专利名称：用于调节减数分裂的甾醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一些甾醇衍生物及其作为药物的应用。更确切地说，发现一些甾醇衍生物可用于调节减数分裂。
减数分裂是生殖细胞的独特而基本的过程，有性生殖就基于减数分裂。减数分裂由两次成熟分裂过程组成。在第一次分裂期间，在成对的染色体分离成两个子细胞之前发生雌性基因和雄性基因间的交换。仔细胞中只含有一半数量(1n)的染色体和2cDNA。第二次成熟分裂进行时没有DNA的合成。因此这次分裂导致形成的单倍体生殖细胞中只有1cDNA。
雄性和雌性生殖细胞中进行的减数分裂过程相类似，但是时间程序和产生卵细胞和精细胞的分化过程完全不同。所有的雌性生殖细胞进入第一成熟分裂前期发生于生命的早期，通常是在出生前，但随后在前期(dictyate state)全成为卵母细胞直到青春期后排卵。这样，从生命的早期开始雌性体中贮存有卵母细胞，它不断被利用直至贮存的全部消耗。直到受精后，雌性体中才完成减数分裂，且每个生殖细胞只生成一个卵子和两个发育不全的极体。反之，只有部分雄性生殖细胞从青春期开始进行减数分裂且一生中都保留母体生殖细胞数。一旦开始，雄细胞中减数分裂的进行没有明显的中断且产生4个精子。
有关控制雄性体和雌性体中起始进行减数分裂的机理尚少为人知。至于卵母细胞，新的研究表明卵泡的嘌呤，次黄嘌呤或腺苷，可能阻碍减数分裂(Downs，S.M.et.al.Dev.Biol.82(1985)454-458；Eppig，J.J.et.al.Dev.Biol.119(1986)313-321；and Downs，S.M.Mol-Reprod.Dev.35(1993)82-84)。Byskov et.al.首先报道弥漫性的减数分裂调节物质存在于鼠胎性腺的培养体系中(Byskov，A.G.et.al.Dev.Biol.52(1976)193-200)。诱发减数分裂的物质(MIS)是从进行减数分裂的胎鼠卵巢分泌出来的，而减数分裂的抑制物质(MPS)则是从结构不同的、带有非成熟分裂的静息生殖细胞的睾丸中释放出来的。有人认为MIS和MPS的相对浓度调节起点，停止和恢复雄性和雌性生殖细胞中的减数分裂(Byskov，A.G.et.al.in The Physiology of Reproduction Leds.Knotil，E.and Neill，J.D.，Raven Press，New York(1994))。显然，如果减数分裂可被调节，则生殖可被控制。遗憾的是，迄今尚不能鉴定引起减数分裂的物质。
意外地发现，被称为胆甾醇生物合成中的中间体的某些甾醇，以及一些新型的、结构上类似的合成甾醇可用于调节减数分裂。
因此，本发明涉及通式(I)的一种化合物作为药物的应用 其中R1和R2独立地选自氢、可以被卤素或羟基取代的无支链的或支链的C1-C6烷基，或者，其中R1和R2与其所连接的碳原子一起构成环戊烷环或环己烷环；R3和R4一起表示在其所连接的碳原子间的一个外加键，这种情况中R5是氢而R6和R7或者为氢或者一起表示在其所连接的碳原子间的一个外加双键；或者R5和R4一起表示在其所连接的碳原子间的一个外加键，这种情况中R3是氢而R6和R7或者为氢或者一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键；或者R6和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键，这种情况中R3，R5和R7都是氢；R8和R9是氢或一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键；且R10或为氢，或为包括磺基、膦酰基在内的酰基，或者R10为与该分子其余部分一起构成一种醚的基团。
另一方面，本发明涉及通式(I)的新型化合物。
本文中，“调节减数分裂”是指本发明的化合物可用于体外，体内，和来自体内刺激减数分裂。
于是，另一更具体方面，本发明涉及上述通式(I)的化合物在调节减数分裂方面的应用。
更进一步地，本发明涉及调节哺乳动物的生殖细胞内减数分裂的一种方法，该方法包括对需要这种治疗的生殖细胞施用有效量的上述通式(I)的化合物。
已经发现，从公牛睾丸和人卵泡液中提取的诱发减数分裂的物质既能诱发培养的鼠卵母细胞恢复减数分裂(卵母细胞试验)，也可刺激培养的胎鼠睾丸雄性生殖细胞内的减数分裂(性腺试验)。诱发引起减数分裂的物质由包括男人在内的各种哺乳动物的成熟睾丸内产生，还发现产生于包括妇女在内的数种哺乳物种的成熟卵泡中。如实施例1和2所示，发现于公牛睾丸内的诱发减数分裂的物质是4，4-二甲基酵母甾醇而发现于人卵泡液中的诱发减数分裂的物质是4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇。
诱发减数分裂的物质的存在为人所知已有一段时期了。但是，迄今鉴定诱发减数分裂的某物质或某些物质尚未为人所知。尽本发明人所知，通式(I)的化合物迄今尚未实用于药剂。尤其是，迄今尚未将通式(I)的化合物作为药物用于调节减数分裂。
影响减数分裂的可能性有数个。根据本发明中一个优选的实施方案，通式(I)的化合物被用于刺激减数分裂。根据本发明中另一个优选的实施方案，通式(I)的化合物用于刺激人体内减数分裂。因此，通式(I)的化合物有希望作为新型的生育力调节剂而不会像迄今所用的基于雌激素和/或促孕激素的激素类避孕药物那样对体细胞产生副作用。若用作雌性的避孕药物，可施用诱发减数分裂的物质以便在排卵的促性腺激素出现的高峰之前，当其尚处于增长的卵泡中时过早地诱发卵母细胞内恢复减数分裂。对于妇女，减数分裂的恢复可以，例如，在前次月经停止一周后被诱发。排卵时，生成的过于成熟的卵母细胞最可能不被受精。正常的月经周期不可能受影响。就此而论，值得注意的是，在培养的人体粒膜细胞(卵泡的体细胞)内生物合成孕酮不会因诱发减数分裂的物质存在而受影响；而迄今所用的激素避孕药物中雌激素和促孕激素确实对生物合成孕酮有不利效果。
