一个植物减数分裂基因及其编码蛋白与应用的制作方法

专利名称：一个植物减数分裂基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个与调控植物减数分裂相关的基因及其编码蛋白与其在培育植物新品种中的应用。
背景技术：
减数分裂是真核生物形成正常雌雄生殖细胞、完成物种繁衍的关键环节，是作物形成经济产量的基础。在细胞学上，减数分裂主要由同源染色体联会、同源重组和染色体黏着与分离几个连续的事件组成，涉及到一个较复杂的基因调控网络。近几年，国际上利用单细胞真核生物-酵母，克隆了一些重要的减数分裂基因，如SPO11，DMC1，ZIP1，REC8等，其中大多数基因的单基因突变能导致相应的减数分裂过程异常，产生致死的孢子(王台等，科学通报2002，46838-842；Merino等，PNAS 9710477-10482；Celerin等，EMBO 2000，192739-2750；Watanabe等，Nature 1999，400461-464)，在分子水平上证明减数分裂基因是调控生物生殖特性的关键基因。
裂殖酵母的Rad21是第一个被分离并鉴定的Rad21/Rec8家族基因，最初的研究发现它与DNA双链断裂修复有关(Birkenbihl等，Nucl Acids Res 1992，206605-6611)，继而证明RAD21与另外3个蛋白亚基SMC1，SMC3和SCC1共同形成黏着素复合体，介导有丝分裂姊妹染色体之间的黏着(Guacci等，Cell 1997，9147-57；Hirano，Annu Rev Biochem 2000，69115-144；Michaelis等，cell 1997，9135-45；Sumara等，J Cell Biol 2000，151749-762；Sonoda等，Dev Cell 2001，1759-770；Nasmyth，Science 2000，2881379-1384；Nasmyth，Annu Rev Genet2001，35673-745)。RAD21的另一同源基因REC8则在减数分裂过程中特异性表达，其编码的蛋白也特异性的参与减数分裂黏着素的组成(SMC1，SMC3和SCC1则与有丝分裂黏着素共有)，介导和调节减数分裂染色体的黏着(Watanabe等，Nature 1999，400461-464；Buonomo等，Cell 2000，103387-98；Klein等Cell 1999，9891-103)。有丝分裂中期/后期过渡时RAD21被分离酶水解，黏着素从染色体上解离，导致姊妹染色体的分离(Uhlmann等，Nature 1999，40037-42；Uhlmann等，Cell 2000，103375-386；Waizeneger等，Cell 2000，103399-410；Lee等，Annu Rev cell Dev Biol2001，17753-77；Nasmyth，Science 2000，2881379-1384；Nasmyth，Annu RevGenet 2001，35673-745)，同样，当减数分裂I中期向后期过渡时，Rec8在分离酶的水解作用下首先从染色体两臂上解离，使同源染色体彼此分离。但是姊妹染色单体着丝点区的Rec8一直保留到减数分裂II后期(Klein等，Cell 1999，9891-103；Watanabe等，Nature 1999，400461-464)才从着丝粒区解离下来，使姊妹染色体分开，目前黏着素从着丝粒区解离的机制还不清楚。REC8突变导致减数分裂染色体黏着与分离异常，减数分裂I后期即发生姊妹染色单体的分离；后期II染色体的分离是随机的，从而产生非整倍体的没有活性的子细胞(Buonomo等，Cell 2000，103387-398)。
迄今为止，Rad21/Rec8的同源基因已经从芽殖酵母(Guacci等，Cell 1997，9147-57；Michaelis等，cell 1997，9135-45；Klein等cell 1999，9891-103)，裂殖酵母(Birkenbihl等，Nucl Acids Res 1992，206605-6611；Molnar等，Genetics1995，14161-73)，果蝇(Warren等，Gene 2000，25077-84)，线虫(Pasierbek等，Genes Dev 2001，151349-60)，非洲爪蟾(Losada等，Genes Dev 1998，121986-97)，哺乳动物鼠、人(McKay等，Genomics 1996，36305-15；Parisi等，MolCell Biol 1999，193515-3528)以及拟南芥(Bai等，plant cell 1999，11417-30；Bhatt等，Plant J 1999，19463-472；Dong等，Gene 2001，27199-108)等真核生物中被分离出来。它们在cDNA序列水平上没有或仅有极低的保守性，所编码的蛋白总体上在氨基酸序列上的相似性也很低，仅有10-22％的同源性，它们的保守性主要体现在N-和C-末端结构域上，而中间区域基本没有保守性。研究发现，尽管这些同源基因的序列同源性比较低，但是它们都具有一些相同的结构域/功能元件(1)高度保守的N-末端结构域(pfam04825)；(2)C-末端保守结构域(pfam04824)；(3)中间区域都有分离酶的识别序列，潜在的PEST序列，核定位信号等，这些对于它们在调节染色体黏着与分离中的功能都是非常重要的(Zhang等，J Exp Bot 2004，551149-1152)。按照它们的表达特性或者功能上的差异可以将其分为Rad21和Rec8两个亚家族。Rad21亚家族在有丝分裂中起作用，而Rec8亚家族则参与减数分裂过程。芽殖酵母、裂殖酵母、鼠和人中均存在两个该家族的基因，其中一个属于Rec8亚家族，另一个属于Rad21亚家族。
