黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明“黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜黄色果肉基因yf紧密连锁的Indel标记引物，其特征在于：yfIndel39-F/yfIndel39-R:CATCTGCATTCTACGTGTTG/AATCGTGTTGCTACTTAGCTG；所述Indel标记扩增的与黄瓜白绿色果肉基因YF连锁的特征条带为132bp，核苷酸序列如Seq?ID?No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜黄色果肉基因yf连锁的特征条带为137bp，核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示；采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果肉是否为黄色的判断，具有高效、限制少的优点，为选育黄色果肉黄瓜提高了效率，缩短了育种周期。
【专利说明】黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术辅助育种技术，特别是黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
【背景技术】
[0002]黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国重要的保护地蔬菜，因其风味清香、口感脆爽，深受消费者的喜爱。随着消费水平的提高，人们对蔬菜品质的重视程度与日俱增。品质育种已成为黄瓜育种的重点之一。现在市场上的黄瓜几乎全部为白绿色果肉，胡萝卜素含量非常低。研究表明，黄色果肉黄瓜中含有丰富的β_胡萝卜素。β_胡萝卜素在人体无法合成，是一种必需维生素，可见黄色果肉黄瓜比普通黄瓜具有更高的营养价值。研究黄瓜果肉颜色的遗传规律及分子标记，对于选育高β_胡萝卜素含量的黄色果肉黄瓜都具有重要意义。
[0003]关于控制黄瓜果肉颜色的基因，前人已对其遗传规律进行了多项研究。1971年Kooistra首次对黄瓜黄色果肉基因进行了遗传分析，认为果肉颜色(包括橙色、黄色、灰白、亮白)由两对基因控制并符 合比例:灰白(V_W_):亮白(Vi):黄色(V_w_):橙色(v_w_)=9:3:3:l。Cuevas (2010)将控制β -胡萝卜素含量作为鉴定颜色的指标，经遗传分析认为中果皮的黄色基因应由两对基因控制，内果皮的黄色基因由I对隐性基因控制。2009年，沈镝对西双版纳黄瓜的橙色果肉进行遗传分析，认为其符合有主效基因的数量形状遗传规律，浅色显性于深色，且可能存在基因互作。
[0004]目前，有关黄瓜果肉颜色分子水平的研究所见报道不多，2009年，宋慧等对黄瓜中果皮和内果皮中控制β_胡萝卜素合成的基因进行了 QTL分析，检测到2个控制内果皮β-胡萝卜素含量的QTL和I个控制中果皮β-胡萝卜素含量的QTL。同年，沈镝也对控制版纳黄瓜中β -胡萝卜素含量的基因进行QTL定位，共检测到8个QTL，主效QTL位于第4条染色体上贡献率最高达到52.8%。
【发明内容】
[0005]本发明基于上述领域的空白，提供了与黄瓜黄色果肉基因yf紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选黄色和白绿色果肉黄瓜种质资源上的应用。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]黄瓜黄色果肉基因yf紧密连锁的Indel标记，其特征在于:
[0008]所述Indel 标记的引物为:yfIndel39-F/yfIndel39-R:
[0009]CATCTGCATTCTACGTGTTG/AATCGTGTTGCTACTTAGCTG ；
[0010]所述引物扩增的与黄瓜白绿色果肉基因YF连锁的特征条带为132bp，核苷酸序列如 Seq ID N0.1 ；
[0011]所述引物扩增的与黄瓜黄色果肉基因yf连锁的特征条带为137bp，核苷酸序列如和 Seq ID N0.2 所示。[0012]所述Indel标记在筛选具有特定果肉颜色基因yf/YF的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下:
[0013](I)采用上述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA分别进行PCR扩增；
[0014](2)对扩增结果进行凝胶电泳检测，，每个品种资源的检测结果显示为以下四种情况之一:
[0015]—条137bp特征条带,为黄色果肉隐型纯合材料；
[0016]—条132bp特征条带和一条137bp特征条带,为白绿色果肉显性杂合材料；
[0017]一条132bp特征条带，为白绿色果肉显性纯合材料； [0018]不出现上述特征条带，为不带有果肉颜色基因yf/YF的黄瓜材料；
[0019](3)根据检测结果，选出想要的材料。
[0020]所述PCR扩增的反应体系为:7.5ng DNA模板，所述引物正向和反向各50ng，5y LGo Taq? Green Master Mix,加双蒸水至 IOul。
[0021]所述PCR扩增的程序为:94°C预变性4分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保存。
[0022]所述凝胶电泳检测，指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