根据本发明的另一方面，通式(I)的诱发减数分裂的物质可用于治疗包括妇女在内的雌性的某些不育症，即通过对由于自身生成的MIS不足而不能形成成熟卵母细胞的雌性施用该物质。还有，当进行体外受精时，可获得更好的效果，此时是将通式(I)的诱发减数分裂物质加入到保存卵母细胞的培养基中。
还有，包括男人在内的雄性的不育症是由于自身生成的诱发减数分裂的物质不足而引起的，可以施用通式(I)的诱发减数分裂物质而得以缓解。
含式(I)的化合物的组合物的给药途径可以是任何途径，只要能有效地将活性化合物送达其作用点上即可。
因此，当要将本发明的化合物施用给哺乳动物时，适宜的方法是以药物组合物的形式提供，该组合物含有至少一种式(I)的化合物和药物上可接受的载体。用于口服时，这种组合物以胶囊或药片的形式是优选的。
从上述可知，所要求的给药方案将依赖于治疗的条件。因此，若用于治疗不育症，给药可以只需一次，或一定的时间，例如直到得以怀孕。用作避孕药物时，通式(I)的诱发减数分裂的物质或者是连续用药或周期性用药。用作妇女的避孕药而不连续用药时，则针对月经周期确定服药时间将是重要的。
药物组合物中可含有载体，稀释剂，吸收增强剂，防腐剂，缓冲剂，用于调节渗透压的试剂，药片崩解剂及其它本领域中常规使用的成分。固态载体例如有碳酸镁，硬脂酸镁，葡聚糖，乳糖，蔗糖，滑石粉，明胶，果胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，低熔点蜡和可可脂。
液态组合物包括无菌溶液，悬浮液和乳液。这类液态组合物可适于注射或用于来自体内和体外受精方面。液态组合物中所含有其它本领域中常规使用的成分，其中有些已在上面列举出了。
还有，经皮给药用的本发明化合物可以补片的方式提供；鼻腔给药用的组合物以液态或粉状喷鼻剂的方式提供。
所用本发明的化合物的剂量将遵医嘱，且尤其是取决于所用的特定化合物、给药途径以及用药的目的。
式(I)的优选化合物如下胆甾-7-烯-3β-醇；4-甲基胆甾-7-烯-3β-醇；4-乙基胆甾-7-烯-3β-醇；4，4-二甲基胆甾-7-烯-3β-醇；4α-甲基-4β-乙基胆甾-7-烯-3β-醇；4α-乙基-4β-甲基胆甾-7-烯-3β-醇；4，4-二乙基胆甾-7-烯-3β-醇；4-丙基胆甾-7-烯-3β-醇；4-丁基胆甾-7-烯-3β-醇；4-异丁基胆甾-7-烯-3β-醇；4，4-四亚甲基胆甾-7-烯-3β-醇；4，4-五亚甲基胆甾-7-烯-3β-醇；胆甾-8-烯-3β-醇；4-甲基胆甾-8-烯-3β-醇；4-乙基胆甾-8-烯-3β-醇；4，4-二甲基胆甾-8-烯-3β-醇；
4α-甲基-4β-乙基胆甾-8-烯-3β-醇；4α-乙基-4β-甲基胆甾-8-烯-3β-醇；4，4-二乙基胆甾-8-烯-3β-醇；4-丙基胆甾-8-烯-3β-醇；4-丁基胆甾-8-烯-3β-醇；4-异丁基胆甾-8-烯-3β-醇；4，4-四亚甲基胆甾-8-烯-3β-醇；4，4-五亚甲基胆甾-8-烯-3β-醇；胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4-甲基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4-乙基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4，4-二甲基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4α-甲基-4β-乙基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4α-乙基-4β-甲基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4，4-二乙基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4-丙基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4-丁基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4-异丁基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4，4-四亚甲基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；4，4-五亚甲基胆甾-8(14)-烯-3β-醇；胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4-甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4-乙基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4，4-二甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4α-甲基-4β-乙基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4α-乙基-4β-甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4，4-二乙基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4-丙烯胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4-丁基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4-异丁基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；