SYN1是从双子叶植物拟南芥中分离出的酵母减数分裂基因REC8的同源基因。但与动物细胞不同的是，拟南芥中有三个EAD21/REC8的同源基因，分别为SYN1，SYN2和SYN3，而且其表达也不是减数分裂特异的，它们在营养器官中也表达(Bai等，plantcell 1999，11417-30；Bhatt等，Plant J 1999，19463-472；Dong等，Gene 2001，27199-108)。在拟南芥SYN1缺失突变体中，减数分裂前期I同源染色体联会和染色体凝集异常，染色体黏着缺陷在前中期I即形成大量的单价体，减数分裂后期I染色体随机分离，最终产生大量的不育配子体(Bai等，plant cell 1999，11417-30；Bhatt等，Plant J 1999，19463-472)。因此SYN1可能是拟南芥减数分裂特异基因REC的同源基因。但对SYN2和SYN3的功能，现在还一无所知。因此，RAD21/REC8同源基因的克隆及其在植物减数分裂以及有丝分裂中的功能，是目前需要进一步研究的课题。

发明内容
本发明的目的是提供一个与调控植物减数分裂相关的基因及其编码蛋白。
本发明所提供的植物减数分裂基因，名称为OsRAD21-4，来源于稻属水稻(Oryzasativa L.ssp.japonica)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为用6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液在65℃杂交，用0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由2133个碱基组成，其编码框为自5’端第55-第1878位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明所提供的植物减数分裂基因的编码蛋白(OsRAD21-4)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有调控植物减数分裂功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由608个氨基酸残基组成。其中，自N端第1-第115位氨基酸残基为N-末端保守结构域(pfam04825)，自N端第554-第608位氨基酸残基为C-保守结构域(pfam04824)，而且OsRad21-4还包含有潜在的核定位信号(自N端第272-第279位氨基酸残基序列KRKKRRKD)，分离酶的识别位点(自N端第411-第421位氨基酸残基序列ADDIEKLRGNT和自N端第420-第430位氨基酸残基序列NTSGEYGRDYD)，PEST序列(自N端第511-第534位氨基酸残基序列RLSDVGPTPDLLEEIEPTQTPYEK)以及多个潜在的修饰位点，如磷酸化位点(CK2，PKC，CAMP等)，N-myristoylation位点和N-glycosylation位点等。
含有上述植物减数分裂基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增植物减数分裂基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明利用RT-PCR和RACE方法从水稻中克隆到了一个RAD21/REC8的同源基因OsR4D21-4，该基因主要在生殖器官中表达，在减数分裂前S期表达量最高；瞬时表达研究证明OsRAD21-4是一个核蛋白；RNAi干预实验证明OsRAD21-4是减数分裂过程中姊妹染色体正确黏着，同源染色体正常联会以及染色体正确凝集所必需的。通过转基因技术可将该基因用于改良植物品质(如生产无子瓜果，提高作物必需氨基酸的含量，提高叶类植物的产量等)，或将该基因用于研究植物生殖发育的调控技术(如雌、雄性不育)等。本发明在农业领域将具有重要的应用价值。


图1为OsRAD21-4表达的半定量RT-PCR分析结果图2为半定量RT-PCR检测转基因植株中内源OsRad21-4表达水平的结果图3为Western blot检测转基因植株中OsRad21-4蛋白表达情况的结果图4为分子杂交检测转基因植株中OsRad21-4特异的小干扰RNA的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海生工合成。
实施例1、OsRAD21-4的cDNA全长序列的获得植物材料水稻一、水稻颖花RNA的分离用Trizol试剂盒(GIBICO BRL公司)从处于减数分裂期的水稻颖花中提取总RNA，随后用无RNA水解酶的DNA水解酶(TaKaRa公司)除去RNA中残留的DNA，得到无DNA污染的RNA。
二、OsRAD21-4的cDNA全长序列的获得OsRAD21-4的cDNA全长序列的获得包括以下步骤1、用RT-PCR的方法扩增OsRAD21-4的部分cDNA序列，引物序列如下WP15′-ATGGCACTAAGGCTCTCC-3′；WP25′-ATAGAAGAGTCGGGCAGC-3′以所提取的处于减数分裂期的水稻颖花RNA经逆转录得到的第一链cDNA为模板，在引物WP1和WP2的引导下进行RT-PCR扩增。首先，逆转录合成第一链cDNA，反应体系及反应条件为将5g RNA和10pmol oligo-dT adapter引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)混合，加无菌水使反应体系达到12μL，70℃保温10min后，冰浴，加入4μL 5X第一链缓冲液，1μL 10mM dNTPs和2uL 0.1mMDTT，42℃预热2min后，加入1μL SuperScript II RNase H-逆转录酶(200U/μL，GIBCO BRL公司)，42℃反应50min，最后在70℃下加热15min，使逆转录酶失活，得到第一链cDNA。再以所合成的第一链cDNA为模板，在引物WP1和WP2的引导下，进行PCR扩增，50μL PCR反应体系为1X LA PCR缓冲液(TaKaRa公司)，1μL第一链cDNA，10pmol WP1，10pmol WP2，200uM dNTPs和2.5U LATaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，PCR反应条件为先94℃1min；再94℃1min，55℃1min，72℃3min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1600bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-T(Promega公司)上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为W152，对其进行测序，测序结果表明扩增片段长度为1587bp。
