MYB61基因在甘蓝型油菜粒色育种中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种myb61基因在甘蓝型油菜粒色育种中的应用。

背景技术：

甘蓝型油菜(brassicanapusl.)是世界四大油料作物之一，菜籽油不仅是重要的植物油来源之一，菜籽饼粕也是重要的蛋白质饲料来源。在油菜遗传育种中，黄籽性状之所以会引起国内外育种家们的高度关注，主要是因为在相同的遗传背景下，与黑籽相比，黄籽甘蓝型油菜品系具有种皮薄，含油量和蛋白质含量高，皮壳率、木质素、纤维素和多酚含量低，品质良好等一系列优点。一般的甘蓝型油菜的黄籽品系纤维素含量比黑籽低5％)，而含油量和蛋白质含量分别高2.5％和2.6-5％。另外，黄籽油菜在压榨后，油质清澈透明，毛油中色素少，易于脱色加工，经榨取后的饼粕中蛋白质含量高、木质素和纤维素含量低，有毒物质或抗营养物质(主要包括硫苷、植酸、单宁和芥子碱等)少等，提高了饼粕的饲用价值。

在甘蓝型油菜中，最初的研究结果认为色素化合物及相关酶类是影响甘蓝型油菜种子发育过程中色泽变化重要的影响因子，原花色素、多酚和木质素等也是影响种皮颜色的重要物质组分，且已有很多苯丙烷-类黄酮途径基因也陆续被克隆并进行了相关研究，但其具体的机理尚未明确。

通过前期研究，在甘蓝型油菜种皮色泽主效qtl置信区间鉴定出一个r2r3型转录因子myb61。拟南芥atmyb61基因参与种皮的形成，与种皮黏液的分泌与沉积有关；且粘液层能够强化对水分的吸收，在种子的萌发中有重要作用；而atmyb61突变体种子的黏液分泌有缺陷时，其主要成分是鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的沉积与分泌会减少，致使成熟种子种皮细胞也出现缺陷。

而在甘蓝型油菜中，对于myb61基因功能研究相对较少，其具体的生物学功能及分子调控机理仍需要进一步的研究证实。

因此开发一种myb61基因在甘蓝型油菜粒色育种中的应用。

技术实现要素：

在构建myb61基因的rnai表达载体并成功转化甘蓝型油菜zy821的基础上，以非转基因受体亲本zy821和rnai-myb61转基因的t3代家系为材料，分析其种子在发育过程中类黄酮及酚类化合物累积的动态变化规律和不同发育时期种皮中相关基因的差异表达模式。结果表明，myb61基因可能通过参与调控种皮中不溶性原花色素及色素类物质的累积来影响种皮色泽的变化；且myb61基因参与调控了类黄酮途径相关基因的表达，是该途径上的重要调控因子；myb61基因可能是甘蓝型油菜粒色性状形成的主效调控基因之一。

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜转录因子myb61在甘蓝型油菜粒色育种中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

甘蓝型油菜转录因子myb61在甘蓝型油菜粒色育种中的应用，其中所述甘蓝型油菜转录因子myb61的核苷酸序列如seqidno：1所示。

作为优选的方案，所述粒色育种为黄籽育种。

本发明的目的之二在于提供一种甘蓝型油菜的黄籽种子。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种甘蓝型油菜的黄籽种子，所述黄籽种子通过筛选干扰myb61基因表达的甘蓝型油菜植株获得，所述myb61基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明的目的还在于提供一种甘蓝型油菜转录因子myb61的rnai片段，其用于甘蓝型油菜的育种中可有效干扰转录因子myb61的表达。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种甘蓝型油菜转录因子myb61的rnai片段，其核苷酸序列如seqidno：2所示。

本发明的目的还在于提供一种上述rnai片段构建的转基因表达载体。

本发明的目的还在于提供一种上述转基因表达载体的构建方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

rnai片段转基因表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)目的片段的克隆：针对核苷酸序列如seqidno：2所示rnai片段设计rnai引物，以甘蓝型油菜黑籽品系的cdna为模板，pcr扩增获得目的片段；

