用于间充质干细胞膜蛋白定性分析的组合物及方法和应用与流程

本发明涉及一种用于检测的组合物，特别涉及一种对蛋白质进行定性检测的组合物，实现对间充质干细胞膜蛋白无损分析。

背景技术：

间充质细胞(mesenchymalstemcells，mscs)起源于胚胎中胚层的干细胞，广泛存在于机体各处。其中，间充质干细胞属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，集中在骨髓和脂肪组织中，并具有多种潜能。在特定条件下，可以在体内和体外被诱导分化为不同类型的细胞，如：软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞等。其易于分离和培养，体外扩增潜能高。临床实验证实，间充质干细胞移植可用于组织修复及治疗间充质组织遗传缺陷性疾病，是一种极具吸引力的治疗工具。cd44蛋白是一组分布广泛，分子量为(85～160)×10kd的多分子形式的膜整合蛋白，介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用，cd44在很多种肿瘤细胞的表达比相应正常组织为高，并与肿瘤细胞的成瘤性、侵袭性及淋巴转移性有关。因此，对间充质干细胞膜蛋白标志物cd44的分析可以为多种骨疾病、肺损伤、糖尿病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等疾病的临床判断提供许多重要的信息。

关于检测cd44蛋白的方法有很多种，但都是传统的免疫荧光(if)，免疫印迹(wb)和质谱(ms)等方法。免疫印迹和质谱的方法虽然可以提供蛋白质的定量信息，但对细胞具有破坏性，需要裂解细胞并先提取蛋白质。免疫荧光技术是一种强大的免疫化学技术，可通过荧光团修饰抗体原位非结构破坏性地检测多种膜蛋白。但该方法需要用抗体对靶蛋自进行不可逆标记，这可能会不可预测地影响膜蛋白和细胞的活性。dna是脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)的简称，作为一种天然的生物大分子，在纳米尺度上构建功能结构方面有得天独厚的优势。dna纳米技术自提出以来，因具有结构可编程性、良好的生物相容性和生物稳定性、无明显的细胞毒性和免疫刺激性，以及能够自主入胞等特点，在生物医药领域引起了广泛的关注，已经用于肿瘤的成像与检测。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种组合物，含有荧光修饰的dna链，用于对靶标细胞膜蛋白实施原位成像的定性分析。

本发明的另一个目的在于提供一种组合物，含有荧光修饰的dna链，其与间充质干细胞的膜蛋白结合后，使得膜蛋白表达和细胞活性不受影响，实现无损分析。

本发明的再一个目的在于提供一种分析的细胞方法，实现对样本中靶标细胞膜蛋白cd44的原位成像的定性分析。

本发明的又一个目的在于提供一种试剂盒，实现对样本中靶标细胞膜蛋白cd44的原位成像的定性分析。

本发明所称的靶标细胞，系对样本中含有的拟检测的细胞总称，比如：但不限于体细胞、干细胞和癌细胞等。

一种组合物，包括：

seqidno1所示的寡聚脱氧核糖核苷酸链，其5′末端标记了荧光基团(如：红色荧光基团cy5)。

另一种组合物，包括

seqidno1所示的适体引物(apt-pri)，其5′末端标记了红色荧光基团(如：cy5)；

seqidno2所示的辅助引物(ass-pri)；

seqidno3所示的环状dna模板(loop)；

seqidno4所示的分子信标(mb)，5′和3′端分别修饰了绿色荧光基团fam和猝灭基团bhq。

本发明的各种组合物，还包括盐酸氯丙嗪(cpm)、1mg/ml的bsa、10v/v％胎牛血清(fbs)、4.5g/l葡萄糖、5mm的mgcl2和dmem培养基等，这些物质单独和混合应用于本发明。

本发明提供的各种组合物，还包括：

dna聚合酶(klenowfragment，3′→5′exo^-)，用于3′端的扩增和延伸，

dna聚合酶缓冲液，和

dntp。

本发明的组合物，寡聚脱氧核苷酸apt-pri的序列为：

5′-ccaaggcctgcaagggaaccaaggacacagacctcacgaccattctgc；

本发明的组合物，寡聚脱氧核苷酸ass-pri的序列为：

ctaacaattatcactgggtcgtgaggt；

本发明的组合物，寡聚脱氧核苷酸loop的序列为：

gtacggcagaatcagtgataattgttagaagaaaaaaaaatcccaacccgccctaccct；

本发明的组合物，寡聚脱氧核苷酸mb的序列为：

cgctctcccaacccgccctagagcg。

本发明的组合物，所检测的靶标细胞为间充质干细胞，膜蛋白为cd44。

本发明组合物用于对间充质干细胞膜蛋白cd44进行原位成像的定性分析，其方法如下：

首先，将cd44蛋白适体(apt-pri)溶解到缓冲液(如：磷酸缓冲盐溶液pbs)加热到95℃保持5分钟使其变性，然后冷却至室温以形成dna二级结构；

之后，为了防止适体的内吞，将100μm的盐酸氯丙嗪(cpm)添加到培养基中，并在二氧化碳恒温细胞培养箱中与细胞孵育30分钟；

接着，用缓冲液轻轻洗涤两次除去含cpm的培养基，然后将含有150nm的apt-pri的适体-蛋白质结合缓冲液(含1mg/ml的bsa，10v/v％fbs，4.5g/l葡萄糖，5mm的mgcl2的dmem)和细胞在37℃下孵育60分钟；

