快速鉴定禾谷镰孢菌对Cyclobutrifluram抗药性的方法

本发明属于分子生物学,涉及一种禾谷镰孢菌琥珀酸脱氢酶b(fgsdhb)和c1(fgsdhc1)蛋白相关基因fgsdh b和fgsdh c1上核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂cyclobutrifluram抗性检测中的应用，具体涉及一种快速鉴定禾谷镰孢菌fgsdh b和fgsdhc1基因核苷酸点突变及其对cyclobutrifluram抗药性的分子检测方法及专用引物。

背景技术：

1、近年来，我国黄淮麦区包括河北、河南、安徽、山东、江苏及陕西等，由镰孢菌引起的小麦赤霉病和茎基腐病已成为小麦生产上的重大病害，严重威胁小麦产量和质量的同时还具有潜在的真菌毒素污染风险。禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)是我国北方地区小麦赤霉病的优势种群，同时也是小麦茎基腐病的优势病原菌之一。遗憾的是，目前我国尚未有登记的化学药剂用于小麦茎基腐病的防治。而生产上防治小麦赤霉病的杀菌剂主要包括苯并咪唑类杀菌剂、三唑类杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和氨基丙烯酸酯类杀菌剂等。但随着药剂的长期及不科学合理使用，导致小麦赤霉病菌对多种防治药剂产生了不同程度的抗性，并且一些杀菌剂会刺激镰孢菌毒素的合成。如在多菌灵的高选择压力下，小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株在群体中的比例不断上升，导致多菌灵对小麦赤霉病的田间防效降低。唑类杀菌剂如己唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑和戊唑醇等对小麦赤霉病都具有较好的预防和治疗效果，但低浓度的唑类杀菌剂会刺激禾谷镰孢菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)的合成。虽然qoi类杀菌剂对禾谷镰孢菌具有较好的活性，但也会促进don毒素的生物合成。而由先正达公司研发的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂cyclobutrifluram对f.graminearum具有优异的抑制活性。当前杀菌剂抗性行动委员会(fungicide resistance raction committee，frac)将其抗药性风险定为中等到高等，需要进行抗性的风险管理。本研究室通过药剂驯化的方法得到了对cyclobutrifluram产生高水平抗性的禾谷镰孢菌菌株，并且有一些高水平抗性菌株的生存适合度较高。小麦赤霉病属气传病害，其病原菌禾谷镰孢固有抗性风险水平为中到高等，综合推测赤霉病菌禾谷镰孢对cyclobutrifluram具有中到高等抗性风险。但是小麦茎基腐病属于土传病害，在该病害的防控过程中cyclobutrifluram常用于种子处理，综合推测小麦茎基腐病原菌禾谷镰孢对cyclobutrifluram有中等抗性风险。因此，未来在使用cyclobutrifluram防治植物病原真菌病害时，需要加强抗性监测，并对cyclobutrifluram的抗性发生情况进行及时的预警，从而指导cyclobutrifluram的科学使用，延缓其抗药性的产生，延长药剂的使用年限。

2、杀菌剂抗性常规检测方法包括：菌丝生长速率法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法和琼脂展布法等。但是这些方法都需要先分离并纯化获得病原菌，然后将病原菌接种到带药培养基上或者接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，一定时间之后才能调查结果。采用常规的方法，当田间抗药性菌株的频率大于1％时，才能被检测的到(如有95％的概率检测到1％频率的抗药性菌株，检测的样本量需要大于300)，因此具有灵敏度低，工作量大，试验周期长等缺点。

3、随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，限制性酶切pcr和等位特异pcr分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间提高了工作效率，而且增强了检测的灵敏度，检测频率在10-5～10-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。因此，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram抗性相关蛋白及其编码基因，以及其作为禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram抗性筛选标记，在进行禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram抗性鉴定中的应用。

2、为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明的一个目的是提供禾谷镰孢菌cyclobutrifluram抗性相关蛋白，是如下1)或2)所示的蛋白质：

4、1)由序列表中的seq id no:15/seq id no:16的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

5、2)将序列表中的seq id no:15/seq id no:16的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与cyclobutrifluram抗性功能相关的由seq idno:15/seq id no:16衍生的蛋白质。

6、seq id no:15如下所示：

7、

8、seq id no:15中，自氨基端第248位氨基酸x为h或y。

9、seq id no:16如下所示：

10、

11、

12、seq id no:16中，自氨基端第73位氨基酸x为a或v。

13、其中，所述禾谷镰孢菌cyclobutrifluram抗性相关蛋白，fgsdhb蛋白第248位氨基酸为组氨酸对cyclobutrifluram敏感型基因型，自n端起第248位氨基酸突变为酪氨酸时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。fgsdhc1蛋白第73位氨基酸为丙氨酸对cyclobutrifluram敏感型基因型，自n端起第73位氨基酸突变为缬氨酸时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。