2)表达载体的构建：将获得的目的片段连接到pmd19-t载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，菌液送样测序；测序正确的菌液抽提质粒和pfgc5941m质粒进行完全双酶切，分别回收目的片段和开环的pfgc5941m质粒骨架，用t4dna连接酶连接，获得重组质粒；

3)表达载体的鉴定：步骤2)获得的重组质粒再次转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，测序，结果正确即为rnai-pfgc5941m转基因表达载体。

作为优选的方案，步骤1)所述的模板为甘蓝型油菜黑籽品系中油821的cdna。

作为优选的方案，步骤1)所述正向引物含限制性酶切位点bamhi和aatii，反向引物含限制性酶切位点xbai和ncoi。

进一步，正向引物序列为seqidno：3所示，所述反向引物序列为seqidno：4所示。其中正向引物序列的5’端添加了保护碱基ct，反向引物序列的5’端添加了保护碱基ag，用来提高内切酶结合到dna双链的稳定性并发挥切割dna作用。

本发明的目的还在于提供一种上述转基因表达载体转化的根癌农杆菌。

本发明的目的还在于提供一种上述根癌农杆菌转染甘蓝型油菜获得的转基因种子。

本发明的目的还在于提供一种根癌农杆菌花序浸染甘蓝型油菜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①材料准备：在盛花期前一周左右去掉柱头及已完成受精的花蕾和荚果，获得待侵染植株；培养权利要求8所述的根癌农杆菌，至od600为0.8-1.2，将菌液离心，取沉淀，用转化缓冲液重悬获得细菌缓冲液；

②花序浸染：将待浸染植株的整个花序完全浸入细菌缓冲液中90-120s，并轻轻摇动，用准备好的硫酸钠纸袋保湿；在3天和5天后各重复浸染一次；

④浸染7天后去掉纸袋，正常进行田间管理，成熟后收获种子。

其中转化缓冲液：1/2ms+3％蔗糖+0.1％silwet-77+2ng/l6-ba+8mg/l乙酰丁香酮。

本发明的目的还在于提供一种本发明的rnai片段在甘蓝型油菜粒色育种中的应用，其核苷酸序列如seqidno：2所示。

进一步，本发明的目的还在于提供一种上述rnai片段转基因表达载体在甘蓝型油菜粒色育种中的应用。

进一步，本发明的目的还在于提供一种上述转基因表达载体转化的根癌农杆菌在甘蓝型油菜粒色育种中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明阐明了myb61在调控甘蓝型黄籽形成中的作用，进一步认识黄、黑籽甘蓝型油菜种皮发育的生物学特性、差异形成机理的分子遗传机制，为油菜黄籽育种提供理论依据和技术路线，对基因工程进行油菜品质的遗传改良和育种实践具有重要指导意义。

附图说明

图1为rnai-myb61和对照zy821中myb61表达量检测；横坐标分别代表花后10，20，30，40天四个不同发育时期，以zy821在花后10天的表达量为参照来计算基因的相对表达量。

图2为zy821和rnai-myb61农艺性状分析。

图3为对照zy821和rnai-myb61品质性状分析。

图4为zy821和rnai-myb61的表型；其中a：zy821不同时期种子；b：rnai-myb61不同时期种子；c：zy821成熟种子种皮表面结构；d：rnai-myb61成熟种子种皮表面结构。

图5为zy821和rnai-myb61成熟种子的钌红染色。

图6为zy821和rnai-myb61种子发育过程中种皮原花色素多酚物质的累积变化；其中a到e表示zy821种子发育过程中原花色素类酚类物质的检测和积累部位；f到j表示在rnai-myb61种子发育过程中原花色素类酚类物质的检测和积累部位。

图7为zy821和rnai-myb61不同发育时期种皮中可溶性原花色素和不溶性原花色素含量；其中a：zy821和rnai-myb61种皮中可溶性原花色素含量；b：zy821和rnai-myb61种皮中不溶性原花色素含量。

图8为zy821和rnai-myb61不同发育时期种皮中色素含量；其中a：zy821和rnai-myb61种皮中花色素含量；b：zy821和rnai-myb61种皮中类黄酮含量；c：zy821和rnai-myb61种皮中多酚含量；d：zy821和rnai-myb61种皮中黑色素含量。