2、根据步骤1得到的cDNA序列设计特异性3’RACE引物(WP35′-GAAGTACAGTTGCCATCC-3′，WP45′-AGGCTTTCAGATGTTGGG-3′)和5’RACE引物(WP55′-ATCCAAATCCTCCAAACG-3′，WP65′-TCATACTTGGCTTGGGTT-3′)，通过RACEs进一步扩增OsRAD21-4cDNA的5’和3’端片段。
1)3′端片段的克隆以步骤1合成的第一链cDNA为模板，进行第一次PCR扩增，50μL PCR反应体系为10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1μL第一链cDNA，10pmol WP3，10pmol adapter引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)，200uMdNTPs和2.5U LATaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，PCR反应条件为先94℃1min；再94℃1min，55℃1min，72℃3min，共30个循环；最后72℃10min。再以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR扩增，除将引物WP3替换为WP4外，PCR反应体系及反应条件与第一次PCR相同。反应结束后，对第二次PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约560bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-T上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为W156，对其进行测序，测序结果表明扩增的OsRAD21-4cDNA的3′端片段长度为561bp。
2)5′端片段的克隆以所提取的处于减数分裂期的水稻颖花RNA经逆转录得到的第一链cDNA为模板，进行5′RACE扩增。首先，逆转录合成第一链cDNA，反应体系及反应条件为将5g RNA和2.5pmol WP5混合，加无菌水使反应体系达到12μL，70℃保温10min后，冰浴，加入4μL 5X第一链缓冲液，1μL 10mM dNTPs和2uL 0.1mM DTT，42℃预热2min后，加入1μL SuperScript II RNase H-逆转录酶(200U/μL，GIBCO BRL公司)，42℃反应50min，最后在70℃下加热15min，使逆转录酶失活，得到第一链cDNA，用GlassMax cartridge(GIBCO-BRL公司)纯化第一链cDNA，除去多余引物。用GIBCO BRL公司的5′RACE试剂盒并参照试剂盒说明书进行5′RACE反应，具体方法为首先在所合成的第一链cDNA的5′端加多聚G尾；再以5′端加多聚G尾的cDNA为模板进行第一次PCR扩增，50μL PCR反应体系为1X LA PCR缓冲液(TaKaRa公司)，1μL加尾的cDNA，10pmol WP5，10pmol UAP引物(试剂盒自带)，200uM dNTPs和2.5ULATaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，PCR反应条件为先94℃1min；再94℃1min，52℃1min，72℃2min，共30个循环；最后72℃10min。再以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR扩增，除将引物WP5替换为WP6外，PCR反应体系及反应条件与与第一次PCR相同。反应结束后，对第二次PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约380bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-T上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为W155a，对其进行测序，测序结果表明扩增的OsRAD21-4cDNA的5′端片段长度为383bp。
3、OsRAD21-4的cDNA全长序列的获得及其PCR鉴定利用步骤1和步骤2获得的长度分别为1587bp，561bp和383bp片段之间的重叠区，通过组装得到OsRAD21-4的cDNA全长序列，为验证所得到的拼接序列的正确性，根据该拼接序列的5’和3’端设计引物WP75’-CTCACTCGCTCATCCATT-3’和WP85’-CATCTTTGGTCCCCTTGA-3’，以步骤1获得的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1900bp的扩增片段，将其克隆到载体pGEM-T上，得到含有回收片段的重组质粒，命名为W157，对其进行测序，测序结果表明PCR扩增片段的序列与拼接序列一致，证明经拼接获得的OsRAD21-4的cDNA全长序列正确，该序列具有序列表中SEQ ID №1的多核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由2133个碱基组成，其编码框(ORF)为自5’端第55-第1878位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质，将该蛋白命名为OsRAD21-4，分子量为68493 Da，等电点为5.45。
