水稻减数分裂发育相关基因OsMFS1及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一个水稻减数分裂发育相关蛋白osmfs1及其编码基因的应用。

技术背景

水稻育性是影响水稻产量的关键因素，在开花植物中，雌雄配子生殖发育是重要的生物学过程，也是高等植物普遍经历的生长过程。在对植物生殖发育的研究中，减数分裂发育受到广泛的关注，减数分裂是进行有性繁殖的生物，创造单倍体配子的复杂的细胞分裂过程。生殖细胞分裂时，染色体只复制一次，细胞连续分裂两次，这是一种染色体数目减半的特殊分裂方式^[1]。减数分裂不仅是保证物种染色体数目稳定的机制，同时也是物种适应环境变化不断进化的机制。减数分裂机制在动物，植物和真菌中是广泛存在的，尽管在不同物种间也存在明显的差异^[2,3]。近年来随着分子生物学的发展，在水稻、拟南芥、小鼠等动植物中克隆到众多减数分裂发育相关基因，使我们更清楚地认识了减数分裂基因的功能以及它与雌雄配子形成的相互关系。

对动植物而言，顺利完成减数分裂，形成有功能的雌雄配子体，是保证物种遗传稳定和多样性的关键。减数分裂是一个复杂的过程，涉及同源染色体配对，联会和分离，大量的减数分裂蛋白被招募，共同保证这一过程顺利完成，任何的“失误”对于配子形成而言都是致命的，因此减数分裂过程为物种带来了众多创新的同时，也面临着高风险。同源染色体联会形成了完成同源重组的特殊装置联会复合体，保证了同源重组的dsb(双链断裂)顺利被修复^[4,5]。拟南芥中基因mnd1和另一个减数分裂特有蛋白hop2形成异源二聚体，在同源重组过程中扮演着辅助因子的作用^[6,7]，spo11蛋白切割双链形成dsb，随后限制性内切酶切割断裂的切口，暴露出3’单链，大量的重组蛋白rad51和dmc1被招募完成dsb的修复工作^[8,9,10]，mnd1/hop2复合体参与到链入侵反应，主要功能是寻找模板双链，并且激活rad51和dmc1的修复能力,保证dsb被成功修复^[11]。近些年对于mfs1的研究很多，功能比较明确，突变之后会导致完全的雌雄性不育，在同源重组过程中发挥着关键的作用^[12]。一系列的研究表明了减数分裂同源重组过程的重要性，同时似乎也反映出其是可控的，可将这一类基因进行改造，运用生物技术提高重组效率，能够在育种过程中更快的获得优良基因和优异性状，但目前仍然需要更多的研究对同源重组过程进行全面了解。

参考文献

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[12]clemens,u.,arnaud,r.,mona,v.h.,arnaud,d.m.,anddaniel,v.,etal.2013.sufficientamountsoffunctionalhop2/mnd1complexpromoteinterhomologdnarepairbutaredispensableforintersisterdnarepairduringmeiosisinarabidopsis.plantcell[j],25,4924-4940.

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一种减数分裂螺旋-螺旋蛋白osmfs1。

本发明目的之二在于提供一种水稻减数分裂发育关键基因osmfs1。

本发明目的之三在于提供减数分裂发育关键基因osmfs1的应用。

本发明的目的通过下列技术方案实现：

本发明提供一种水稻减数分裂发育关键蛋白osmfs1,其是dsb修复过程中的辅助蛋白osmfs1。在减数分裂重组过程中，dsb的修复依赖于，osmfs1和oshop2组成的复合体寻找同源模板链，促进链入侵反应，以保证dsb顺利被修复。osmfs1的蛋白大小为23.9kd,含有一个在各物种中都高度保守的结构域：coiledcoil结构域，其氨基酸序列入seqidno.2所示。

本发明还提供了一种通过ems诱变获得的水稻完全不育突变体osmfs1，其表现为花期不开花，花粉完全没有活力，胚囊完全不可育，成熟时期完全不结实。

本发明还提供一种水稻减数分裂发育关键基因osmfs1,其dna序列如seqidno.1所示。osmfs1的cds全长为624bp，包含10个外显子，9个内含子。osmfs1突变体是osmfs1基因的第九个外显子上存在一个由g到a的单碱基突变，导致蛋白翻译的提前终止。