[0023]本发明以白绿色果肉黄瓜自交系新泰密刺选系931和黄色果肉自交系PI200815为亲本构建FpF2群体，对黄瓜黄色果肉基因yf进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现yf基因的染色体定位，并获得紧密连锁标记Indel标记yf Indel39,与yf的遗传距离为2.0cM0所述Indel标记扩增的与黄瓜白绿色果肉基因YF连锁的特征条带为132bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1 ;所述Indel标记扩增的与黄瓜黄色果肉基因yf连锁的特征条带为137bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2所示。
[0024]本发明通过利用13个西双版纳黄瓜资源进行验证，结果表明yflndel39用于黄色果肉材料分子标记辅助选择的正确率为92.3%。
[0025]本试验不仅为黄瓜黄色果肉基因yf的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有目标果肉颜色的黄瓜新品种提供了高效途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定颜色果肉的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用Indel标记引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况:第一种是仅仅出现一条137bp条带，这种为隐型纯合材料(黄色果肉)；另一种是132bp条带和137bp条带都出现，这种是显性杂合材料(白绿色果肉);第三种是仅仅出现132bp条带，这种为显性纯合材料(白绿色果肉)。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果肉颜色的鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1.是Indel标记的引物yflndel39对黄瓜亲本材料PI200815 (P1),931 (P2)及F2群体随机单株的检测结果；
[0027]P1:PI200815 (黄色果肉)；P2:931 (白绿色果肉)。
[0028]图2.13份黄色果肉西双版纳黄瓜检测结果。【具体实施方式】
[0029]生物材料
[0030]本研究所用的试验材料为PI200815和新泰密刺选系931。
[0031]PI200815 (P1),由美国北卡罗来那州立大学Todd C Wehner博士馈赠，为现有已知品种，在1971年Kooistra发表于《Euphytica》杂志第20期521-523页上研究论文“Inheritance of flesh and skin colors in powdery mildew resistant cucumbers，，中有记载。其表现型为植株生长势强，分枝发达，抗白粉病。果实卵圆形，深绿色，刺瘤稀疏、黑刺，黄色果肉。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0032]931 (P2):纯合新泰密刺选系，来自本所黄瓜课题组，为现有已知品种，张凤鸣等在《北方园艺》1989年第7期发表的文章《保护地优良品种——新泰密刺黄瓜简介》一文中也有记载。其表现型植株生长势较强，分枝少，感白粉病。果实长棒状，深绿色，刺瘤密、白刺，白绿色果肉。
[0033]以PI200815为母本，931为父本杂交，配制F1，自交获得F2群体。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0034]Indel引物是本实验室基于115份核心种质重测序的基因组信息、利用primer3.0软件开发而来。重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文〈〈A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumberdomestication and diversity》。SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(CUGI),共2112对(Ren et al.，2009)。详细结果可以参见Ren等在PloS 0ne2009年第4期在线发表的文章((An inteGrated Genetic and Cytoenetic map of the cucumber Genome〉〉。PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix ;凝胶电泳使用盈信阳光公司的40%非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6%后使用。
[0035]13份西双版纳黄瓜
[0036]西双版纳黄瓜是黄瓜(Cucumis sativus L.)中的一个新类型。具有方圆形、大脐、果肉橙色等甜瓜(Cucumis melo L.)的特征,该类型的黄瓜的一般共性在1993年第四期《园艺学报》中有记载。本发明采用的13份材料为采集自云南的具有上述共性特征的农家黄瓜种资资源，本实验有保存，自申请日起二十年可向公众发放。这些材料仅仅是用于验证验证本发明的方法和标记，本发明的实现并不依赖这些西双版纳黄瓜品种。本领域技术人员在云南特别是西双版纳地区也可以收集到其它西双版纳黄瓜种资资源并用来验证本发明的方法及标记。
[0037]实施例1.黄瓜黄色果肉基因yf连锁的Indel标记筛选
[0038]步骤1.黄瓜果肉颜色性状鉴定
[0039]试验于2012年春季和秋季在中国农业科学院蔬采花齐研究所实验基地进彳丁，以PI200815 (P1)和931 (P2)为父母本进行正反交、自交，获得F1'F2群体。2013年春季利用实验大棚种植Pp P2和正反交F1各10株，三次重复，随机区组排列。种植F2群体221株。株距25cm，行距55cm，按常规田间管理。在开花结果期，调查群体各单株上生理成熟瓜的果肉颜色。计算分离比，使用Microsoft Excel2003软件进行数据统计分析,使用SAS8.0对结果进行卡方测验。