4、序列分析对OsRAD21-4的cDNA全长序列及其编码蛋白(OsRAD21-4)的氨基酸序列进行BLAST分析，分析结果表明OsRAD21-4与数据库中已知基因的同源性较低，其编码蛋白的氨基酸序列与其它同源蛋白氨基酸序列的同源性也较低，同源性只有10-22％。
但组成这类蛋白的2个特征性保守结构域在OsRAD21-4的氨基酸序列中都存在，其中，自N端第1-第115位氨基酸残基为N-末端保守结构域(pfam04825)，自N端第554-第608位氨基酸残基为C-末端保守结构域(pfam04824)，而且OsRad21-4还包含有潜在的核定位信号(自N端第272-第279位氨基酸残基序列KRKKRRKD)，分离酶的识别位点(自N端第411-第421位氨基酸残基序列ADDIEKLRGNT和自N端第420-第430位氨基酸残基序列NTSGEYGRDYD)，PEST序列(自N端第511-第534位氨基酸残基序列RLSDVGPTPDLLEEIEPTQTPYEK)以及多个潜在的修饰位点，如磷酸化位点(CK2，PKC，CAMP等)，N-myristoylation位点以及N-glycosylation位点等，经下述实施例中的实验证明这些元件对于OsRAD21-4蛋白运输到细胞核内参与黏着素复合体的组装，在细胞周期的中期/后期过渡时被分离酶识别并切割以及在此后的降解都是必需的，而且这些过程相互协调，共同调节减数分裂中染色体黏着与分离过程的正确进行。
实施例2、体外表达OsRAD21-4蛋白及制备其多克隆抗体以实施例1构建的经测序确认的含有OsRad21-4全长cDNA序列的质粒W157为模板，在引物WP95′-CAGAATTCGGAATGCGTTTGGAGGAT-3和引物WP105′-CAGAATTCGGAATGCGTTTGGAGGAT-3′的引导下，进行PCR扩增，将目的片段用Klenow酶处理补平5′末端，再用限制性内切酶Sal I酶切处理，将其插入到经限制性内切酶Sma I和Sal I双酶切处理的原核表达载体pGEX-4T-3(Amersham)中，得到OsRAD21-4的重组表达载体，命名为pGE21-4。用CaCl2法将融合表达载体pGE21-4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB液体培养基中37℃振荡培养，在处于对数期的培养物中加入IPTG至终浓度为2mM，诱导OsRad21-4蛋白的表达，37℃继续培养2小时后，离心收集菌体，通过溶菌酶裂解菌体(Worrall，Methods Mol Biol 1996，5931-7)并且利用Glutathione sepharose 4B亲和层析柱(GST Purification Modules，AmershamBiosciences)并参照操作手册上的步骤纯化经诱导表达的GST-OsRAD21-4融合蛋白。可将纯化得到的融合蛋白与弗氏佐剂混合注射新西兰大白兔(Hanly等，ILAR J 1995，3793-118)，经多次加强注射后，得到抗OsRAD21-4的多克隆抗血清。用Protein-A(HiTrapTM Protein-A HP，Amersham)并参照说明书对抗血清进行纯化。
实施例3、OsRAD21-4的表达特性分析以水稻微管蛋白基因tubA作对照(Ding等，Sex Plant Reprod，2001，13285-288)，用RT-PCR的方法分析OsRAD21-4的表达特性。RT-PCR所用的OsRAD21-4的特异性引物序列为WP11(正义引物)5′-CAGAATTCGGAATGCGTTTGGAGGAT-3′；WP12(反义引物)5′-CAGAATTCGGAATGCGTTTGGAGGAT-3′分别提取水稻颖花、叶、幼芽、根以及处于不同生殖发育时期的颖花(雄蕊与心皮形成时期，花粉母细胞形成时期包含减数分裂前S期，减数分裂期，单核与二核花粉发育时期和成熟花粉期)的总RNA，分别以所提取的不同的总RNA为模板，逆转录合成第一链cDNA，反应体系及反应条件为将5μg RNA和10pmol oligo-dT adator引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)混合，加无菌水使反应体系达到12μL，70℃保温10min后，冰浴，加入4μL 5X第一链缓冲液，1μL 10mM dNTPs和2uL 0.1mM DTT，42℃预热2min后，加入1μL SuperScript II RNase H-逆转录酶(200U/μL，GIBCO BRL公司)，42℃反应50min，最后在70℃下加热15min，使逆转录酶失活，得到第一链cDNA。再以所合成的第一链cDNA为模板，在引物WP1和WP2的引导下，进行PCR扩增，50μL PCR反应体系为1X LA PCR缓冲液(TaKaRa公司)，1μL第一链cDNA，10pmol WP11，10pmol WP12，200uM dNTPs和2.5U LATaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)，PCR反应条件为先94℃1min；再94℃1min，55℃1min，72℃1min，共25个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(图中A为OsRAD21-4在花(F)，叶(L)，幼芽(B)，根(R)中的表达分析结果，tubA为参照；B为OsRAD21-4在不同生殖发育时期的颖花以及成熟花粉粒中的表达特性分析结果泳道1为雄蕊与心皮形成时期的花，泳道2为花粉母细胞形成时期及减数分裂前S期的花，泳道3为减数分裂期的花，泳道4为单核与二核花粉发育时期的花，泳道5为成熟花粉粒，tubA为参照)，表明OsRAD21-4在减数分裂期的颖花中表达量最高，在其它组织器官中表达量很低。在生殖发育过程中，OsRAD21-4在雄蕊与心皮形成时期即有较高的表达量，到减数分裂前S期表达量达到最高，表明OsRAD21-4在减数分裂时期有很高的表达量，在单核与二核花粉发育时期的表达量很低，而在成熟花粉中检测不到OsRAD21-4的表达。