14、在本发明的一种实施方案中，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram抗性相关蛋白(fgsdhb蛋白)的序列如seq id no:15所示，当seq id no:15的n端第248位氨基酸为组氨酸(x＝h)时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram敏感，当seq id no:15的自n端起第248位氨基酸为酪氨酸(x＝y)时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram抗性相关蛋白(fgsdhc1蛋白)的序列如seq id no:16示，当seq id no:16的n端第73位氨基酸为丙氨酸(x＝a)时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram敏感，当seq idno:16的自n端起第73位氨基酸为缬氨酸(x＝v)时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。

15、本发明还提供cyclobutrifluram抗性相关蛋白的编码基因。

16、所述编码基因的dna核苷酸序列如下1)、2)或3)所示：

17、1)序列表中seq id no:17/seq id no:18的核苷酸序列；

18、2)在严格条件下可与1)所述的dna序列重组且编码与cyclobutrifluram抗性功能相关蛋白的dna分子；

19、3)与序列表中seq id no:17/seq id no:18的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码与cyclobutrifluram抗性功能相关蛋白的dna分子。

20、seq id no:17如下所示：

21、

22、

23、seq id no:17中，自5'端起第1045位核苷酸y＝c或t。seq id no:17为禾谷镰孢菌fgsdhb蛋白编码基因(fgsdh b)，基因全长1332bp，外显子总长837bp，分别为自5’端第178-535、609-760和814-1140位核苷酸，编码278个氨基酸；包含2个内含子，内含子总长126bp，分别为自5’端第536-608和761-813位核苷酸。

24、seq id no:18如下所示：

25、

26、

27、seq id no:18中，自5'端起第428位核苷酸y＝c或t。seq id no:18为禾谷镰孢菌fgsdhc1蛋白编码基因(fgsdh c1)，基因全长747bp，外显子总长537bp，分别为自5’端第114-120、173-254和300-747位核苷酸，编码178个氨基酸，包含2个内含子，内含子总长97bp，分别为自5’端第121-172和255-299位核苷酸。

28、所述编码fgsdhb基因中，自5'端起第1045位核苷酸为c，为对cyclobutrifluram敏感的基因型。当自5'端起第1045位核苷酸为t时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。在本发明的一个实施方式中，所述编码基因如seq id no:17所示，自seq id no:17的5'端起第1045位核苷酸为c(y＝c)，为对cyclobutrifluram敏感的基因型。当自seq id no:17的5'端起第1045位核苷酸为t(y＝t)时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。

29、所述编码fgsdhc1基因中，当自5'端起第428位核苷酸为c时，为对cyclobutrifluram敏感的基因型。当自5'端起第428位核苷酸为t时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。在本发明的一个实施方式中，所述编码基因如seq id no:18所示，自seq id no:18的自5'端起第428位核苷酸为c(y＝c)，为cyclobutrifluram敏感的基因型。当自seq id no:18的5'端起第428位核苷酸为t(y＝t)时，禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram表现抗药性。

30、含有上述的编码基因的表达盒、重组表达载体或转基因重组菌也属于本发明的保护范围。

31、本发明另一个目的是提供禾谷镰孢菌琥珀酸脱氢酶蛋白或其编码基因在鉴定禾谷镰孢菌抗药性中的应用。

32、在本发明的一个实施方式中，通过检测禾谷镰孢菌fgsdhb蛋白自n端起第248位氨基酸是否由组氨酸变为酪氨酸，如果第248位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸则其对cyclobutrifluram抗性提高。通过检测禾谷镰孢菌fgsdhc1蛋白自n端起第73位氨基酸是否由丙氨酸变为缬氨酸，如果第73位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，则其对cyclobutrifluram抗性提高；其中，禾谷镰孢菌fgsdhb和fgsdhc1蛋白为上述的蛋白。

33、通过检测禾谷镰孢菌fgsdhb蛋白的编码基因自5'端起第1045位核苷酸是否为t，如果第1045位为t，则其对cyclobutrifluram抗性提高；或通过检测禾谷镰孢菌fgsdhc1蛋白的编码基因自5'端起第428位核苷酸是否为t，若自5'端起第428位核苷酸为t，则其对cyclobutrifluram抗性提高；禾谷镰孢菌fgsdhb和fgsdhc1蛋白的编码基因为所示的编码基因。