[0040]结果显示:正反交后代F1果肉均表现为白绿色；在匕群体中，白绿色果肉与黄色果肉植株的分离比例为165:56，经卡方测验符合3:1 (卡方值为0.0068，P值为0.91)由此可知，黄色果肉性状是由I对隐性核基因控制的，白绿色果肉(YF)对黄色果肉(yf)为显性。[0041 ] 步骤2.DNA提取和分子标记分析
[0042]取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。
[0043]PCR反应体系为:总反应体系IOyL, 3μ L DNA (2.5ng.μ L-1)，正向和反向引物(50ng.μ L-1)各 I μ ?,5μ L Go Taq35 Green Master Mix (Promega 公司产品)。
[0044]引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al.,2009 ；Cavagnaro et al.,2010)。
[0045]PCR 扩增程序为:94°C预变性 4min ;94°C变性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，35个循环；72°C保温 5min, 16°C forever?
[0046]扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5 X TBE, 150V恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。
[0047]步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建
[0048]主要包括4步:(I)筛选在父母本间表现多态的分子标记；(2)在F2群体中选取黄色果肉、白绿色果肉单株的DNA各7个，根据BSA法构建黄色果肉和白绿色果肉2个基因池，用池筛选多态性引物；(3)利用获得的多态性引物分析F2群体各单株基因型；(4)利用JoinMap4.0软件进行连锁图的绘制。
[0049]共显性标记的统·计方法:与母本(PI200815)—致的带型记为a，与父本(931)—致的带型记为b，杂合的带型记为h。
[0050]显性标记的统计方法:若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b ;若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为C，未扩增出的或模糊不清的记为U。
[0051]结果显示:
[0052]用2112对SSR引物对P1(PI200815)和P2(931)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有275对，多态率13.0%。
[0053]结合BSA法建池，进一步筛选得到了 6个SSR多态性标记。
[0054]利用筛选出的多态性标记对PI200815X931组合的F2群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果6个标记和yf被定位在同一连锁群上(LOD=IOX
[0055]将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Ren et al.,2009 ；Miao etal，2011)比较，发现本连锁群与第7染色体上共有6个共有标记，据此将yf基因定位在第7染色体上。
[0056]步骤4.1ndel标记开发及yf连锁群分子标记加密
[0057]针对初定位的染色体区段，利用本实验室之前重测序的数据寻找Indel位点，利用primer3.0软件在这些Indel位点上设计引物,对连锁群进行分析标记加密。在目标区段(约2M)共设计了 40对Indel标记，用双亲筛选出有多态性的有6对标记。加上之前在此区域设计的SSR类型的有多态性的引物，上群体后得到一个总产度为17.8cM包含17个标记的连锁群，获得与黄果肉基因yf连锁距离为2.0cM的Indel标记yflndel39。
[0058]步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序[0059](I)目的片段的回收
[0060]采用煮沸法。具体操作为:先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100 μ L超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95°C水浴锅(或PCR仪)中煮30min后,5000rpm离心3min。产物即可取上清3 μ L做模板进行PCR扩增，剩余产物置_20°C保存备用。
[0061](2)目的片段的纯化
[0062]用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，_20°C过夜放置，I, 2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
[0063](3)目的片段与载体的连接
[0064]反应体系为10 μ L:PMD18_T Vectorl.0 μ L ;Ligation buffer I 5.0μ?;目的片段 4.Ομ L。
[0065]在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16°C连接约lh，过夜也不影响连接效率。
[0066](4)连接产物的转化
[0067]I)取出感受态细胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；
[0068]2)感受态(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 预冷去离子水;
[0069]3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，轻旋混匀；