实施例4、OsRAD21-4在花药中的精细细胞表达位点在实施例2OsRAD21-4的表达特性分析的基础上，进一步用原位杂交的方法分析该基因在花器官中的精细表达位点。具体方法为在室温下，用FAA(50％乙醇，5％丙酸和3.7％甲醛)固定液固定花药16小时，随后用乙醇逐级脱水，按标准方法浸蜡，将植物材料包埋在paraffin(Sigma公司)中，最后切片(厚度为10微米)，将切片贴在经赖氨酸包被的载玻片(Sigma公司)上。脱蜡、复水和原位杂交按Meyerowitz(Meyerowitz，Plant Mol Biol Rep，1988，5242-250)的方法进行。将质粒W152用限制性内切酶酶切使其线性化，并以其作模板，用T7或SP6RNA聚合酶(Boehringer mannheim，Indianapolis，IN，USA)合成地高辛标记的正义和反义探针，在42℃杂交20小时，所用杂交液成份为50％formamide(甲醛)，5％dextransulfte(硫酸葡聚糖)，1％block reagent(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，USA)，150mg/mL tRNA(Sigma公司)，300mM NaCl，1mM EDTA和10mM Tris(pH7.5)。使用DIG检测试剂盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，USA)检测杂交信号。原位杂交结果表明OsRAD21-4仅在减数分裂前和减数分裂期颖花的性细胞以及绒毡层细胞中表达，在其它细胞中不表达，表明OsRAD21-4是一个水稻减数分裂优势表达基因。
实施例5、OsRAD21-4RNAi转基因水稻的获得一、OsRAD21-4RNAi干扰载体的构建1、RNAi干扰载体的构建首先用限制性内切酶EcoR I和Hind III对载体pBI121(CLONTECH公司)进行酶切，得到一个含有35s启动子、Gus报告基因和nos中止子的DNA片断，将该片段命名为P35s::GusA::Tnos，然后将其与经过相同酶双酶切处理的载体pCAMBIA-1300(CAMBIA公司)连接，得到含有P35s::GusA::Tnos的重组载体，命名为p1300W2。
再以pCAMBIA-1302(CAMBIA公司)为模板，在引物对(5’-TCTAGAGGATCCCCACTAGTGGTACCTAAGGGCCCTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAG-3’和5’-ATTCGAGCTCGGTTACCATTTAAATGTCGACGGCGCGCCTTATTTGTATAGTTCATCCATGAAATG-3’)的引导下，PCR扩增绿色荧光蛋白基因(GFP)片断。将GFP片断经限制性内切酶Xba I和SacI双酶切后，与经同样酶双酶切处理的载体p1300W2连接，得到可用于构建OsRAD21-4RNAi干扰载体的载体，命名为p1300MGM。
2、OsRAD21小干扰RNA编码基因的扩增及OsRAD21-4 RNAi干扰载体的构建根据OsRad21-4非保守区的cDNA序列，设计两对引物WP178F/WP178R(正义方向)和WP179F/WP179R(反义方向)，引物序列如下WP178F5′-AGTCTAGAGGGAATGCGTTTGGAGGAT-3′WP178R5′-TAGGTACCTGGGTTGGAAATGCCTGA-3′WP179F5′-TAGAGCTCGGGAATGCGTTTGGAGGAT-3′WP179R5′-TAGTCGACTGGGTTGGAAATGCCTGA-3′以W157为模板，分别在引物对WP178F/WP178R和WP179F/WP179R的引导下，进行PCR扩增，得到OsRad21-4非保守区的同一段cDNA片断(只是两端的限制性内切酶的识别位点不同)，即OsRAD21小干扰RNA的编码基因。将用引物对WP178扩增的片段用限制性内切酶XbaI和KpnI酶切后，与经相同酶酶切的载体p1300MGM连接，将用引物对WP179扩增的片段用限制性内切酶SacI和SalI酶切后，与经相同酶酶切的且连接有WP178扩增片段的载体p1300MGM连接，得到OsRAD21-4的RNAi干扰载体，命名为pRAD21-4i。
二、OsR4D21-4RNAi转基因水稻的获得将pRAD21-4i质粒通过冻融法转化农杆菌EHA105，长出菌斑后用PCR的方法做鉴定，PCR所用的引物为WP178F和WP190R(WP190R5′-TAACCTTCGGGCATGGCAC-3′)，经扩增得到约800bp片段的为阳性克隆，将阳性克隆用农杆菌介导法转化水稻的愈伤组织，经50ug/mL潮霉素抗性筛选，得到转化有pRAD21-4i的水稻愈伤组织。经过培养，再生之后获得转基因水稻幼苗，具体方法可参阅“Hiei等，Plant J 1994，6271-282”。
三、OsRAD21-4RNAi转基因水稻的检测1、转基因植株的分子检测对步骤二获得的转基因植株通过微量法提取基因组DNA，并以此为模板，在引物对WP178F和WP90R的引导下，进行PCR检测，可扩增出约800bp片段的为转基因阳性株系，进而利用α-32P-dCTP标记的潮霉素片断为探针对经PCR鉴定为阳性的转基因株系进行Southern杂交确认。