4，4-四亚甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；4，4-五亚甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇；胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4-甲基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4-乙基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4，4-二甲基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4α-甲基-4β-乙基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4α-乙基-4β-甲基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4，4-二乙基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4-丙基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4-丁基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4-异丁基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4，4-四亚甲基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；4，4-五亚甲基胆甾-8，24-二烯-3β-醇；胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4-甲基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4-乙基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4，4-二甲基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4α-甲基-4β-乙基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4α-乙基-4β-甲基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4，4-二乙基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4-丙基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4-丁基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4-异丁基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4，4-四亚甲基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；及4，4-五亚甲基胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；及其酯和醚。
优选的式(I)的酯是那些酯，即其中R10为羧酸的酰基，该酰基可以是支链的或无支链的或环形的且可含有任意取代的氨基和/或1或2个除酯基的羰基氧之外的氧原子，从而将R10连接到甾醇骨架上。当R10表示一个酰基时，它优选包括1到20个碳原子，更优选1到12个碳原子，甚至更优选1到10个碳原子，还甚至更优选1到7个碳原子。R10由其衍生的酸可以是二元羧酸。R10的实例有乙酰基，苯甲酰基，新戊酰基，丁酰基，烟酰基，异烟酰基，琥珀一酰基，戊一酰基，羟基丁一酰基，邻苯一甲酰基，丁基氨基甲酰基，苯基氨基甲酰基，丁氧基羰基，叔丁氧基羰基，乙氧基羰基，4-二甲基氨基甲基苯甲酰基，4-二乙基氨甲基苯甲酰基，4-二丙基氨基甲基苯甲酰基，4-(吗啉代甲基)-苯甲酰基，4-(4-甲基-1-哌嗪基甲基)-苯甲酰基，3-二甲基氨基-甲基-苯甲酰基，3-二乙基氨基甲基苯甲酰基，3-二丙基氨甲基苯甲酰基，3-(吗啉代甲基)苯甲酰基，3-(4-甲基-1-哌嗪基甲基)苯甲酰基，磺基(此时(I)表示其硫酸酯或盐)或膦酰基(此时(I)表示其磷酸酯或盐)。
优选的式(I)的醚是那些其中R10为甲基、甲氧基甲基，苯甲基或新戊酰氧基甲基的醚。