[0070]4) 42°C水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
[0071]5)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3~5min ；
[0072]6)加入500 μ L LB液体培养基。在37°C，150rpm摇床上预培养Ih ；
[0073]7)将菌液涂布到含有 100 μ g.Hir1Amp、25 μ g ?mL^IPTG 和 40 μ g ?mL^X-GAL 的 LB固体培养基上，用一无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
[0074]8)倒置平板，37°C培养12~16h。
[0075](5)重组质粒的蓝白斑筛选
[0076]经37°C培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37°C,150rpm过夜培养。
[0077](6)菌落PCR的检测
[0078]吸取I μ L菌液作为模板进行PCR扩增。取4 μ L PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
[0079](7)克隆后载体的测序与分析
[0080]取3个阳性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存两份，一份-20°C保藏，一份送去测序。
[0081]其中Indel标记引物yflndel39扩增出的与黄瓜果实白绿色果肉基因YF连锁的片段的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；与黄瓜果实黄色果肉基因yf连锁的片段的核苷酸序列如Seq IDN0.2所示
[0082]SEQ ID N0.1与果实白绿色果肉基因YF连锁的片段(132bp)[0083]CATCTGCATTCTACGTGTTGATTGGCGACGTTTTTCAGGTAATTAATTAAATATATATCACATTGTTTCATTTATTAAATTACATATTCTAATCGGTTTTGTTAAATGATTCAGCTAAGTAGCAACACGATT
[0084]SEQ ID N0.2与果实黄色果肉基因yf连锁的片段(137bp)
[0085]CATCTGCATTCTACGTGTTGATTGGCGACGTTTTTCAGGTAATTAATTAAATATATATCACATTGTTTCATTTATTCGATTAAATTACATATTCTAATCGGTTTTGTTAAATGATTCAGCTAAGTAGCAACACGATT
[0086]实施例2.yf基因侧翼标记的验证
[0087]以本课题收集的13份西双版纳黄瓜作为材料，对实施例1获得的与yf基因连锁的标记yflnde139进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。经和所选材料的田间表现型相比，标记在这13个材料中共有12个株系的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算正确率为92.3%，见图2。
[0088] 综上，本发明构建了黄瓜黄色果肉yf基因的分子标记连锁图，所获得的Indel标记(yflndel39)与yf的遗传距离2.0cM，这个与黄瓜黄色果肉基因连锁的Indel标记为分子标记辅助选择育种筛选果肉颜色奠定了良好的基础。为建立一套快速准确鉴定黄瓜果肉颜色的方法提供了理论依据。
【权利要求】
1.黄瓜黄色果肉基因yf紧密连锁的Indel标记，其特征在于: 所述 Indel 标记的引物为:yfIndel39_F/yfIndel39-R:
CATCTGCATTCTACGTGTTG/AATCGTGTTGCTACTTAGCTG ； 所述引物扩增的与黄瓜白绿色果肉基因YF连锁的特征条带为132bp，核苷酸序列如Seq ID N0.1 ； 所述引物扩增的与黄瓜黄色果肉基因yf连锁的特征条带为137bp，核苷酸序列如和Seq ID N0.2 所示。
2.权利要求1所述Indel标记在筛选具有特定果肉颜色基因yf/YF的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下: (1)采用上述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA分别进行PCR扩增； (2)对扩增结果进行凝胶电泳检测，每个品种资源的检测结果显示为以下四种情况之 一条137bp特征条带,为黄色果肉隐型纯合材料； 一条132bp特征条带和一条137bp特征条带,为白绿色果肉显性杂合材料； 一条132bp特征条带,为白绿色果肉显性纯合材料； 不出现上述特征条带，为不带有果肉颜色基因yf/YF的黄瓜材料； (3)根据检测结果，选出想要的材料。
3.根据权利要求2所述的应用，所述PCR扩增的反应体系为:7.5ngDNA模板，所述引物正向和反向各5Ong, 5 μ L Go T叫? Green Master Mix,加双蒸水至IOul。
4.根据权利要求2所述的应用，所述PCR扩增的程序为:94°C预变性4分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保存。
5.根据权利要求2~4任一所述的应用:所述凝胶电泳检测，指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
【文档编号】C12Q1/68GK103740711SQ201410043738
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】张圣平, 顾兴芳, 苗晗, 鲁宏伟, 王烨 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所