2、转基因植株中内源OsRad21-4表达水平的检测首先利用半定量RT-PCR对步骤1获得阳性转基因株系进行分析，模板为阳性转基因株系的总RNA经逆转录得到的第一链cDNA，引物为WP11和WP12，对照为tubulinA(引物为Tubl5′-TCAGATGCCCAGTGACAGA-3′和Tub25′-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3′)，检测结果如图2所示(泳道WT为野生型对照，泳道R1，R2，R4，R5，R6为不同的转基因株系)，表明阳性转基因株系的内源OsRad21-4的表达水平与对照相比降低。同时，提取上述阳性转基因株系总蛋白，用Western blot检测OsRad21-4蛋白的表达情况，以tubulin A作为定量对照，结果如图3所示(泳道WT为野生型对照，泳道R11，R12，R14，R15，R16为不同的转基因株系)，表明转基因株系的OsRad21-4蛋白表达水平与对照相比也相应的明显降低。上述半定量RT-PCR和表达分析条件与实施例3相同。Western blot分析方法如下所述。总蛋白的提取按照Salekdeh等(Proteomics 2002，21131-1145)的方法进行。12％的SDS-PAGE电泳对总蛋白进行分离(Laemmli，Nature 1970，227680-685)。胶上的蛋白通过半干法以2mA/cm2稳流转移到PVDF膜上(转膜液，10mM CAPS，10％(v/v)甲醇)转膜时间为1小时。将膜在封闭液(3％BSA in TBS buffer(20mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl))中封闭1小时，然后在含有OsRAD21-4多克隆抗体(1∶10000稀释)的杂交液(成分与封闭液相同)中37℃温育1小时，用TTBS(0.05％Tween-20，20mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl)洗膜3次，每次5分钟。然后将膜转移到含有碱性磷酸酶标记的羊抗兔的二抗(1∶2000稀释，华美公司)杂交液中37℃温育1小时，在上述条件下洗膜，然后在TBS(20mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl)缓冲液中洗两次每次5分钟。最后在NBT/BCIP显色液(华美公司)中检测杂交信号。
3、OsRad21-14持异的小RNA的检测提取对照(野生型植株)和各个阳性转基因株系的总RNA，然后加入终浓度为5％的PEG8000和终浓度为0.5M的NaCl以沉淀大分子量的RNA，离心后将含有小分子量RNA的上清在8％聚丙稀酰胺凝胶上分离(具体方法可参阅Hamilton等，Science1999，286950-952)，然后通过半干转移将分离到的小分子量RNA转移到PVDF膜上，用放射性同位素α-32P标记的OsRad21-4cDNA片断(实施例5步骤2扩增的OsRad21-4非保守区的cDNA片段)进行杂交检测，结果如图4所示(A中泳道WT为野生型对照，泳道R1，R2，R4，R5，R6为不同的转基因株系；B表示RNA上样量的一致性)，表明转基因株系中有大约22nt的特异的OsRad21-4的小干扰RNA分子存在，而在未转基因的对照株系中未检测到相应的小干扰RNA分子的存在。该结果与上述半定量RT-PCR结果和Western blot分析结果吻合。
4、转基因水稻的育性及其花粉活性检测对OsRAD21-4 RNAi转基因水稻植株的结实率进行分析，分析结果表明部分RNAi植株的育性较高，而部分RNAi植株的育性受到严重影响，不足对照植株的10％，有的甚至完全不育。对育性受到影响的转基因植株的花粉活性通过TTC染色和I2-KI染色检测发现其花粉活性较低，只有正常植株的10％，且花粉粒大小不均一，而且这些株系的花粉数目较少。以上结果表明转入的OsRAD21-4 RNAi干扰载体在转基因水稻内表达生成特异的小干扰RNA，导致内源OsRad21-4表达受到抑制，最终导致转基因植株的花粉活性以及结实率降低。
5、转基因水稻的减数分裂行为分析参照Ross等(Ross等，Chromosome Res 1996，4551-559)的方法制备转基因阳性植株的减数分裂染色体，具体方法为将处于减数分裂期的转基因植株的幼穗在固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)中固定，10mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)冲洗后在含有0.3％纤维素酶和0.3％果胶酶的上述缓冲液中于37℃消化30分钟。用相同的缓冲液冲洗之后，将花药置于一滴60％的乙酸(在载玻片上)中以释放染色体，然后冰冻揭片，最后用5μL的DAPI antifade溶液(1μg/mL DAPI，50％甘油，10mM柠檬酸缓冲液和25μg/mL DABCO)染色5分钟，在荧光显微镜下(ZEISS AXIOSKOP40，HBO100)观察处于减数分裂时期小孢子的染色体行为，发现在减数分裂前期I的细线期开始染色体凝集，即表现出异常，到偶线期和粗线期则更为明显；双线期同源染色体联会缺陷，存在单价体；在终变期部分同源染色体提前分离因而存在许多单价体，减数分裂I中期；部分染色体不能排列在赤道板上，部分染色体发生提前分离；后期I存在染色体桥，部分染色体分离滞后，染色体在随后的细胞的两极分配不均匀；形成的二分体的两个子细胞大小不均一，存在小核。在减数分裂II存在与减数分裂I中相类似的现象，同时两个子细胞分裂不同步，因此最终导致异常四分体(大小不均一，存在小核等)和无活性的花粉粒的产生。上述结果表明转基因植株的育性低，OsRAD21-4是一个减数分裂基因。同时对转基因植株的有丝分裂行为进行分析，没有发现明显的有丝分裂异常。
实施例6、洋葱表皮的瞬时表达实验利用引物WP286F(5’-CGCAGATCTCTCACTCGCTCATCCATT-3’)和WP286R(5’-GCTCTAGACATCTTTGTCCCCTTGA-3’)，以质粒W157为模板通过PCR扩增得到OsRad214的全长ORF，将其用限制性内切酶BglII和XbaI进行酶切，然后将酶切后的片断与经限制性内切酶BglII和SpeI酶切后的载体pCAMBIA-1302(CAMBIA公司，经过SpeI或XbaI酶切后的片断具有相同的粘末端)连接得到含有P35s::OsRad21-4::GFP的融合表达载体，并且经过测序验证表明扩增的OsRad214的全长ORF片段及其在载体pCAMBIA-1302中的插入位置正确。先将该融合表达载体导入农杆菌中，然后利用Yang等(Plant J 2000，22543-551)的方法再将其导入洋葱表皮中进行培养。利用荧光显微镜(Zeiss)在FITC虑光片下检测GFP荧光信号，结果在对照细胞(只导入pCAMBIA-1302载体的洋葱表皮细胞)中GFP信号均匀分布于细胞核与细胞质中，而在导入OsRad21-4::GFP融合表达载体的细胞中GFP信号主要存在于细胞核中，表明OsRAD21-4是一核蛋白。