根据本发明的天然生成的化合物可由已知的方法从天然原料获得。或者，它们可以象结构上类似的本发明的合成甾醇那样由已知的方法合成而得。
本发明通过下列实施例而得以进一步地阐述，然而，不能认为是限定保护范围。前述公开的及下列实施例中的细节可能既独立地又有点联系地成为以不同方式实现本发明的材料。
实施例实施例1分离，纯化和鉴定从公牛睾丸得到的诱发减数分裂的物质(MIS)将一头六岁的公牛(Danish Landrace)宰杀后立即取出其睾丸。除去表层白膜将睾丸组织置于干冰上于-80℃下保存。将冻结的睾丸组织(92g)切成小于1mm3的碎片并于暗处冻干直至完全干燥，约需90h。该冻干的组织用400ml正庚烷(Lichrosolv，Merck4390，Germany)于氮气下在20℃时搅拌24h进行抽提。将悬浮液过滤，而固态物质按同样的方法再提取一次。汇集有机相于旋转式蒸发器中在室温下蒸发至干，得到981mg提取物。将该提取物溶于正庚烷后分成15份放入小玻璃瓶中，蒸发掉正庚烷。小瓶在氮气保护下贮存于4℃的暗处。
采用三步HPLC法纯化提取物第一步，将一个小瓶中的物质溶于50μl 50％(V/V)四氢呋喃(THF)的水溶液并加到反相HPLC柱(LiChroSpher 100 RP-8endcapped 5μm，250×4mm i.d.，Merck)。在40℃下用线性梯度THF从50％到100％于15min(流速1ml/min)内进行洗脱。收集1ml的18个级分并测试MIS-活性。
第二步，将从第一步中获得的、在卵母细胞检测中测得有活性的级分溶于50-100μl 70％THF中，加入类似于第一步中所用的柱中。在40℃下用线性梯度THF从60％到78％于16min(流速1ml/min)内进行洗脱。收集1ml的8个级分并测试MIS-活性。
第三步，将从第二步中获得的、在卵母细胞检测中测得有活性的级分溶于100μl正庚烷2-丙醇(98∶2)(V/V)的混合液中，加到半制备HPLC柱(Chromspher Si 5μm，250×10mmi.d.，Chrompack)。在室温下用由正庚烷2-丙醇，98∶2(V/V)组成的流动相(流速5ml/min)进行洗脱。收集2.5ml的5种级分并测试MIS-活性。
在所有这三步中，洗脱通过220mm处的UV-检测而进行控制。
通过上述三步纯化步骤的原料用核磁共振光谱(NMR)和质谱法来研究其活性化合物的分子结构。
为进行NMR光谱分析，约1mg纯化过的材料溶于0.6ml的氘代氯仿。将一个13C质子去耦NMR光谱，一个1H NMR光谱(有或无增溶)及一个2D TOCSY光谱用装有具有梯度盘管的反向宽谱带5mm探头的Bruker AMX2 400NMR光谱计记录下来。分离的MIS其13C-NMR化学位移(以ppm表示(δ))列于表1，与酵母甾醇(Taylor，U.F.et.al.J.Lipid Res.22(1981)171)及羊毛甾醇(Emmons，G.T.et.al.Magn.Res.Chem.27(1989)1012)的相应数据作比较。
表1
质谱分析是用VG Trio 1000LC/MS仪进行的，它带有LINC粒子束接口及LAB-BASE 2.1软件(Fisons Instruments)与包括ChromSpher Si，3μm，100×4.6mm柱(Chrompack)的HPLC系统。HPLC操作是在室温下及用正庚烷2-丙醇，98∶2(V/V)作流动相(流速0.6ml/min)而进行的。将待注射的MIS样品溶解于正庚烷中。质谱仪在电子碰撞方式操作。结果列于表2，其中离析的产物的相对峰高是参照Ref.1的4，4-二甲基酵母甾醇的数据。Ref.2中的“+”表示对应的峰也在本研究中报道了。Ref.1或2中的“-”表示对应的峰未在这些研究中报道过。 表2
SC＝侧链，C2H3＝位置16和17，C3H6＝位置15，16和17。
Ref.1Baloch et al.Phytochemistry 23(1984)2219。
Ref.2Morimoto et al.Liebigs Ann.Chem.708(1967)230。
基于13C-NMR光谱及其质谱(MS)法测定的分子量为412，认为从公牛睾丸中分离出来的MIS的结构为4，4-二甲基-5α-胆甾-8，24-二烯-3β-醇，也可称为4，4-二甲基酵母甾醇(DMZ)。将从第三步HPLC纯化步骤得到的MIS活性物质的各个碳原子的化学位移与结构上非常相似的化合物羊毛甾醇和酵母甾醇的化学位移作了对比。观察到的质子化学位移，耦合常数及TOCSY关系充分证明所分离的化合物就是4，4-二甲基酵母甾醇。
实施例2分离、纯化及鉴定从人体卵泡液中得到的诱发减数分裂的物质(MIS)。
人体卵泡液(FF)是从收集的卵母细胞中抽出的，可在体外受精治疗不育症时收集卵母细胞。将卵泡液冻干并用正庚烷提取。提取物用实施例1中所述方法进行纯化。活性峰的化合物有一个M/Z＝410的分子离子且质谱显示FF-MIS分子的化学结构是4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇。
方法质谱分析进行的条件是用VG Trio 1000 LC/MS仪，它带有LINC粒子束接口及LAB-BASE 2-1软件(Fisons Instruments)连接到纯相HPLC系统，后者由一个ChromSpher Si，3μm，100×4mmi.d.柱(Chrompack)和正庚烷2-丙醇∶甲醇∶氨(68∶30∶2∶0.2)作流动相(流速0.5ml/min)组成，在室温下测定。将待注入的试样溶于正庚烷。质谱仪以电子碰撞方式进行操作。结果如表3所示。
表3