34、本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测禾谷镰孢菌中fgsdh b基因是否存在突变位点的引物组，由序列表中seq id no:5和seq id no:8所述的dna分子组成；以及一种检测或辅助检测禾谷镰孢菌中fgsdh c1基因是否存在突变位点的引物组，由序列表中seq id no:10所示的dna分子和seq id no:14所示的dna分子组成。

35、所述的引物组在鉴定禾谷镰孢菌抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性是指禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram的抗药性。

36、本发明还提供一种检测或辅助检测禾谷镰孢菌中fgsdh b和fgsdh c1基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

37、以待测禾谷镰孢菌菌株的基因组dna为模板，用seq id no:5和seq id no:8所示引物对进行pcr扩增，若seq id no:5和seq id no:8能扩增出708bp条带，则所述待测禾谷镰孢菌中fgsdh b基因存在或候选存在突变位点。或利用seq id no:10和seq id no:14所示片段组成的引物对进行pcr扩增，若seq id no:10和seq id no:14所示片段组成的引物对能扩增出518bp条带，则所述待测禾谷镰孢菌中fgsdh c1基因存在或候选存在突变位点。

38、所述pcr扩增中，seq id no:5和seq id no:8的退火温度为68.5℃，seq id no:10和seq id no:14的退火温度为69℃。

39、所述方法中，所述突变位点指禾谷镰孢菌中fgsdh b基因的自5'端起第1045位核苷酸为t，由此导致禾谷镰孢菌fgsdhb蛋白的自n端起第248位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸；或fgsdh c1基因的自5'端起第428位核苷酸为t，由此导致禾谷镰孢菌fgsdhc1蛋白的自n端起第73位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸。

40、所述方法中，突变后的禾谷镰孢菌fgsdhb蛋白如seq id no:15所示，其中，seq idno:15的自n端起第248位氨基酸为酪氨酸(x＝y)，突变后的禾谷镰孢菌fgsdh b基因如seqid no:17所示，其中，自seq id no:17的5'端起第1045位核苷酸为t(y＝t)。突变后的禾谷镰孢菌fgsdhc1蛋白如seq id no:16所示，其中，seq id no:16的自n端起第73位氨基酸为缬氨酸(x＝v)，突变后的禾谷镰孢菌fgsdh c1基因如seq id no:18所示，其中，自seq idno:18的5'端起第428位核苷酸为t(y＝c)。

41、本发明还提供上述方法在鉴定禾谷镰孢菌抗药性中的应用；所述抗药性是指禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram的抗药性。

42、具有所述突变位点的禾谷镰孢菌具有或候选具有抗药性。

43、本发明的另一个目的是提供禾谷镰孢菌中fgsdh b和fgsdh c1基因或蛋白的突变位点。

44、本发明所提供的禾谷镰孢菌中fgsdh b基因的一个突变位点，为禾谷镰孢菌fgsdhb基因的基因组序列自5'端起第1045位核苷酸为t；所提供的禾谷镰孢菌fgsdh c1基因的一个突变位点，为fgsdh c1基因的基因组序列自5'端起第428位核苷酸为t，且两种核苷酸突变位点单独存在。

45、本发明所提供的禾谷镰孢菌中琥珀酸脱氢酶蛋白的两个突变位点，为禾谷镰孢菌中fgsdhb蛋白的自n端起第248位氨基酸为酪氨酸，fgsdhc1蛋白自n端起第73位氨基酸为缬氨酸，且两种氨基酸突变单独存在。

46、所述突变位点指相对于对cyclobutrifluram敏感的基因型，禾谷镰孢菌中fgsdhb基因的自5'端起第1045位突变为t，由此导致禾谷镰孢菌fgsdhb蛋白自n端起第248位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。或禾谷镰孢菌中fgsdh c1基因的自5'端起第428位突变为t，由此导致禾谷镰孢菌fgsdhc1蛋白自n端起第73位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸。

47、上述任一所述突变位点在鉴定禾谷镰孢菌抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；上述应用中，存在所述突变位点的禾谷镰孢菌具有或候选具有抗药性。所述抗药性是指禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram的抗药性。

48、本发明提供的分子检测方法，灵敏度高、稳定性好、检测周期短，可用于高通量地监测田间禾谷镰孢菌对杀菌剂cyclobutrifluram的抗性基因频率以及抗性发生和发展情况，实现抗性病害的早期预警，指导及时调整小麦赤霉病和茎基腐病的防治策略，促进科学用药，延缓抗药性的发生和发展，并在病害的可持续管理系统中发挥重要的作用。

49、本发明提供的检测禾谷镰孢菌对cyclobutrifluram产生抗性的点突变的方法，可对抗性菌株进行高灵敏度、简单快速的分子检测，及时了解抗药性发生动态，对制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。