序列表<160>2<210>1<211>2133<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)<400>1cagcgcctcc acttctcact cgctcatcca ttccctccct cctcacgatc gaggatgttc 60tactcgcacc agctcctcgc gcggaaggct ccgctcggcc agatatggat ggcggcgacg120cttcactcga agatcaaccg gaagcggctt gacaagctcg acatcatcaa aatctgtgag180gagattttga acccgtcggt acccatggca ctaaggctct ccggaattct catgggtggt240gtggcgatcg tgtacgagag gaaggtgaag gctctgtatg atgatgtgtc tcggtttctg300attgagatca acgaggcatg gcgggtcaag ccagtcgcag accccaccgt acttcccaag360ggcaaaaccc aagccaagta tgaagcagta acactgccag agaatatcat ggatatggat420gtggagcagc ccatgctttt ctcagaggct gatactacaa ggttccgggg aatgcgtttg480gaggatttgg atgaccaata cattaatgtc aacctagacg atgatgactt ctcgcgcgct540gagaatcatc accaagctga tgcagaaaat atcaccctgg ctgataattt cgggtctggg600cttggagaga ctgatgtgtt caatcgtttt gagagattcg acataacaga tgatgatgca660actttcaatg tcactcctga tggacaccca caggttccaa gtaatctggt tccttctcca720cctaggcagg aagactctcc tcagcaacaa gaaaaccatc atgctgcctc atcccctctt780cacgaagaag ctcaacaagg gggggcatct gtaaaaaatg agcaagagca gcagaagatg840aagggtcagc aacctgctaa atcatcaaag agaaaaaaac gtaggaaaga tgatgaggtg900atgatggata acgaccagat aatgatccca ggaaatgtat atcaaacatg gctgaaggat960ccatcaagcc tcattaccaa aaggcacaga atcaacagta aagttaatct tattcggtca 1020atcaagataa gagacctcat ggacttgccc ctcgtttctc taatatcttc cttggagaag 1080tcacccttag aattttatta tcctaaggaa cttatgcagc tttggaagga atgtactgaa 1140gtcaagtccc caaaagctcc atcttcagga gggcagcagt catcatcacc agaacaacag 1200caaagaaact tgcctcctca ggcatttcca acccagcctc aggttgataa tgacagggaa 1260atgggatttc acccagtgga ctttgcagat gacatcgaaa aactccgagg aaacactagt 1320
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Pro Thr Val Leu Pro Lys Gly Lys Thr Gln Ala Lys Tyr Glu Ala Val100 105 110Thr Leu Pro Glu Asn Ile Met Asp Met Asp Val Glu Gln Pro Met Leu115 120 125Phe Ser Glu Ala Asp Thr Thr Arg Phe Arg Gly Met Arg Leu Glu Asp130 135 140Leu Asp Asp Gln Tyr Ile Asn Val Asn Leu Asp Asp Asp Asp Phe Ser145 150 155 160Arg Ala Glu Asn His His Gln Ala Asp Ala Glu Asn Ile Thr Leu Ala165 170 175Asp Asn Phe Gly Ser Gly Leu Gly Glu Thr Asp Val Phe Asn Arg Phe180 185 190Glu Arg Phe Asp Ile Thr Asp Asp Asp Ala Thr Phe Asn Val Thr Pro195 200 205Asp Gly His Pro Gln Val Pro Ser Asn Leu Val Pro Ser Pro Pro Arg210 215 220Gln Glu Asp Ser Pro Gln Gln Gln Glu Asn His His Ala Ala Ser Ser225 230 235 240Pro Leu His Glu Glu Ala Gln Gln Gly Gly Ala Ser Val Lys Asn Glu245 250 255Gln Glu Gln Gln Lys Met Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Ser Ser Lys260 265 270Arg Lys Lys Arg Arg Lys Asp Asp Glu Val Met Met Asp Asn Asp Gln275 280 285Ile Met Ile Pro Gly Asn Val Tyr Gln Thr Trp Leu Lys Asp Pro Ser290 295 300Ser Leu Ile Thr Lys Arg His Arg Ile Asn Ser Lys Val Asn Leu Ile305 310 315 320Arg Ser Ile Lys Ile Arg Asp Leu Met Asp Leu Pro Leu Val Ser Leu325 330 335Ile Ser Ser Leu Glu Lys Ser Pro Leu Glu Phe Tyr Tyr Pro Lys Glu340 345 350Leu Met Gln Leu Trp Lys Glu Cys Thr Glu Val Lys Ser Pro Lys Ala
355 360 365Pro Ser Ser Gly Gly Gln Gln Ser Ser Ser Pro Glu Gln Gln Gln Arg370 375 380Asn Leu Pro Pro Gln Ala Phe Pro Thr Gln Pro Gln Val Asp Asn Asp385 390 395 400Arg Glu Met Gly Phe His Pro Val Asp Phe Ala Asp Asp Ile Glu Lys405 410 415Leu Arg Gly Asn Thr Ser Gly Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Asp Ala Phe420 425 430His Ser Asp His Ser Val Thr Pro Gly Ser Pro Gly Leu Ser Arg Arg435 440 445Ser Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Arg Gly Phe Thr Gln Leu Asp450 455 460Pro Glu Val Gln Leu Pro Ser Gly Arg Ser Lys Arg Gln His Ser Ser465 470 475 480Gly Lys Ser Phe Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Glu Glu Phe Pro Phe485 490 495Glu Gln Glu Leu Arg Asp Phe Lys Met Arg Arg Leu Ser Asp Val Gly500 505 510Pro Thr Pro Asp Leu Leu Glu Glu Ile Glu Pro Thr Gln Thr Pro Tyr515 520 525Glu Lys Lys Ser Asn Pro Ile Asp Gln Val Thr Gln Ser Ile His Ser530 535 540Tyr Leu Lys Leu His Phe Asp Thr Pro Gly Ala Ser Gln Ser Glu Ser545 550 555 560Leu Ser Gln Leu Ala His Gly Met Thr Thr Ala Lys Ala Ala Arg Leu565 570 575Phe Tyr Gln Ala Cys Val Leu Ala Thr His Asp Phe Ile Lys Val Asn580 585 590Gln Leu Glu Pro Tyr Gly Asp Ile Leu Ile Ser Arg Gly Pro Lys Met595 600 60权利要求
1.一个植物减数分裂基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的植物减数分裂基因，其特征在于所述植物减数分裂基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.权利要求1所述植物减数分裂基因的编码蛋白，其特征在于是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物减数分裂功能的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中的SEQ ID №2氨基酸残基序列。
5.含有权利要求1所述植物减数分裂基因的表达载体。
6.含有权利要求1所述植物减数分裂基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求1所述植物减数分裂基因的宿主菌。
8.权利要求1所述的植物减数分裂基因在培育植物新品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个植物减数分裂基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个减数分裂基因及其编码蛋白与其在培育植物新品种中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。通过转基因技术可将本发明的基因用于改良植物品质(如生产无子瓜果，提高作物必需氨基酸的含量，提高叶类植物的产量等)，或将该基因用于研究植物生殖发育的调控技术(如雌、雄性不育)等。本发明在农业领域将具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/29GK1699571SQ20051007765
公开日2005年11月23日 申请日期2005年6月22日 优先权日2005年6月22日
发明者王台, 张亮然, 王顺心, 陶佳乙 申请人:中国科学院植物研究所