葡萄糖 15g琼脂 20g去离子水 1000ml在121℃下高压灭菌20分钟之前，将pH调至5.8。
YE培养基酵母提取物，Difco10g去离子水 1000ml于121℃下高压灭菌20min。
ZYM培养基酵母提取物，Difco20g胨，Bacto10g自来水 1000ml在121℃高压灭菌20分钟之前，将pH调至6.5-6.6。葡萄糖(高压灭菌后单独加) 60g两性霉素B溶液1mg Fungizone(50mg两性霉素B的冻干块状物，41mg脱氧胆酸钠及20.2mg Squibb的磷酸钠)溶于1ml去离子水中。
步骤B把步骤A中培养的细胞悬浮于10ml水中，加入10ml 40％KOH的甲醇溶液。将该混合物加热回流4小时，然后在室温下放置过夜，再用20ml正庚烷提取2次。合并的提取液用10％氯化钠溶液洗涤，然后用水洗至中性(洗5次)接着干燥。蒸发掉溶剂留下40mg的粗甾醇。
步骤C将步骤B中得到的粗甾醇溶于1ml的正庚烷/2-丙醇(98∶2)中，然后在涡动混合器中摇动，再在5000rpm下离心分离10min，接着进行HPLC分析柱子LiChroSorb DIOL 10μm，250×4mm i.d.(Merck)洗脱液正庚烷/2-丙醇(98∶2)流速1-1ml/min，20℃测定220mm处的UV
洗脱数次，收集6.8min后的最大流出物。将收集的级分汇集，蒸发掉溶剂后的残余物接受质谱分析，并进行卵母细胞测试。
表4中报道的质谱数据与tbe National Bureau of Standards library中记录的4β-甲基酵母甾醇的质谱数据一致。
表4
SC＝侧链实施例44，4-二甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇的制备按照Schroepfer et al.报导的方法制备该化合物Chemistry andPhysics of Lipids 47(1988)187，并证实物理常数如文献中报道的那样。
实施例54，4-二甲基胆甾-8-烯-3β-醇的制备步骤A将2.48g 4，4-二甲基胆甾-8，14-二烯-3β-醇(实施例4)在0℃下溶于20ml吡啶。加入1.7g苯甲酰氯、该混合物在室温下搅拌过夜。然后蒸发至干，加入25ml甲苯。在标准含水处理、蒸发并用丙酮研制后，得2.3g(74％)晶状苯甲酸酯。
1H-NMR光谱(CDCl3，δ)表明其特征信号在8.1(d，2H)；7.55(t，1H)；7.4(t，2H)；5.4(S，宽，1H)；4.2(dd，1H)。
步骤B2.04g 3-苯甲酰氧基-4，4-二甲基胆甾-8，14-二烯(步骤A)溶于50ml THF，在0℃下滴加360ml 1M甲硼烷的THF溶液。该混合物在室温下搅拌过夜，冷却至0℃，滴加140ml水，接着加入360ml10％氢氧化钠及378ml30％过氧化氢。搅拌90分钟后，将100ml乙醚加入该混合液中，并用乙醚萃取水相两次。合并的有机相先用亚硫酸氢钠溶液洗两次，再用水洗。蒸发后，产物用色谱法纯化，SiO2色谱柱(2％乙醚的甲苯溶液)，得0.62g 3-苯甲酰氧基-4，4-二甲基胆甾-8-烯-15-醇。
MS(分子离子)534.41H-NMR光谱(CDCl3，δ)表明其特征信号位于8.0(d，2H)；7.5(t，1H)；7.4(t，2H)；4.75(m，1H)；4-1(m，1H)。
步骤C将0.54g 3-苯甲酰氧基-4，4-二甲基胆甾-8-烯-15-醇在0℃下溶于2.7ml吡啶，然后小心地加入33mg二甲基氨基吡啶及287mg氯硫代甲酸苯酯。将该混合液在室温下搅拌20小时。加入25ml乙醚之后，用饱和硫酸铜溶液、水洗涤该混合物6次，用10％氢氧化钠、水和盐水洗2次，蒸发得0.68g粗3-苯甲酰基-4，4-二甲基胆甾-8-烯-15-苯基硫代碳酸酯，将其溶于20ml甲苯后进一步精制，用370mg三丁基氢化锡和20mg偶氮二异丁腈处理。将该混合物在90℃下加热20分钟，然后再重复同样的处理过程。蒸发后，混合物用SiO2上(庚烷/二氯甲烷70/30)的色谱初步纯化，得150mg粗3-苯甲酰氧基-4，4-二甲基胆甾-8-烯，它掺杂有相应的8，14-二烯(步骤A)。
步骤D将步骤C中制得的150mg混合物溶于2ml二氯甲烷，冷却至0℃。滴加0.7ml二异丁基氢化铝，15分钟后，小心地加入0.15ml水。然后，加入25ml乙醚，有机相用酒石酸钾钠饱和溶液、水和盐水洗涤两次，然后蒸发得130mg混合物。将其在AgNO3/SiO2(按照Chem.& Phys.ofLipids 63(1992)115中所述方法制备)上进行色谱分离，并用甲苯洗脱。用乙醚/甲醇进行重结晶得49mg的标题化合物。
熔点154-155℃。
MS(分子离子)414.4。
13C-NMR谱(CDCl3，100.6MHz)显示特征信号位于78.49(C3)；127.49(C8)；135.35(C9)。
实施例63-乙酰氧基-4，4-二甲基胆甾-8，14-二烯的制备将1.3g 4，4-二甲基胆甾-8，14-二烯-3-醇(Schroepfer etal.Chemistry and Physics of Lipids 47(1988)187)溶于7.5ml吡啶及7.5ml乙酸酐并在22℃下搅拌过夜。将混合物真空蒸发，用甲苯反萃取2次，并在SiO2(甲苯)上进行急骤色谱分离而纯化。将最先的300ml洗脱液蒸发，产物从乙醚中结晶得140mg 3-乙酰氧基-8，14-二甲基胆甾二烯。
熔点120-125℃(有分解)。
MS(分子离子)454.41H-NMR谱(CDCl3，δ)显示特征信号位于5.4(S，宽，1H)；4.5(dd，1H)；2.0(S，3H)。
