一种植物减数分裂相关蛋白GmPRD1及其编码基因和应用

本发明涉及植物基因工程，尤其涉及一种植物减数分裂相关蛋白gmprd1及其编码基因和应用。

背景技术：

1、减数分裂是指有性生殖的个体在形成生殖细胞过程中发生的一种特殊分裂方式，是真核生物有性生殖过程中配子形成所必需的过程。该过程主要包括dna复制、姐妹染色单体黏连、同源染色体配对、联会、重组和分离等一系列重要的生物学事件。其中，同源染色体重组是发生在减数分裂前期i的重要事件，它不仅为物种的遗传变异和进化提供了基础，而且重组过程中产生的交叉结为同源染色体提供了直接的物理连结，保证了同源染色体的正确分离。因此，同源染色体重组是确保真核生物染色体正确分离和产生遗传多样性的关键步骤。

2、近年来，随着水稻无融合生殖研究取得重大进展，使其在农作物杂种优势育种中的应用提供了可能。二倍配子体无融合生殖(diploid gametophyte apomixis)是指经过类似有丝分裂的异常减数分裂和没有精卵细胞融合而产生胚或种子的特殊生殖方式，后代基因型与母本保持一致，在杂种优势的固定中具有重要作用。而类似有丝分裂的减数分裂则需要3个过程的改变：①同源染色体不发生遗传重组；②第一次减数分裂后期姐妹染色单体提前分离；③跳过减数第二次分裂。以上3点是成功产生与母本遗传物质完全一致的二倍体配子的重要条件。基于以上3点，在水稻中将三个减数分裂的关键基因rec8、pair1(spo11-1)以及osd1进行基因编辑成功得到了二倍体配子，该株系称为mime。mime结合诱导单倍体的mtl基因编辑株系，成功获得了二倍体的克隆种子，该种子的基因型与亲本完全相同。

3、同源重组是由染色体上形成程序化的dna双链断裂(double strand breaks,dsbs)开始的。减数分裂同源重组起始于ii型拓扑异构酶spo11(sporulation 11)切割染色体双链dna，产生dsb的过程。在酿酒酵母中，除了spo11之外，减数分裂dsb的形成还需要9种其他蛋白质(rad50、mre11、xrs2、rec102、rec104、rec114、ski8、mer2和mei4)。

4、若能获得更多参与减数分裂过程，从而影响雌配子体正常发育的基因，将会为利用无融合生殖进行杂种优势的固定提供新的基因资源。

技术实现思路

1、本发明提供一种植物减数分裂相关蛋白gmprd1及其编码基因和应用。gmprd1基因的突变会影响大豆减数分裂过程从而导致雌雄配子发育异常。由于该基因影响dna双链的断裂，因此该基因的克隆将为大豆二倍体配子的产生和利用无融合生殖进行杂种优势的固定提供新的基因资源。

2、本发明通过筛选大豆突变体库获得了一个与减数分裂相关的突变体，经bsa测序分析获得了候选基因，将其命名为gmprd1，其cds序列如seq id no.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明提供一种蛋白gmprd1，所述大豆蛋白gmprd1具有如下任一种氨基酸序列：

4、(1)如seq id no.2所示的氨基酸序列；

5、(2)如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

6、(3)与如seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％；进一步优选为99％。上述如seq id no.2所示的氨基酸序列为大豆gmprd1蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与本发明公开的gmprd1蛋白具有相同活性的gmprd1蛋白的突变体蛋白。

7、本发明还提供一种基因gmprd1，所述基因gmprd1用于编码所述蛋白gmprd1；

8、所述基因gmprd1具有如下任一种核苷酸序列：

9、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；

10、(2)与seq id no.1所示的序列互补、同源、或经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。上述如seq id no.1所示的核苷酸序列为大豆中gmprd1蛋白的cds序列。本发明所述的gmprd1蛋白的编码基因可以为任意能够编码上述gmprd1蛋白的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

11、本发明提供一种抑制因子，所述抑制因子包括能够抑制所述蛋白gmprd1的编码基因表达的干扰rna或grna。

12、优选的，所述grna包含如seq id no.3所示的核苷酸序列。所述grna用于抑制(失活)大豆gmprd1蛋白的编码基因表达，该grna可与cas9等基因编辑工具配合作用，实现大豆gmprd1蛋白的编码基因的敲除或降低表达量。

13、本发明还提供一种生物材料，包括所述基因gmprd1或所述抑制因子。

14、优选的，所述生物材料为重组载体、表达盒、重组菌或宿主细胞中的任一种。

15、上述gmprd1基因或其编码蛋白或大豆gmprd1蛋白的抑制因子的应用可以gmprd1基因或其编码蛋白或大豆gmprd1基因的编码蛋白的抑制因子本身的形式应用，或者以含有gmprd1基因的编码蛋白或其抑制因子的表达盒、载体、含有所述表达盒或所述载体的宿主细胞的形式应用。

16、根据本发明所述蛋白gmprd1、所述基因gmprd1、所述抑制因子、或所述生物材料在以下任一项中的应用：

17、1)调控植物减数分裂中的应用；

18、2)调控植物雌配子和/或雄配子发育中的应用；

19、3)在植物中产生二倍体配子；

20、4)植物无融合生殖中的应用；

21、5)调控植物花粉发育中的应用；

22、6)植物育种中的应用。

23、其中，2)和5)中的调控为负调控。

24、本发明还提供一种调控植物减数分裂过程中dsb形成的方法，包括：调控植物中所述gmprd1蛋白的编码基因的表达量。由于发生同源重组的前提是dsb的形成，因此，可以通过基因编辑prd1基因来破坏同源染色体重组过程用于无融合生殖。由此可见，本发明克隆的gmprd1基因在大豆无融合生殖(杂种优势固定)中具有重要的应用价值。

25、根据所述调控植物减数分裂过程中dsb形成的方法，通过降低或沉默植物中所述gmprd1蛋白的编码基因的表达量，影响所述植物的减数分裂过程。

26、根据所述调控植物减数分裂过程中dsb形成的方法，上述降低植物中gmprd1蛋白的编码基因的表达量可通过本领域常规技术手段实现，例如：利用crispr/cas9技术敲除植物中gmprd1蛋白的编码基因。

27、利用crispr/cas9技术，以如seq id no.3所示的核苷酸序列为grna敲除植物中gmprd1蛋白的编码基因。利用该方法能够显著提高植物中gmprd1蛋白的编码基因的敲除效率。

28、本发明提供一种植物无融合生殖育种方法，包括利用所述调控植物减数分裂过程中dsb形成的方法。

29、根据所述应用、或所述方法，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

30、优选的，所述植物包括大豆、拟南芥、小麦、水稻、玉米、棉花和花生中的任一种。

31、本发明的有益效果：

32、本发明首次在大豆中克隆了参与大豆减数分裂过程的gmprd1基因。通过降低gmprd1基因的表达量，能够影响植物正常的减数分裂过程。gmprd1基因的克隆为大豆无融合生殖育种提供了新的基因资源，在利用大豆无融合生殖育种中具有重大的应用价值。