图9为参与类黄酮途径关键基因在不同发育时期种皮中的表达分析；其中a-f：横坐标分别代表花后10，20，30，40天四个不同发育时期，以zy821在花后10天的表达量为参照来计算基因的相对表达量。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1myb61rnai转基因甘蓝型油菜的获得

1.rnai-myb61转基因表达载体的构建

1)目的片段克隆：

针对myb61基因的序列涉及rnai片段，其序列如seqidno：2所示。

进一步针对rnai片段设计rnai引物，正向引物含限制性酶切位点bamhi和aatii，反向引物含限制性酶切位点xbai和ncoi，正向引物序列为seqidno：3所示，所述反向引物序列为seqidno：4所示。

以甘蓝型油菜黑籽品系中油821的cdna为模板，pcr扩增获得目的片段；

2)rnai-myb61表达载体的构建：

将获得的目的片段连接到pmd19-t载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，菌液送样测序；测序正确的菌液抽提质粒和pfgc5941m质粒进行完全双酶切，分别回收目的片段和开环的pfgc5941m质粒骨架，用t4dna连接酶连接，获得重组质粒；

3)表达载体的鉴定：步骤2)获得的重组质粒再次转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，测序，结果正确即为rnai-pfgc5941m转基因表达载体。

2.rnai-myb61转基因表达载体转化农杆菌及鉴定

采用液氮冷激法转化根癌农杆菌菌株lba4404，挑选抗kan、rif和str的菌落，单克隆菌液同样要经过挑选抗kan、rif和str的筛选。进行多重pcr鉴定，鉴定结果完全一致，表明myb61基因的干扰载体片段成功转入lba4404中，可冷冻保存为直接用于植物转化的工程菌株。

3.根癌农杆菌转染甘蓝型油菜黑籽品系

1)rnai-myb61根癌农杆菌花序浸染油菜

具体流程如下：

①材料准备：在盛花期前一周左右选取在正常生长条件下健壮的甘蓝型油菜，在浸染前一天去掉柱头及已完成受精的花蕾和荚果。

②农杆菌培养：将携带myb61基因的rnai载体的工程菌株在添加抗生素(kan100mg/l、str25mg/l和rif20mg/l)的lb液体培养基中，于28℃摇床上(转速250rpm左右)培养24-48h，取该培养菌液以1/100的比例转接到新鲜的lb液体培养基(添加抗生素同上)中，培养至od600＝1.0左右。

③农杆菌菌液侵染：将培养菌液转入500ml离心管中，4℃条件下5000rpm离心10min，弃掉上清，用2倍体积的转化缓冲液(1/2ms+3％蔗糖+0.1％silwet-77+2ng/l6-ba+8mg/l乙酰丁香酮)重悬，待菌体完全重悬后加入约500ml转化缓冲液。将植株的整个花序完全浸入缓冲液中90-120s，并轻轻摇动，侵染完成后挂牌并用准备好的硫酸钠纸袋保湿。在3d和5d后各重复浸染一次。

④浸染7d后去掉纸袋，按正常的田间管理进行，成熟后按编号收获种子。

2)rnai-myb61转基因植株筛选

将t1代播种后，在苗期生长至4-5片真叶时进行抗basta(300ppm)筛选，此过程在晴天进行，最终得到抗basta植株。将获得的抗basta植株用改良的ctab法提取基因组dna，采用两对引物(f35s3nd+rnai-f和rpa3ndr+rnai-r)分别对再生植株进行pcr鉴定，以野生型sophia的基因组为阴性对照，rnai表达载体的农杆菌菌液为阳性对照，鉴定结果与预期结果相一致，结合basta筛选的结果综合分析表明鉴定为阳性的植株为转基因植株。

以非转基因受体亲本zy821和rnai-myb61转基因的t3代家系为材料，进行实施例2-实施例7的实验。

实施例2rnai-myb61转基因植株中myb61基因的表达情况

以甘蓝型油菜bnact7为内参基因，利用qrt-pcr的方法，分别对目标基因myb61在三个转基因株系中的表达量进行分析。结果表明，在各转基因家系中甘蓝型油菜myb61基因的表达水平明显受到抑制，如图1所示。因此，本研究选取了抑制效果较好的rnai-myb61株系作为试验材料进行后续的试验分析。