本发明还提供对osmfs1基因及其编码的蛋白在参与减数分裂过程，尤其是花粉母细胞染色体发育和胚囊发育过程中的作用机制的探索。

本发明还提供所述蛋白osmfs1或osmfs1基因或水稻雄性不育突变体osmfs1在水稻育种工作中的应用。

本发明还提供所述蛋白osmfs1或osmfs1基因或水稻雄性不育突变体osmfs1在水稻雄性不育育种研究中的应用。具体的为，将正常野生型水稻敲除osmfs1基因，形成雄性不育的水稻。

本发明还提供所述蛋白osmfs1或osmfs1基因在小穗闭花不开水稻育种中的应用。更具体的是在染色体配对异常导致的减速分裂时期发育紊乱的水稻育种中的应用。

本发明还提供所述蛋白osmfs1或osmfs1基因在制药和化学工业中的价值。

通过对本发明所述完全不育突变体osmfs1的研究，获得减数分裂发育关键基因osmfs1。水稻减数分裂基因的发现与利用加深了对同源重组过程的认识，减数分裂的同源重组过程能够通过产生交叉(co)的方式，发生同源染色体片段的交换，必然会产生众多的变异或创新，但是在减数分裂过程中，co的数量极其有限，在未来能够利用本专利的基因，并通过协调一些其他的特异调控同源重组的基因，或许能够达到提高或者控制co产生的数量，从而能加速变异或创新的产生，大大提高育种效率，将有利于创制优异种源，提高杂交效率，来培育高产、抗逆性强和适应性广的优质水稻品种，因而在植物育种上具有重要的应用价值。

本发明所述的螺旋-螺旋蛋白osmfs1是通过和oshop2形成的异源二聚体，直接参与osrad51和osdmc1介导的单链入侵反应，决定着co和nco的形成，所以可以对其进行研究和基因改造来达到特定的生产价值。

附图说明

图1野生型和osmfs1突变体之间的形态学比较；

图2野生型和osmfs1突变体中花药发育半薄切片观察；

图3野生型和osmfs1突变体花粉的透射/扫描电镜观察；

图4野生型和osmfs1突变体胚囊发育染色观察；

图5野生型和osmfs1突变体花粉母细胞染色体pi染色观察；

图6osmfs1的精细定位；

图7crispr-cas9敲除载体；

图8转基因敲除(crispr/cas9)表型鉴定；

图9osmfs1时空表达分析和亚细胞定位；

图10osmfs1和oshop2互作；

图11单敲除和双敲除转基因植株表型鉴定；

图12单敲除和双敲除转基因植株染色体pi染色观察；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1osmfs1突变体的表型观察和osmfs1基因的图位克隆

(1)osmfs1突变体表型鉴定

osmfs1突变体是宁粳4号通过ems诱变获得，突变体在营养生长时期和野生型没有差异，但是在生殖生长时期表现为小穗闭花不开，并且在成熟时期植株完全不结实。为了确定植株不育类型，对突变体的花粉和胚囊育性进行鉴定，通过i2-ki染色，发现突变体完全没有可育的花粉，呈现完全典败(图1，a，抽穗后野生型和mfs1突变体的植株表型；b，成熟时期野生型和osmfs1突变体的小穗；c,d，抽穗期的野生型和osmfs1的花药用碘-碘化钾(i2-ki)溶液染色)。并且对突变体植株授予野生型花粉，发现突变体仍然表现为完全不育。至此我们确定mfs1为雌雄配子全不育突变体。为了明确突变体雄性不育的原因，对花粉发育各时期的形态特征进行分析，花药发育各时期的半薄切片表明，小孢子后期，野生型花粉呈现饱满的圆形且有规则的排列在花药壁，而突变体液泡化的花粉不够饱满且排列并不规则，在成熟时期，突变体花粉完全没有淀粉填充，并且花粉形状不规则，干瘪皱缩(图2，a-c和g-i野生型花药半薄切片，d-f和j-lmfs1突变体花药半薄切片，a和d减数分裂时期，b和e小孢子发育早期，c和f空泡花粉期，g和j二孢花粉期，h和k成熟花粉期，i和l花药开裂时期，e，表皮；en，内层；ml，中层；t，绒毡层；dy，二分体细胞；msp，小孢子；bp，二孢花粉；ap，不正常花粉；mp，成熟花粉)。扫描电镜和透射电镜结果和半薄切片结果相符合，成熟的突变体花粉形态异常，干瘪且表面孢粉素不致密，完全没有淀粉粒填充，而是充斥着降解物(图3，a-c和g-h野生型花粉扫描/透射电镜，d-f和j-kmfs1突变体花粉扫描/透射电镜，a、b、d和e成熟花粉形态，c和f扫描电镜观察花粉粒表面，g、h、j和k透射电镜观察成熟花粉粒截面，i和l野生型和突变体的花药壁,c,中柱；st,淀粉粒；i,花粉内壁；f，基层；te，花粉外壁；e，表皮；en，内层；ml，中层；t，绒毡层)。我们对突变体的胚囊发育染色观察，发现突变体胚囊减数分裂时期发育异常，最终形成完全不可育的胚囊(图4，a-j,野生型胚囊发育，能观察到正常的七细胞八核的特征，k-o,突变体发育异常的胚囊)。尽管半薄切片结果显示，在花药发育的减数分裂时期突变体同野生型相比没有观察到明显的差异，但由于小孢子的异常形态，我们猜测花粉发育的早期就已经发生了败育，为了验证这个猜想，我们对花粉发育的减数分裂时期染色体发育进行了pi染色观察，我们发现在偶线期和粗线期，染色体就会观察到不能配对的染色体，而这一缺陷在终变期的时候更为明显，野生型可以精确的辨识十二个凝聚的点状染色体，但是在突变体中染色体数量却远远多于十二个，这一现象是由于染色体配对异常，导致同源重组紊乱，最终出现大量的染色体碎片，而这些染色体碎片并且不会随着纺锤丝的牵引而向两级移动，呈现游离的状态(图5，a-d和i-l野生型染色体发育，e-h和m-p突变体染色体发育，蓝色箭头指向未配对的染色体，白色箭头指向游离的染色体碎片)。至此，我们确信，突变体雄性不育的根本原因是花粉发育的减数分裂时期发育紊乱导致的。

(2)osmfs1基因的图位克隆

突变体是宁粳4号经过ems诱变获得，突变体mfs1表现为雌雄配子全不育，为了构建定位的f2群体，我们以杂合型的植株为母本，以籼稻品种n22为父本，进行杂交配组，利用图位克隆的方式对获得的f2群体(约1500株)进行基因定位，全基因组初连锁将区间确定在九号染色体标记rm23662和rm23916，随后设计引物进行精细定位(引物设计网站：http://ricevarmap.ncpgr.cn/v1/)，最终将区间定位在标记nn9s-l4和nn9s-l7的282kb区间，此时我们对区间进行基因预测，其中发现loc_os09g10850编码一个减数分裂相关基因，由于雌雄配子发育的减数分裂时期是否正常完成直接影响花粉发育，于是我们将osmfs1作为候选基因，对该基因测序发现在第八个外显子存在一处由g到a的单碱基突变，导致了蛋白翻译的提前终止，因此将osmfs1作为导致突变体完全不育表型的目的基因(图6)。osmfs1其dna序列如seqidno.1所示；蛋白大小为23.9kd,含有一个在各物种中都高度保守的结构域：coiledcoil结构域，其氨基酸序列入seqidno.2所示。