实施例7胆甾-8，14-二烯-3β-醇的制备将770mg脱氢胆甾醇溶于2.7ml苯、19ml乙醇和2.7ml浓盐酸的混合液，然后在回流温度下加热3小时。将混合物在冰浴中冷却而得第一批晶状产物110mg。蒸发滤液至干并用乙醚/甲醇结晶得第二批晶状产物220mg。合并两次产物，在AgNO2/SiO2(按实施例5，步骤D中所述方法制备)上进行色谱分离并用2.5％丙酮的甲苯溶液洗脱，得94mg纯的胆甾-8，14-二烯-3β-醇。
熔点113-114.5℃MS(分子离子)384.4产物的1H-NMR谱(CDCl3，δ)显示特征信号位于5.35(S，宽，1H)；3.6(m，1H)。
13C-NMR谱(CDCl3，50.3MHz)显示特征信号位于70.99(C3)；117.42(C15)；123.1(C8)；140.8(C9)；151.1(C14)。
实施例84，4-四亚甲基胆甾-8，14-二烯-3-醇的制备步骤A将1.15g脱氢胆甾醇溶于15ml 2-丁酮，加入0.34g异丙醇铝，再将混合物在回流温度下加热75分钟。在冰浴上冷却后，加入15ml 2N盐酸，发生相分离，有机相用7.5ml 2N盐酸洗2次。而水相则用甲苯萃取，合并后的有机相用水和盐水洗涤，干燥，蒸发得1.18g粗的粘稠油状胆甾-5，7-二烯-3-酮。
1H-NMR谱显示特征信号位于5.8(S，1H)；5.2(m，1H)；3.2(d，1H)；2.7(dd，1H)。
步骤B0.67g叔丁醇钾在45℃下溶于16ml叔丁醇，加入0.57g胆甾-5，7-二烯-3-酮，将混合物搅拌10分钟。加入0.47g l，4-二碘丁烷，搅拌混合物30分钟。蒸发掉溶剂，残余物溶于甲苯和水，加入少量盐水引发相分离。有机相用水洗4次，合并后的水相用甲苯萃取1次。合并后的甲苯萃取液干燥并蒸发得0.45g泡沫体，后者从乙醚/甲醇中结晶得0.35g晶状4，4-四亚甲基胆甾-5，7-二烯-3-酮。
MS(分子离子)436.41H-NMR谱(CDCl3，δ)显示特征信号位于5.75(α，1H)；5.5(m，1H)。
步骤C130mg LiAlH4悬浮于6ml THF，在30分钟内滴加1.97g 4，4-四亚甲基胆甾-5，7-二烯-3-酮的40ml THF溶液，滴加完毕15分钟后，仍留下一些未反应的起始原料(TLC)，接着又加入65mgLiAlH4。搅拌30分钟后完成反应，再滴加0.9ml水溶于5ml THF的溶液。搅拌30分钟后，加入过量的硫酸镁，再搅拌混合物30分钟。接着过滤并蒸发至干。残余物溶于25ml乙醚和25ml甲醇，然后小心地抽真空除去乙醚。搅拌过夜后，过滤分离出1.75g晶状4，4-四亚甲基-胆甾-5，7-二烯-3-醇。
MS(分子离子)438.41H-NMR谱显示特征信号位于5.8(d，1H)；5.5(m，1H)；3.5(m，1H)。
步骤D步骤C中制备的化合物770mg溶于2.38ml苯、17.5ml乙醇及2.38ml浓盐酸的混合液中。并在回流下加热16小时，然后真空蒸发。残余物溶于5ml甲苯，过滤，在AgNO3/SiO3的中压柱(庚烷甲苯，10∶90)中进行色谱分离，得35mg的4，4-四亚甲基-胆甾-8，14-二烯-3-醇。
MS(分子离子)438.41H-NMR谱(CDCl3，δ)显示特征信号位于5.35(S，宽，1H)；3.3(d，d，1H)。
13C-NMR谱(CDCl3，100.6MHz)显示特征信号位于79.0(C3)；117.4(C15)；122.9(C8)；141.3(C9)；151.1(C14)。
实施例94.4-二甲基胆甾-8(14)-烯-38-醇的制备将580mg 4，4-二甲基胆甾-8-烯-3β-醇溶于20ml乙醚和20ml乙酸。加入60mg 10％Pd/C催化剂，该混合物在3.5atm的氢气中搅拌过夜。除去催化剂，将滤液浓缩至10ml，则开始结晶。加入10ml甲醇，16小时后收集结晶。从甲醇中重结晶得230mg物质，1H-和13C-NMR显示该物质是8(9)和8(14)-异构体的混合物。
将该混合物重新溶于10ml乙醚和10ml乙酸。加入75mg 5％Pt/C催化剂。混合物在常压下用氢气处理过夜。除去催化剂，蒸发掉溶剂，接着用5ml甲醇将晶状残余物研制而得190mg纯的4，4-二甲基胆甾-8(14)-烯-3β-醇。
MS(分子离子)414.413C-NMR谱(CDCl3，100.6MHz)显示特征信号位于79.24(C3)；126.11(C8)；142.20(C14)。
实施例10
在卵母细胞试验中测试诱发减数分裂的物质动物将雌性幼鼠(B6D2-F1，strain C57B1/2J)在控制的光亮(14hr亮，10hr黑)和温度下保存，随意进食食物和水。当动物重量达13-16克(它们对应于产后20到22天的龄期)后，它们被1次注射(i.p.)约含20IU FSH和20IU LH的人体绝经的促性腺激素(Humegon，Organon，The Netherlands) (Ziebe，S.et.al.Hum.Reprod.8(1993)385-88)。48小时后用颈离位方式杀死动物。
收集与培养卵母细胞取出卵巢，置于HX-培养基(见下文)中，并脱除外部组织。采集和培养培养基由Eagles极限必需培养基(Flow，USA)组成，它含有4mM 6-羟基嘌呤，3mg/ml的牛血清白蛋白，0.23mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，100U/ml的青霉素，以及100μg/ml的链霉素(all Sigma，USA)。该培养基被称为HX-培养基。不含HX的相同培养基用作对照培养基。
