所述单克隆抗体、人 工载体、药物或药物组合物包含权利要求1-4任一所述的轻链或重链。12. -种检测试剂或试剂盒，其特征在于；所述检测试剂或试剂盒包含权利要求1-4任 一所述的轻链或重链。
【专利摘要】本发明涉及抗体工程技术领域，具体公开了一种全人源的抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法，包含编码所述抗体的可变区和互补决定区的氨基酸序列，获得方法及单克隆抗体的用途。本发明从全合成抗体库中筛选出抗PD-1的单克隆抗体，然后通过噬菌体库链置换的方法进行亲和力成熟，先对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR1、2、3区突变建库筛选后，选取亲和力较高的单克隆抗体，再对其重链CDR1、2、3区突变建库进行筛选，最终筛选到了高亲和力的抗PD-1的单克隆抗体。本发明所得到的PD-1全人源抗体对PD-1具有良好的亲和力并能够抑制PD-1与其配体的结合，可用于肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗。
【IPC分类】C07K16/28, A61P31/12, G01N33/577, A61P35/00, A61P35/02, G01N33/68, A61P37/00, C12N15/13, A61K39/395
【公开号】CN105061597
【申请号】CN201510312910
【发明人】周海平, 李晓敏, 周俊杰, 裴爽, 昝琰璐, 汪瑞, 王浛, 白义, 白先宏
【申请人】北京东方百泰生物科技有限公司, 北京精益泰翔技术发展有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年6月9日