实施例2：crispr/cas9技术和转基因表型鉴定

为了进一步确定osmfs1突变导致了突变体表型，我们利用crispr/cas9技术对该基因进行了敲除，通过网站设计了特异的敲除引物(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr)，对基因osmfs1进行靶向敲除(图7)。在获得的转基因植株中，测序鉴定出了两个纯合突变家系分别命名为osmfs1-1和osmfs1-2,两个敲除家系都是在第三个外显子上发生了单碱基插入，osmfs1-1是插入碱基a,osmfs1-2是插入碱基t，这都导致了蛋白翻译的提前终止。对转基因家系的植株进行形态学观察，植株和突变体osmfs1表型一致，都是营养生长完全正常，但是生殖生长后期表现为小穗完全不育(图8，a，抽穗后野生型和osmfs1-1突变体的植株表型；b，osmfs1-1和osmfs1-2植株基因编辑方式)，至此我们确定osmfs1的突变导致了突变体完全不育的表型。

实施例:3：基因osmfs1的时空表达分析和亚细胞定位

通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)和gus染色实验，了解基因osmfs1的表达模式，我们利用rna提取试剂盒提取野生型植株各组织和花药发育各时期的rna，通过网站设计了特异的定量引物用于pcr(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)。定量结果显示osmfs1在各组织中呈现组成型表达,在花药发育的减数分裂时期高表达，这也就说明osmfs1确实是在花药发育的减数分裂时期行使功能(图9，a,基因野生型各组织的定量表达水平，包括叶、叶鞘、茎节、茎、小穗和根，b,基因在野生型小穗发育各时期的定量表达水平，包括s5-12时期)。随后我们扩增了一段基因上游启动子特异的2.6k片段，用于启动gus报告基因，对获得的gus转基因植株的小穗进行染色，结果显示在小穗发育的减数分裂时期信号最强(图9，c,gus转基因植株各个时期的小穗)，这也与之前的荧光定量pcr结果一致，进一步证实osmfs1在减数分裂时期特异表达。为了明确基因osmfs1的行使功能的位置，我们通过亚细胞定位实验，分别在烟草细胞和水稻原生质体中检测gfp信号，发现都是呈现核定位，说明osmfs1是一个核定位蛋白(图9，d-g,水稻原生质体中荧光信号检测，h-k,烟草细胞中荧光信号检测)。

实施例4：osmfs1和oshop2互作验证和双突表型鉴定

为了探索osmfs1的功能，我们通过酵母双杂交实验发现osmfs1和oshop2互作，并且通过pull-down实验进一步证实两个蛋白在体外可以互作(图10，a，利用酵母双杂交系统，共转ad-osmfs1和bd-oshop2的酵母质粒,观察酵母在缺陷型培养基上的生长情况，b,体外蛋白互作实验，利用western-blot检验蛋白结合情况)。通过crispr/cas9技术，我们获得了oshop2单突和osmfs1/oshop2双突植株，对这些转基因家系的植株进行形态学观察，发现oshop2单突和osmfs1/oshop2双突植株都表现为营养生长时期完全正常，但是生殖生长后期完全不育，通过i2-ki染色，发现单突和双突完全没有可育的花粉，都呈现完全典败，和mfs1的表型类似。测序结果显示单突oshop2-1在第三个外显子存在一处单碱基a插入，双突在基因osmfs1的第三个外显子存在一处a/t的插入，在oshop2基因是一条链插入单碱基c，另一条链缺失5个碱基(图11，a,成熟时期野生型、osmfs1-1、oshop2-1和osmfs1/oshop2植株表型，b,成熟时期野生型、osmfs1-1、oshop2-1和osmfs1/oshop2小穗，c-f,花粉碘碘化钾染色观察，g，转基因植株osmfs1-1、oshop2和osmfs1/oshop2的基因编辑方式)。随后对单突和双突染色体进行pi染色观察，发现单突和双突染色体的发育存在缺陷，存在大量和osmfs1同样的染色体碎片(图12，野生型、osmfs1-1、oshop2-1和osmfs1/oshop2染色体发育的粗线期、中期i和后期i的pi染色观察)。因此我们确定复合体osmfs1/oshop2中的任何一个基因突变都会导致植株染色体发育异常，最终表现为完全不育。

序列表

<110>南京农业大学

<120>水稻减数分裂发育相关基因osmfs1及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5088

<212>dna

<213>粳稻品种nip(japanricevarietynippobare)

<400>1

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