在解剖显微镜下用27号针头将卵巢的窦卵泡刺穿。选择大小一致的丘封卵母细胞(CEO)，用新鲜的HX-培养基洗3次。
剥除了丘细胞的卵母细胞，即剥露卵母细胞，DO，是用一支细径口径-控制的吸管轻轻地冲洗CEO而获得的。CEO和DO培养于含0.5ml HX-培养基的4孔多皿(multidishes)(Nunclon，Denmark)中，对照的除外，它们培养于对照培养基中。每个孔含35到50个卵母细胞。待测的培养基是由不同浓度的待测化合物制备的，如表5所示。
培养进行的条件是37℃和100％温度及含5％CO2的空气气氛。培养时间是24小时。
测定卵母细胞在培养末期，有胚囊(GV)的和胚囊破裂(GVBD)及那些有极体(PB)的卵母细胞数是在带有差示干涉对比设备的倒置显微镜下计数得到的。计算每批卵母细胞中有GVBD的卵母细胞的百分数以及每批GVBD中有PB的卵母细胞的百分数。DO和CEO的结果，是以MIS活性单位形式计算的，都列于表5中。MIS活性的一个单位定义为
而MIS活性单位的数目按下式计算
表5
实施例11测定性腺试验中的诱发减数分裂的物质性腺试验基本上按Byskov，A.G.et al. Mol.Reprod.Dev.34(1993)47-52中所述方法进行。表6中给出的结果按Westergaard，L.et.al.Fertil.Steril.41(1984)377-84中所述作了半定量的评述。
表6
实施例12单(5α-胆甾-8，14-二烯)-3β-琥珀酸酯的制备将0.50g 5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇溶于10ml THF，接着加入0.39g琥珀酸酐及16mg4-二甲基氨基吡啶。将该溶液回流下加热过夜，然后蒸发至干。残余物悬浮于10ml水，滤出沉淀物，以水洗涤，干燥得0.48g标题化合物，可将其进一步精制，即将其溶于碳酸氢钠水溶液和乙醇的混合液中，加盐酸至pH2，接着浓缩溶液而得沉淀。
熔点128-131℃MS(分子离子)484.4产物的1H-NMR谱(CDCl3，δ)表明特征信号位于5.36(S，1H)；4.75(m，1H)；2.67(m，2H)；2.6(m，2H)。
13C-NMR谱(CDCl3，100.6MHz)显示特征信号位于73.4；117.1；122.7；140.0；150.5；171.2；177.2。
实施例13
3β-乙氧基羰氧基-5α-胆甾-8，14-二烯的制备将0.50g5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇溶于5ml甲苯和5ml吡啶的混合物，同时在冰浴上冷却。在5分钟内加入2.3ml氯甲酸乙酯溶于5ml甲苯的溶液。30分钟后，移去冰浴并在室温下继续搅拌20小时，然后在60℃下搅拌2小时。在真空中将反应混合物蒸发至干并用10ml乙醇研制，得0.505g标题化合物，它可用乙醇重结晶而得以进一步纯化。
熔点101-106℃MS(分子离子)456.3产物的1H-NMR谱(CDCl3，δ)显示特征信号位于5.30(S，1H)；4.50(m，1H)；4.12(q，2H)；l.24(t，3H)。
13C-NMR谱(CDCl3，100.6MHz)显示特征信号位于62.6；116.6；122.2；139.4；150.0；153.6。
实施例143β-膦酰基氧代-4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14-二烯的制备2.00g 4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇溶于10ml吡啶后，在冰浴中冷却下，于5分钟内加入到1.66ml磷酰氯的10ml无水丙酮溶液中。在室温下搅拌30分钟后，滤出沉淀并以无水丙酮洗涤。残余物悬浮于70ml水，接着在回流下加热1.25小时。冷却至室温后，滤出沉淀，以水洗涤并干燥得0.93g粗产品。取0.70g粗产品溶于75ml0.1M氢氧化钾水溶液中，然后将溶液经10g Amberlite树脂IR-120(H)中过滤，接着真空蒸发至干。残余物以10ml水研制，滤出沉淀，以水洗涤后干燥，得0.48g标题化合物。
熔点183-185℃。
产物的1H-NMR谱(CDCl3＋2滴CD3OD)显示特征信号位于5.36(S，1H)；3.89(m，1H)。
产物的13C-NMR谱(CDCl3＋2滴CD3OD，100.6MHz)显示特征信号位于85.1；116.9；122.3；140.9；150.5。
实施例153β-异烟酰-5α-胆甾-8，14-二烯的制备将0.50 5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇溶于5ml吡啶，接着加入1.16g异烟酰氯盐酸盐。该悬浮液在回流下加热过夜，然后蒸发至干。将残余物悬浮于100ml水，同时在冰浴中冷却。滤出沉淀并以水洗涤。干燥后得0.97g粗产品，将其用丙酮/水进行重结晶得0.40g标题化合物。
熔点129-131℃。
产物的1H-NMR谱(CDCl3，δ)显示特征信号位于8.77(d，2H)；7.84(d，2H)；5.39(S，1H)；4.49(m，1H)。
13C-NMR谱(CDCl3，50.3MHz)显示特征信号位于75.0；117.7；122.8；123.3；138.0；140.3；150.5；150.9；164.6。
权利要求
1.一种通式(I)的化合物 其中R1和R2独立地选自氢、可以被卤素或羟基取代的无支链的或支链的C1-C6烷基，或者，其中R1和R2与其所连接的碳原子一起构成环戊烷环或环己烷环；R3和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键，这种情况中R5是氢而R6和R7或者为氢或者一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加双键；或者R5和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键，这种情况中R3是氢而R6和R7或者为氢或者一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键；或者R6和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键，这种情况中R3，R5和R7都是氢；R8和R9是氢或一起表示在其所连接的碳原子之间的一个外加键；且R10或为氢，或为包括磺酰基、膦酰基在内的酰基，或为与该分子其余部分一起构成一种醚的基团。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1是氢或甲基。
3.根据权利要求1的化合物，其中R1选自乙基和无支链的及支链的C3-C6烷基。
4.根据权利要求1的化合物，其中R1是具有多到6个碳原子的无支链的或支链的羟烷基。
5.根据权利要求1的化合物，其中R1是具有多到6个碳原子的无支链的或支链的α-羟烷基。
6.根据权利要求1的化合物，其中R1是被卤素取代的无支链的或支链的烷基。
7.根据权利要求1的化合物，其中R1是三氟甲基。
8.根据权利要求1的化合物，其中R2是氢或甲基。
9.根据权利要求1的化合物，其中R2选自乙基和无支链的及支链的C3-C6烷基。
10.根据权利要求1的化合物，其中R2是具有多到6个碳原子的无支链的或支链的羟烷基。
11.根据权利要求1的化合物，其中R2是具有多到6个碳原子的无支链的或支链的α-羟烷基。
12.根据权利要求1的化合物，其中R2是被卤素取代的无支链的或支链的烷基。
13.根据权利要求1的化合物，其中R2是三氟甲基。
14.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2与其所连接的碳原子一起构成一个环戊烷环。
15.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2与其所连接的碳原子一起构成一个环己烷环。
16.根据权利要求1的化合物，其中R3和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一外加键且R3是氢。
17.根据权利要求1的化合物，其中R5和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一外加键且R3是氢。
18.根据权利要求1的化合物，其中R6和R4一起表示在其所连接的碳原子之间的一外加键且R3，R5和R7都是氢。
19.根据权利要求1的化合物，其中R6和R7都是氢。
20.根据权利要求1的化合物，其中R6和R7一起表示在其所连接的碳原子之间的一外加键。
21-根据权利要求1的化合物，其中R8和R9都是氢。
22.根据权利要求1的化合物，其中R8和R9一起表示在其所连接的碳原子之间的一外加键。
23.根据权利要求1的化合物，其中R10是氢。
24.根据权利要求1的化合物，其中R10是从含有1到20个碳原子的酸衍生的酰基。
25.根据权利要求24的化合物，其中R10是选自乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、丁酰基、烟酰基、异烟酰基、琥珀一酰基、戊一酰基、丁基氨基甲酰基、苯基氨基甲酰基、丁氧基羰基、叔丁氧基羰基及乙氧基羰基的酰基。
26.根据权利要求1的化合物，其中R10是烷基，芳烷基，烷氧基烷基，链烷酰氧基烷基，每个基团的碳原子总数高达10个，优选高达8个，它与该分子的其余部分构成一种醚。
27.根据权利要求26的化合物，其中R10是甲氧基甲基或新戊酰氧基甲基。
28.根据权利要求1的化合物，其中R10是磺基。
29.根据权利要求1的化合物，其中R10是膦酰基。
30.权利要求1到29的任一项所描述的通式(I)的化合物用作药物。
31.权利要求1到29的任一项所描述的通式(I)的化合物用于调节减数分裂。
32.调节哺乳动物生殖细胞中的减数分裂的方法，它包括把有效量的根据权利要求1到29任一项的化合物施用给需要这种治疗的生殖细胞。
33.根据权利要求32的方法，其中通过把根据权利要求1到29的任一项的化合物施用给有所述细胞的哺乳动物而将其施用给生殖细胞。
34.根据权利要求32或33的方法，其中待调节减数分裂的生殖细胞是卵母细胞。
35.根据权利要求32的方法，其中根据权利要求1到27的任一项的化合物被施用给来自体内的卵母细胞。
36.根据权利要求33的方法，其中待调节减数分裂的生殖细胞是精子。
全文摘要
可从公牛睾丸和人体卵泡液中提取的某些甾醇及化学上相似的甾醇可被用于调节卵母细胞和雄性生殖细胞中的减数分裂。
文档编号A61P15/08GK1151164SQ9519373
公开日1997年6月4日 申请日期1995年6月23日 优先权日1994年6月23日
发明者A·G·比斯克夫, C·Y·安德森, L·诺德霍尔姆, H·索格森, O·瓦斯曼, I·V·荻尔斯, E·古达尔 申请人:诺沃挪第克公司