最后，在共聚焦激光扫描显微镜下成像，实现靶标细胞膜蛋白原位成像的定性分析。

本发明组合物还可用于对间充质干细胞膜蛋白cd44进行异位荧光定量分析，其方法如下：

首先，将apt-pri，ass-pri和loop的混合物于缓冲液(如：磷酸缓冲盐溶液pbs)中，95℃加热5分钟使其变性，然后冷却至室温使其互补成dna三体复合物结构；

之后，为了防止适体的内吞，将100μm的盐酸氯丙嗪(cpm)添加到培养基中，并在二氧化碳恒温细胞培养箱中与细胞孵育30分钟；

接着，用缓冲液轻轻洗涤两次除去含有cpm的培养基，然后将100μl含有150nmdna三体复合物的rca反应缓冲液(即：2μl的10mm的dntps，2μl的5u/μl的dna聚合酶，10μl的10×聚合酶反应缓冲液，5μl的10μm分子信标和81μl的dmem)和细胞孵育2小时；

最后，将上清液中收集起来去检测荧光信号强度，实现对靶标细胞膜蛋白的异位荧光定量分析。

本发明组合物用于对间充质干细胞膜蛋白cd44进行无损分析，其方法如下：

首先，将apt-pri，ass-pri和loop的混合物于缓冲液(如：磷酸缓冲盐溶液pbs)中，95℃加热5分钟使其变性，然后冷却至室温使其互补成dna三体复合物结构；

之后，为了防止适体的内吞，将100μm的盐酸氯丙嗪(cpm)添加到培养基中，并在二氧化碳恒温细胞培养箱中与细胞孵育30分钟；

接着，将含有150nm的dna三体复合物的适体-蛋白质结合缓冲液和细胞在37℃下孵育60分钟，实现对靶标细胞膜蛋白原位成像的定性分析；

然后，用pbs洗去适体-蛋白质结合缓冲液，并加入rca反应缓冲液和细胞孵育2小时后，将上清液中收集起来去检测荧光信号强度，实现对靶标细胞膜蛋白的异位荧光的定量分析；

最后，将经过分析后的细胞进行蛋白质印迹法(westernblot)法和cck-8(cellcountingkit-8)的测定，来检测膜蛋白表达和细胞活性的变化。

最终对靶标细胞膜蛋白实现了全无损的分析。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的检测组合物，采用dna互补形成的三体复合物和靶标膜蛋白结合，滚环扩增(rca)介导的信号放大体系，实现对样本中靶标细胞进行原位成像定性和异位荧光定量分析。

本发明的检测组合物，可以根据检测的需要选择不同靶细胞膜蛋白的适体，通过选取具有特征性的膜蛋白，该组合物可以应用于不同靶标细胞膜蛋白的分析检测，因而具有良好的普适性。

基于本发明的组合物，实验操作方便，可以实现对细胞及其膜蛋白的全无损分析，能够普遍应用于临床诊断和疾病监测等领域。

附图说明

图1为本发明组合物用于无损分析间充质干细胞膜蛋白的原理示意图；

图2为不同细胞在共聚焦激光扫描显微镜下成像图；

图3为不同细胞数量分析膜蛋白的定量结果；

图4为蛋白质印迹法测定蛋白表达结果图；

图5为cck-8法测定细胞活性结果图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1间充质干细胞膜蛋白的定性检测

将适体引物(apt-pri)在95℃加热5分钟使其变性，然后冷却至室温形成dna二级结构。在玻底共聚焦培养皿中按照每个培养皿1×10⁵个细胞进行接种。为了让细胞更好的贴壁生长，需在37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养24小时。为了防止适体的内吞，将150μl的100μm的盐酸氯丙嗪添加到培养基中，并在二氧化碳恒温细胞培养箱中与细胞孵育30分钟。

用1×pbs洗涤两次除去含有盐酸氯丙嗪的培养基，然后将150μl含有150nm适体引物(apt-pri)的适体-蛋白质结合缓冲液(包含1mg/ml牛血清白蛋白(bsa)、10v/v％胎牛血清(fbs)、4.5g/l葡萄糖和5mm氯化镁(mgcl2)的无血清含双抗的高糖培养基(dmem，highglucose))和细胞在37℃的二氧化碳恒温培养箱中60分钟。用1×pbs洗涤两次除去含有适体-蛋白质结合缓冲液的培养基，加入1ml的pbs。最后，在共聚焦激光扫描显微镜下成像，实现靶标细胞膜蛋白原位成像的定性分析，参见图2所示。