实施例3rnai-myb61转基因植株农艺和品质性状分析

1.农艺性状

方差分析的结果表明，与对照zy821相比，rnai-myb61转基因植株在株高、一次分枝高、分枝数、角果长度和千粒重等农艺性状方面差异不显著，而rnai-myb61植株主花序角果数明显减少，达到显著差异水平，见图2。

2.品质性状

通过近红外模型对品质性状分析结果表明，rnai-myb61种子黄籽度显著高于对照，达到极显著水平，说明在转基因家系中种皮黄籽度提高，颜色变浅；而rnai-myb61种子含油量、蛋白质含量、芥酸含量、硫苷含量、亚油酸含量、棕榈酸和花生烯酸含量等变化差异不显著；但在亚麻酸、油酸含量方面，对照zy821和rnai-myb61间存在极显著差异，见图3。

说明myb61基因对甘蓝型油菜农艺性状影响不显著，但可能在一定程度上影响了脂肪酸的代谢过程，而具体的调控机理需要进一步的研究证实。

实施例4rnai-myb61转基因种子表皮发育的动态变化

通过扫描电镜对成熟种子表皮结构扫描结果发现，甘蓝型油菜种皮表皮上很多类似叶片表面气孔似的孔眼，且与对照相比，rnai-myb61种子表面的孔洞的开孔尺寸要显著小于对照zy821，而且趋于皱缩关闭状态，(图4，c，d)。钌红能与细胞表面及活性层下的黏多糖成分反应，进而形成电子致密沉淀物，在电镜下以高电子致密物的形式存在。在用钌红染液分别处理对照和rnai-myb61种子后，在体视镜下的观察结果显示，rnai-myb61种子分泌的黏液含量也明显少于对照(图5)，该物质是产生于种皮外层细胞的高尔基体内并分泌到细胞壁层或胞腔内的一种果胶类多糖物质，可能与色素多酚类物质在种皮中累积起关键的作用。当干燥生物种子遇水后粘液质就会被释放形成透明胶质并完全包被着整个种子，且对种子扩散定居、种子的萌发及幼苗存活与生长都具有重要的作用。

本研究结果说明，在myb61基因被沉默后，种皮中黏液明显减少，同时这可以解释了rnai-myb61种子表皮结构中的孔洞都趋于皱缩并近似关闭状态。另外，利用体视镜对不同发育时期种子观察结果显示：rnai-myb61种子着色显著晚于对照zy821，转色延迟，成熟后种皮颜色为浅黄色(图4，a，b)，说明myb61基因可能参与了调控甘蓝型油菜种皮色泽差异的形成，或在参与色素代谢合成的途径中是一个重要的调控因子。

实施例5rnai-myb61种子发育的细胞学观察

用甲苯胺蓝染液(tbo)对不同发育期的非转基因受体亲本zy821和rnai-myb61转基因t3代种子细胞进行染色观察结果显示，在种子发育早期(10dap)，对照zy821和转基因rnai-myb61种皮中并没有明显的色素累积(图6，a和f)；在授粉后20天，受体亲本zy821的种皮内色素类多酚物质在色素层的累积量明显增多，在rnai-myb61中色素的累积却不明显，仅在种子的种脐部有少量累积(图6，b和g)；在花后30天和40天后，大量的色素类多酚物质在对照中的累积量显著增加，并趋于稳定，而rnai-myb61仅在种子种脐部和邻近色素层有少量积累，并与对照zy821差异显著(图6，c，d和h，i)；在种子发育后期(50dap)，对照zy821种皮栅栏层及色素层中，色素的累积量已趋于稳定，而rnai-myb61种皮中累积量明显增加，但仍少于对照，差异显著。

以上结果表明：在种子发育的早期，色素类多酚物质在对照zy821和rnai-myb61转基因家系中均没有显著累积，而在中、后期随着种子的发育逐步成熟，色素不断在种皮的栅栏层和色素层形成，且对照zy821中原花色素类多酚物质的积累量明显多于rnai-myb61转基因家系，这也进一步证实种皮的栅栏层和色素层是种皮成色物质的累积层，且最先在种脐部开始累积，原花色素类多酚物质的累积差异是形成甘蓝型油菜种皮色泽差异形成的重要因子。

实施例6rnai-myb61种子成熟过程中色素类多酚物质含量的测定

本研究发现，在对照zy821和rnai-myb61不同发育期种皮中可溶性原花色素的累积量随着发育时间的延长并没有显著差异；但rnai-myb61与对照zy821相比，不溶性原花色素的含量则随发育时间而显著降低，达到极显著差异水平(图7)。在种子发育20天时，对照zy821和rnai-myb61转基因家系种皮中有不溶性原花色素的积累，但差异不明显；而在种子发育的中后期，对照zy821种皮中不溶性原花色素含量迅速积累，且含量明显高于rnai-myb61；在rnai-myb61转基因家系种子发育成熟后期中，不溶性原花色素的含量虽然也有积累，但在整个发育时期中却变化不大，而zy821的含量达到最高峰值(图7，b)。

前期研究结果表明，甘蓝型油菜粒色变化在种子发育的中后期差异显著，且大量的色素类多酚物质在种皮发育中后期的累积量差异显著，因此，我们推断发育的中后期是种皮粒色差异形成的关键时期。

随后对对照zy821与rnai-myb61转基因家系花后30、40和50天种皮的色素含量进行了测定，结果表明，rnai-myb61转基因家系种皮中各色素含量明显低于对照zy821，达到极显著差异水平(图8)。其中，转基因材料rnai-myb61在整个种子发育进程中其种皮花色素含量始终处于缓慢升高的状态，且变化不是很明显，显著低于对照zy821。在种子发育进程中，受体亲本zy821和转基因材料rnai-myb61的种皮黑色素含量均呈上升趋势，但zy821的累积量显著高于rnai-myb61，尤其是在花后40天到50天，黑色素的累积急剧升高，且不同发育时期黑色素含量的差异均达到极显著水平；在种子发育的不同时期，rnai-myb61和zy821种皮多酚含量均呈现出上升的趋势，且黑籽zy821的种皮多酚含量始终显著高于rnai-myb61。

综合上述结果表明，myb61基因极有可能直接通过调控色素物质合成的代谢途径而参与影响了种皮色泽的变化，其具体的机理仍需要进一步的研究证实。

实施例7苯丙烷-类黄酮途径关键基因的表达模式分析

在模式植物拟南芥的相关研究中表明，种子发生不同程度变异的主要原因是由于编码类黄酮物质合成的一些关键酶和蛋白质基因发生了突变。类黄酮途径是苯丙烷代谢途径上的一个重要分支，其催化生成的产物是影响种皮颜色和茎叶表面着色及花色等多种类黄酮物质的前体。目前在已被成功克隆和功能分析的17个基因中，有8个结构基因(tt3、tt4、tt5、tt6、tt7、fls1、ldox与ban)是参与类黄酮途径中一些酶类合成的关键基因。

因此，本研究中以甘蓝型油菜bnact7为内参基因，利用qrt-pcr的方法对参与类黄酮途径的重要结构基因(bntt3、bntt4、bntt5、bntt6、bntt7)的表达模式进行了分析。结果表明：类黄酮途径中的重要结构基因(bntt3、bntt4、bntt5、bntt6、bntt7)在rnai-myb61转基因株系不同发育时期的表达模式相似，但基因的表达量明显受到抑制，达到极显著差异水平；在种子发育30d时rnai-myb61中基因bntt3、bntt5、bntt6的表达量显著低于对照zy821(图9,b,d,e)。上述结果说明myb61在一定程度上参与调控了类黄酮途径相关基因的表达；同时进一步说明在甘蓝型油菜中，引起黄黑籽种皮差异产生的黄酮类物质及其衍生物可以同时通过类黄酮途径的多个分支形成，且涉及多个基因的共同参与调控。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>西南大学

<120>myb61基因在甘蓝型油菜粒色育种中的应用

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<170>patentinversion2.1

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<212>dna

<213>甘蓝型油菜[brassicanapusl.]myb61基因

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<213>甘蓝型油菜[brassicanapusl.]myb61基因的rnai片段

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