实施例2间充质干细胞定量检测

以本实施例提供的组合物(如：apt-pri等)分析间充质干细胞膜蛋白的原理如图1所示。具体实施方式如下：

将适体引物(apt-pri)、辅助引物(ass-pri)和环状dna模板(loop)的混合物在95℃加热5分钟使其变性，然后缓慢冷却至室温使其互补成dna三体复合物结构。在24孔板中按照每个培养皿1×10⁴个细胞进行接种，为了让细胞更好的贴壁生长，需在37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养24小时。为了防止适体的内吞，将150μl的100μm的盐酸氯丙嗪(cpm)添加到培养基(如：dmem培养基)中，并在二氧化碳恒温细胞培养箱中与细胞孵育30分钟。用1×pbs轻轻洗涤两次除去含有cpm的培养基，然后将含有150nmdna三体复合物的滚环扩增(rca)反应缓冲液100μl，包含2μl的10mm的脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)，2μl的5u/μldna聚合酶，10μl的10x聚合酶反应缓冲液，5μl的10μm分子信标(mb)和81μl的含10％胎牛血清(fbs)和双抗的高糖培养基(dmem，highglucose)和细胞孵育2小时。最后，将rca反应缓冲液收集起来用荧光分光光度计去检测荧光信号强度，实现对靶标细胞膜蛋白的异位荧光定量分析。从图3中可以看出，检测限为10个细胞。

实施例3间充质干细胞膜蛋白的无损分析

首先准备间充质干细胞、hepg2和l02三种细胞各三组，对第一组的三种细胞的cd44蛋白进行蛋白质印迹法(westernblot)实验的测定。然后按照上述实施例2中的方法对第二组的三种细胞进行第一轮分析，分析结束后的细胞进行蛋白质印迹法实验测定。接着按照上述实施例2中的手段对第二组的三种细胞进行第一轮分析，分析结束后的细胞放到二氧化碳恒温细胞培养箱中继续培养2小时，待其状态稳定后继续按照上述实例2中的方法进行第二轮的分析，分析结束后的细胞进行蛋白质印迹法实验测定。其结果如4图所示：与未经过分析的组相比，经过了第一轮和第二轮分析的细胞膜蛋白表达量没有发生明显的变化，表明采用本实施例组合物的分析方法未对膜蛋白的表达造成影响。

实施例4间充质干细胞膜蛋白的无损分析对细胞活性的影响

准备间充质干细胞、hepg2和l02三种细胞各三组，将细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中，为了让细胞更好的贴壁生长，需在37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养24小时。没有添加任何试剂的培养基(ab)和有细胞的培养基(ac)分别作为空白组和对照组。含有细胞并经过全无损分析的培养基用作实验组(as)。在培养48小时后，采用cck-8法(cellcountingkit-8)对第一组的三种细胞进行测定。然后按照上述实施例2中的方法对第二组的三种细胞进行第一轮分析，分析结束后的细胞进行cck-8法测定。接着按照上述实施例2中的手段对第二组的三种细胞进行第一轮分析，分析结束后的细胞放到二氧化碳恒温细胞培养箱中继续培养2小时，待其状态稳定后继续按照上述实施例2中的方法进行第二轮的分析，分析结束后的细胞进行cck-8法测定。其结果如图5所示：与未经过分析的组相比，经过了第一轮和第二轮分析的细胞活性没有发生明显的变化，表明采用本实施例组合物的分析方法未对细胞活性造成影响。

cck-8法测定步骤如下：将10μlcck-8试剂添加到每个孔中，并将细胞在37℃下连续孵育2h。最后，通过酶标仪在450nm处的吸光度测量评估od值。重复测定三次，细胞活力的计算方法如下：

细胞活力(％)＝[(as-ab)/(ac-ab)]×100％。

序列表

<110>章毅

中国干细胞集团上海生物科技有限公司

重庆市干细胞技术有限公司

中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司

上海市干细胞技术有限公司

陕西省干细胞技术有限公司

苏州市干细胞技术有限公司

三亚市干细胞技术有限公司

<120>用于间充质干细胞膜蛋白定性分析的组合物及方法和应用

<141>2020-02-03

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccaaggcctgcaagggaaccaaggacacagacctcacgaccattctgc48

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctaacaattatcactgggtcgtgaggt27

<210>3

<211>59

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gtacggcagaatcagtgataattgttagaagaaaaaaaaatcccaacccgccctaccct59

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgctctcccaacccgccctagagcg25