用于表达重组人β-珠蛋白的病毒载体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及用于表达重组人β-珠蛋白的病毒载体及其应用。
背景技术：
：血红蛋白病(hemoglobinopathy)是由于血红蛋白分子结构异常(异常血红蛋白病)，或珠蛋白肽链合成异常(珠蛋白生成障碍性贫血)所引起的一组遗传性血液病，包括β-地中海贫血、镰刀型贫血等。β-地中海贫血是一种遗传性血红蛋白病，属常染色体显性遗传，是由β-珠蛋白基因(hbb)突变导致的β-珠蛋白合成障碍，是全球最常见的单基因遗传病[piel,f.b.,thepresentandfutureglobalburdenoftheinheriteddisordersofhemoglobin.hematoloncolclinnortham,2016.30(2):p.327-41.]。β-地中海贫血在我国东南和西南地区发病率较高，而北方比较少见，因此又称之为海洋性贫血。β-地中海贫血的发生的分子病理相当复杂，主要是由于β-珠蛋白hbb基因座发生碱基替代、缺失、删除、倒位等基因突变，造成β-珠蛋白肽链生成障碍或异常，引发合成不足或完全缺乏，使得血红蛋白α、β两种亚基比例失衡，患者不能形成功能性血红蛋白，同时导致溶血性贫血，使机体氧气供应严重不足，重者危及生命[cao,a.andr.galanello,beta-thalassemia.genetmed,2010.12(2):p.61-76.]。已知有100种以上的hbb基因突变，大多数为点突变(单个核苷酸置换、增加或缺失)，少数为大片段缺失。突变致β链合成部分受抑制者称为“β+地中海贫血”；致β链完全受抑制者称“β0地中海贫血”。β0/β0纯合子表现为重型，β+/β0杂合子多表现为中间型，β+/β表现为轻型[old,j.m.,screeningandgeneticdiagnosisofhaemoglobindisorders.bloodrev,2003.17(1):p.43-53.]。由于β-珠蛋白基因突变和缺失类型繁多，存在多重杂合状态，以及γ、δ链代偿因素，临床表现从完全无症状的携带者到严重贫血的重型之间没有明显分界。其中，据统计，我国“地贫”基因携带者超过3000万人，其中重型和中间型地贫患者在30万人左右。以两广地区最为严重，广东“地贫”基因携带者超过10％，广西“地贫”基因携带者超过20％[he,s.,etal.,prevalenceandgeneticanalysisofalpha-andbeta-thalassemiainbaiseregion,amulti-ethnicregioninsouthernchina.gene,2017.619:p.71-75.]。目前，β-地中海贫血主要依赖定期输血进行维持治疗，给病人家庭和社会带来沉重负担。另外，过多吸收的铁超出血清转铁蛋白的能力沉积脏器，引起多器官病变，且不能达到根治的目的。异基因造血干细胞移植(allo-hsct)是目前根治重症β-地中海贫血的唯一临床手段[olivieri,n.f.andg.m.brittenham,managementofthethalassemias.coldspringharbperspectmed,2013.3(6).]。但众所周知，造血干细胞(hsc)的来源及移植后的排斥反应极大限制了其临床应用。因此急需新的更有效的根治β-地中海贫血临床治疗方案。与β-地中海贫血相似，另一种经典的血红蛋白病是由hbb基因第六位的谷氨酸突变成缬氨酸，形成了异常的血红蛋白s(hbs)，取代了正常血红蛋白(hba)[pauling,l.,h.a.itano,andetal.,sicklecellanemiaamoleculardisease.science,1949.110(2865):p.543-8.]。该类型突变造成氧分压下降时hbs分子之间相互作用，形成螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞(即镰变现象)，因此称为镰刀型贫血[nash,g.b.,c.s.johnson,andh.j.meiselman,influenceofoxygentensionontheviscoelasticbehaviorofredbloodcellsinsicklecelldisease.blood,1986.67(1):p.110-8.]。镰状红细胞不仅携氧能力较差，而且容易堵塞血管，因此镰刀型贫血主要临床表现为慢性溶血性贫血、急性重症疼痛发作、慢性疼痛、进行性肺肾功能衰竭、心血管疾病、中风以及脑血管事件引起的进行性认知功能下降等。目前对于镰刀型贫血的治疗方法包括输血以及药物治疗。药物治疗的思路是诱导形成胎儿型血红蛋白(hbf)，抑制hbs的多聚化[voskaridou,e.,etal.,theeffectofprolongedadministrationofhydroxyureaonmorbidityandmortalityinadultpatientswithsicklecellsyndromes:resultsofa17-year,single-centertrial(lashs).blood,2010.115(12):p.2354-63.]。然而，唯一根治镰刀型贫血的方法仍是allo-hsct[dew,a.andk.vanbesien,stem-celltransplantationforsicklecelldisease.nengljmed,2010.362(10):p.955；authorreply956.]。基因治疗(genetherapy)被认为是下一代临床治疗的终极手段，对于单基因突变的遗传病尤为有效[finotti,a.,etal.,recenttrendsinthegenetherapyofbeta-thalassemia.jbloodmed,2015.6:p.69-85.]。基因治疗是指将外源dna片段导入靶细胞，以纠正、修复、替换、补偿或沉默等方式对缺陷和异常基因进行针对性干预，以期恢复正常的基因功能，最终达到治疗甚至完全治愈的目的。近年来，越来越多的临床前和临床研究表明，以慢病毒和腺相关病毒作为载体在hsc中过表达正常成人β-珠蛋白的基因治疗方法正在成为治疗β-地中海贫血和镰刀型贫血的新策略。慢病毒是来源于人类免疫缺陷病毒-1(hiv-1)的一种转基因载体，不需要经历细胞分裂和细胞核膜破裂过程，就可以进入细胞核，将rna基因组反转录后整合到宿主基因组上，对分裂细胞和非分裂细胞都具有感染能力，从而使得对hsc进行基因转导的效率大幅度提高，被认为是hsc基因治疗载体的首选[may,c.,etal.,therapeutichaemoglobinsynthesisinbeta-thalassaemicmiceexpressinglentivirus-encodedhumanbeta-globin.nature,2000.406(6791):p.82-6.]。利用慢病毒技术治疗β-地中海贫血策略为：(1)分离和纯化地中海贫血患者的hsc；(2)构建并包装过表达hbb(成人β-globin)的慢病毒颗粒；(3)hbb慢病毒体外感染hsc；(4)患者骨髓清除及自体造血干细胞移植。多项临床前研究已证实了该策略的安全性和有效性[roselli,e.a.,etal.,correctionofbeta-thalassemiamajorbygenetransferinhaematopoieticprogenitorsofpediatricpatients.embomolmed,2010.2(8):p.315-28.boulad,f.,etal.,safemobilizationofcd34+cellsinadultswithbeta-thalassemiaandvalidationofeffectiveglobingenetransferforclinicalinvestigation.blood,2014.123(10):p.1483-6.]。腺相关病毒(aav)是细小病毒家族的一员，为无包膜的线性单链dna病毒。由于aav具有组织特异性侵染、定点整合以及不具有任何明显致病性等优点，是慢病毒之外的另一种理想的基因治疗载体[conlon,t.j.andt.r.flotte,recombinantadeno-associatedvirusvectorsforgenetherapy.expertopinbiolther,2004.4(7):p.1093-101.]。动物实验表明，基于aav2载体的基因治疗方法已经成功地在人或小鼠的红细胞中长期过表达人β-珠蛋白[tan,m.,etal.,adeno-associatedvirus2-mediatedtransductionanderythroidlineage-restrictedlong-termexpressionofthehumanbeta-globingeneinhematopoieticcellsfromhomozygousbeta-thalassemicmice.molther,2001.3(6):p.940-6.maina,n.,etal.,optimizationofrecombinantadeno-associatedviralvectorsforhumanbeta-globingenetransferandtransgeneexpression.humgenether,2008.19(4):p.365-75.]。但是，近来发现，这类载体在应用上仍有一些明显缺陷，包括某些细胞膜上病毒受体数量极少，感染效率低，基因表达水平较低，aav衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应，载体容量小等[maina,n.,etal.,optimizationofrecombinantadeno-associatedviralvectorsforhumanbeta-globingenetransferandtransgeneexpression.humgenether,2008.19(4):p.365-75.]。目前国际上多项通过慢病毒载体过表达β-珠蛋白的策略开展β-地中海贫血和镰刀型贫血的基因治疗临床试验正在进行。其中美国蓝鸟公司(bluebird)以bb305载体为骨架生产的慢病毒药物lentiglobin已经进入临床iii期试验，即将进入上市前准备。2017年，bb305载体首次用于治疗镰刀型贫血症，结果发现，基因转导的hsc在分化为红细胞后，血红蛋白的异常聚集明显降低，疗效显著[negre,o.,etal.,preclinicalevaluationofefficacyandsafetyofanimprovedlentiviralvectorforthetreatmentofbeta-thalassemiaandsicklecelldisease.currgenether,2015.15(1):p.64-81.](clinicaltrials.govidentifier:nct02140554)。2018年，nejm再次报道了该团队的ii期临床试验结果(hgb-204,nct01745120和hgb-205，nct02151526)：22位输血依赖的地贫患者，通过lentiglobin基因治疗后，在长达3年的观测中，有15位不再需要进行输血治疗，其余还需输血的患者其输血量和输血次数也大大降低[thompson,a.a.,etal.,genetherapyinpatientswithtransfusion-dependentbeta-thalassemia.nengljmed,2018.378(16):p.1479-1493.]。在最近的第60届美国血液学年会(ash)上，蓝鸟公司公布了最新的iii期临床结果(hgb-207,nct02906202和hgb-212,nct03207009)，在11位患者中有10位不再需要输血治疗。然而，对于β0/β0重度地贫患者来说，基于外源β-珠蛋白过表达的基因治疗仍是一大挑战。原因在于这类患者的两个hbb等位基因均缺失，导致需要更高水平的外源β-珠蛋白表达来维持正常的血红蛋白功能[thompson,a.a.,etal.,genetherapyinpatientswithtransfusion-dependentbeta-thalassemia.nengljmed,2018.378(16):p.1479-1493.marktel,s.,etal.,intrabonehematopoieticstemcellgenetherapyforadultandpediatricpatientsaffectedbytransfusion-dependentss-thalassemia.natmed,2019.25(2):p.234-241.]。而高水平的外源β-珠蛋白表达意味着需要大量的重组病毒对hsc进行基因转导，实际应用中的临床花费巨大。早在2012年，欧盟药物管理机构批准的世界上首款基因治疗产品glybera在德国上市，但是费用却高达100万美元[morrison,c.,$1-millionpricetagsetforglyberagenetherapy.natbiotechnol,2015.33(3):p.217-8.]。该产品上市仅仅5年后就因治疗费用过高退市。2017年，美国fda批准另一个基因治疗产品luxturna，用于罕见遗传性失明患者的治疗，其费用也高达每年85万美元[darrow,j.j.,luxturna:fdadocumentsrevealthevalueofacostlygenetherapy.drugdiscovtoday,2019.24(4):p.949-954.]。高昂的费用势必限制基因治疗技术未来的临床应用。此外，单个细胞中的拷贝数过高也容易增加基因组中插入突变的风险，引发安全性问题[hacein-bey-abina,s.,etal.,lmo2-associatedclonaltcellproliferationintwopatientsaftergenetherapyforscid-x1.science,2003.302(5644):p.415-9.]。因此，急需开发更为安全高效的基因治疗载体，使外源蛋白在相对较低载体拷贝数(vcn)条件下也能实现高水平表达。目前国际同行已经开发出多种用于β-地中海贫血基因治疗的载体，如hpv56[cavazzana-calvo,m.,etal.,transfusionindependenceandhmga2activationaftergenetherapyofhumanbeta-thalassaemia.nature,2010.467(7313):p.318-22.]、bb305[negre,o.,etal.,preclinicalevaluationofefficacyandsafetyofanimprovedlentiviralvectorforthetreatmentofbeta-thalassemiaandsicklecelldisease.currgenether,2015.15(1):p.64-81.]、globe[miccio,a.,etal.,invivoselectionofgeneticallymodifiederythroblasticprogenitorsleadstolong-termcorrectionofbeta-thalassemia.procnatlacadsciusa,2008.105(30):p.10547-52.]等，大部分为慢病毒或逆转录病毒载体。主要构建策略为根据β-珠蛋白基因簇的调控元件特征，将相关核心顺式元件与hbb基因表达框串联，组装成精简的hbb表达模块，反向装载到慢病毒或逆转录病毒载体上；病毒转导hsc后，其装载的表达模块将随机插入整合至hsc基因组中；在hsc向红系分化过程中，红系特异转录因子将识别并结合调控顺式元件及hbb启动子区域，激活外源性hbb基因的强力表达。从上世纪80年代末起，随着分子遗传学的发展，表达hbb的病毒载体的设计经历了不断优化的过程。如何利用最小的dna片段，表达最高浓度的目标蛋白，设计能高效稳定表达人hbb的载体仍是医学界面临的一大挑战。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效表达重组人β-珠蛋白的病毒载体及其应用，通过优化hbb基因顺式调控区域及表达框，增加蛋白质翻译增强元件，将创新的hbb基因表达模块组装进慢病毒或腺相关病毒载体中，实现在人红细胞中hbb长期高效稳定的特异性激活，在β-地中海贫血和镰刀型贫血的基因治疗方面具有重要应用价值。第一方面，本发明要求保护一种dna片段a。本发明所要求保护的dna片段a为新的hbb基因表达模块，其自5’端到3’端由如下(a1)-(a5)顺次连接而成：(a1)三个dna酶i高敏位点；(a2)hbb启动子(promoter)；(a3)翻译增强子；(a4)hbb基因表达框；(a5)hbb转录增强子(enhancer)。在所述(a1)中，所述三个dna酶i高敏位点自5’端到3’端依次为hs4、hs3和hs2。在本发明的一个或多个实施例中，所述hs4的核苷酸序列如seqidno.1的第1-410位所示或如seqidno.3的第1-410位所示。在本发明的一个或多个实施例中，所述hs3的核苷酸序列如seqidno.1的第411-754位所示或如seqidno.3的第411-754位所示。在本发明的一个或多个实施例中，所述hs2的核苷酸序列如seqidno.1的第755-1178位所示或如seqidno.3的第755-1178位所示。具体而言，在本发明的具体实施方式中，所述三个dna酶i高敏位点的核苷酸序列如seqidno.1的第1-1178位所示或如seqidno.3的第1-1178位所示。基因座控制区(locuscontrolregion,lcr)是hbb基因表达调控中重要的顺式元件，长约20kb，具有增强子及开放染色质结构活性。当lcr与hbb表达框相连时，能介导与整合位点无关的红系组织特异性高效表达。早期的研究主要通过分子生物学实验寻找和鉴定dna酶i高敏位点(hs)，来确定精简的lcr序列范围。已被鉴定的hs包括hs1、hs2、hs3、hs4和hs5。这些高敏位点代表一定范围内的序列，共同特征是具有开放的染色质结构，并且能与红系分化相关反式因子特异性结合，精密高效地在发育及分化水平调控hbb基因的表达。其中，hs1的增强子活性较弱；hs5主要起“绝缘子”功能；hs2、hs3和hs4是关键的红系高敏位点，是最主要的顺式元件，起到促进hbb表达的“超级增强子”功能。一般来说，选择的lcr范围越大，hbb基因的表达水平越高；但是，lcr序列越长，病毒包装能力越差，滴度越低。因此，研究者多采取折中方案，通过反复优化，获得适当长度的lcr序列。现有技术中，bb305载体采用smai到xbai之间的644bp序列作为hs2，saci到pvuii之间的845bp序列作为hs3，stui到spei之间的1153bp序列作为hs4，组装获得2.7kb的mini-lcr序列。按照hs4-hs3-hs2的顺序从5’到3’依次串联放置。然而，考虑到hbb表达框自身大小达到1.6kb，加上启动子、增强子等调控元件，外源序列整体大小已经超出腺相关病毒的包装容量。为了进一步精简lcr片段大小，在本发明中，申请人利用在线encode数据库，结合数据库中dna酶i高敏区、转录因子染色质免疫共沉淀、组蛋白修饰特征等，运用生物信息学分析软件初步筛选出多种不同长度的lcr组合，并且在细胞学水平和动物体内进行hbb基因表达验证。最终筛选出长度约1.2kb的lcr序列，称为mlcr(即seqidno.1的第1-1178位所示或seqidno.3的第1-1178位所示)。运用mlcr替换目前主流的bb305载体中2.7kb的lcr序列。mlcr使hbb表达模块的总长度控制在3.5kb，可以满足腺相关病毒的包装要求。体外和体内实验表明，mlcr与hbb表达框相连，配合翻译增强子的作用，可以介导hbb在红系细胞中的特异性高效表达，其表达水平甚至超过bb305载体。在所述(a2)中，所述hbb启动子的核苷酸序列如seqidno.1的第1179-1485位所示。启动子是调控包括hbb在内的大多数真核基因的核心顺式元件，是与rna聚合酶识别、结合和转录起始密切相关的dna序列。一般来说，启动子含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游。对于hbb基因，本发明通过生物信息学分析工具预测hbb基因上游的启动子区域，发现位于hbb基因cap位点上游长度307bp的片段具有最大的红系细胞转录因子结合能力。所述hbb启动子截取cap位点上游的核心启动子区域长度为307bp的多核苷酸片段，即seqidno.1的第1179-1485位、seqidno.2第2637-2943位、seqidno.3第1179-1485位或seqidno.4第1-307位所示。在所述(a3)中，所述翻译增强子为具有ires活性的多核苷酸序列。进一步地，所述翻译增强子可为emcv基因组的5’-utr序列。除了emcv的ires序列，可以作为翻译增强子的序列还可能包括vegf、hif1α、xiap、c-myc、fgf等基因5’-utr具有ires活性的序列。在本发明的一个或多个实施例中，所述翻译增强子的核苷酸序列具体如seqidno.1的第1486-2045位所示。翻译增强子指的是介导核糖体复合物与信使rna(mrna)高效结合以及翻译起始的dna序列，其功能主要是提高蛋白质合成效率。通常来讲，真核生物翻译只能从mrna的5’端开始，因为翻译起始必须依赖于5’端的帽子(cap)结构。内部核糖体进入位点(ires)是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5’帽结构，从而使直接从信使rna(mrna)中间起始翻译成为可能。ires无固定保守序列，但是其共同特征是能形成二级结构，招募核糖体至该位点起始蛋白质翻译。ires通常在病毒基因组中出现，因为病毒基因组具有特殊的多顺反子结构需要核糖体从mrna的中间开始翻译。近年来，在人基因组多个基因的5’非翻译区(utr)也发现了ires结构，这些基因包括vegfr、bip、fgf、igf等。研究发现，在某些极端环境，例如缺氧、饥饿、环境胁迫状态下，蛋白质翻译所需的必要元件活性下降，依赖于5’加帽的蛋白质合成途径受阻，而ires的存在提供了另一种5’加帽非依赖的蛋白质合成途径，保证细胞稳定合成所需的蛋白质。因此，ires可以作为一种翻译增强子起到促进蛋白质翻译的功能。申请人通过查阅大量文献资料发现，脑心肌炎病毒(emcv)转录起始位点上游的5’-utr包含翻译起始所必须的顺式元件，片段大小约为560bp，称为h560。分子生物学研究表明，装配了h560片段的报告基因，其mrna具有更强的核糖体结合能力以及更高的蛋白质合成水平，其基因表达不受低氧环境限制。在本发明中，申请人借鉴emcv基因组ires的翻译调控原理，将h560序列装配到hbb基因的5’-utr。细胞学实验结果表明，h560序列极大增强了hbb基因的表达水平。更令人惊讶的事，h560配合精简的lcr序列，可以介导hbb在红系细胞中的特异性高效表达，其表达水平甚至超过bb305载体。此外，将基因转导的细胞置于低氧环境下培养，装配了h560的载体hbb表达受影响较小。这一结果具有重要意义，因为在地中海贫血和镰刀型贫血患者中，异常结构的血红蛋白常常造成红细胞缺氧，此时，h560可以有效保证缺氧状态下β-珠蛋白的正常合成。因此，加入h560模块对于促进hbb在人体内的稳定高效表达具有重要的应用价值。在所述(a4)中，所述hbb基因表达框为经过优化，且同时引入g16d，e22a，t87q三氨基酸突变(注：此处的突变位置去除了起始密码子编码的蛋氨酸m)和删除了374bp内含子ivs2片段的hbb基因序列。进一步地，所述hbb基因表达框表达seqidno.5所示的蛋白质。在本发明的一个或多个实施例中，所述hbb基因表达框的核苷酸序列如seqidno.1的第2046-3277位、seqidno.2第2944-4175位、seqidno.3第1486-2717位或seqidno.4第308-1539位所示。天然的hbb表达框包含三个外显子和两个内含子，长度达到1.6kb。其中内含子ii长度就超过800bp。过长的序列严重影响病毒包装的滴度和蛋白质表达效率。本申请人在前期研究的基础上，通过查阅大量文献资料，确定内含子ii中rsai之间长度为374bp的片段没有重要的反式作用因子结合基序，并且具有转录抑制功能。实验结果表明，删除这一片段后，病毒包装滴度较天然序列增加10倍以上。本发明中hbb蛋白的外显子序列为经过基因优化的人hbb蛋白质编码序列。前体mrna中的外显子序列经过剪接和拼接后得以保留，它们是真正指导蛋白质合成的编码序列。应理解，基因优化又称为密码子优化，是指在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下，通过替换编码某种蛋白质的多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，达到提高蛋白质在特定种属细胞中的表达水平和表达效率的目的。基因优化包括但不限于密码子偏好性优化、rna高级结构优化、酶切位点优化和gc含量调整等方法。本发明包括运用上述基因优化方法得到的各种编码人hbb蛋白的多核苷酸序列。这些多核苷酸序列的共同特征是采用不同的核苷酸密码子，但是编码的氨基酸序列与野生型人hbb基因编码序列相同。可采用例如ncbi的blast和blastp计算两条比对的多核苷酸序列之间和氨基酸序列之间的序列相同性。镰刀型贫血症患者的hba蛋白发生基因突变，产生的hbs蛋白易形成螺旋形多聚体。而幼儿中高表达的hbf蛋白由于自身的结构特性，不易形成螺旋形多聚体，具有抵抗镰刀型贫血症的潜力。借鉴hbf的结构特点，本申请人对β-珠蛋白的三个关键位点进行突变，产生的蛋白称为hbas3。hbas3能有效抑制hbs的四聚体化，因此具有抵抗螺旋化的能力。其中，t87q能阻断与经典的hbs第6位缬氨酸的横向作用，e22a阻断与hbs第6位缬氨酸的纵向作用，而g16d使得β-珠蛋白对于α-珠蛋白具有更强的亲和力。因此，本发明中表达hbas3的载体除了可以治疗β-地中海贫血，还具有抗镰刀型贫血症的能力。在所述(a5)中，所述hbb转录增强子的核苷酸序列如seqidno.1的第3278-3536位所示。所述hbb转录增强子位于hbb下游的增强子包含天然hbb表达框下游500bp处，具体为位于psti位点之间长度为259bp的片段，即seqidno.1的第3278-3536位、seqidno.2的第4176-4434位、seqidno.3的第2718-2976位或seqidno.4的第1540-1798位所示。第二方面，本发明要求保护一种dna片段b。本发明所要求保护的dna片段b，含有如下(b1)-(b3)：(b1)前文所述的dna片段a；(b2)复制起始位点；(b3)末端反向重复序列(itr)或长末端重复序列(ltr)。在所述dna片段b中，还可含有任选的可选择标记，如amp抗性标记。第三方面，本发明要求保护如下任一生物材料：(c1)含有前文所述dna片段a或前文所述dna片段b的重组载体或重组病毒或重组菌或重组细胞；(c2)dna片段a1，其核苷酸序列如seqidno.1的第1-1178位所示(精简的三个dna酶i高敏位点，简称mlcr)；(c3)dna片段a2，其核苷酸序列如seqidno.1的第1179-1485位所示(307bphbb启动子)；(c4)dna片段a3，其核苷酸序列如seqidno.1的第1486-2045位所示(emcv基因组的5’-utr序列，简称h560序列)；(c5)dna片段a4，其核苷酸序列如seqidno.1的第2046-3277位所示(经过优化的hbb基因表达框)；(c6)dna片段a5，其核苷酸序列如seqidno.1的第3278-3536位所示(hbb转录增强子)；(c7)成套dna片段，由(c2)所述dna片段a1、(c3)所述dna片段a2、(c4)所述dna片段a3、(c5)所述dna片段a4和(c6)所述dna片段a5中的全部或部分组成；(c8)蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.5所示；(c9)编码(c8)所示蛋白质的核酸分子；(c10)含有(c9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组病毒、重组菌或重组细胞。其中，所述重组载体可为重组病毒载体，如重组慢病毒载体或重组腺相关病毒载体。在本发明的一个或多个实施例中，所述重组慢病毒载体为在慢病毒载体plv-egfp的酶切位点ecorv和xbai之间插入所述dna片段a(seqidno.1)后得到的重组质粒。在本发明的一个或多个实施例中，所述重组腺相关病毒载体为在腺相关病毒载体paav-mcs的酶切位点noti之间插入所述dna片段a(seqidno.1)后得到的重组质粒。所述重组菌可为向受体菌中导入所述重组慢病毒载体或所述重组腺相关病毒载体后所得的重组菌。在本发明的一个或多个实施例中，所述受体菌为大肠杆菌(如dh5α)。所述重组细胞可为向病毒包装细胞中转染所述重组慢病毒载体或所述重组腺相关病毒载体后所得的重组细胞。在本发明的一个或多个实施例中，用于包装慢病毒的所述病毒包装细胞具体为hek293t细胞。在本发明的一个或多个实施例中，用于包装腺相关病毒的所述病毒包装细胞具体为aav-293细胞。所述重组病毒为重组慢病毒或重组腺相关病毒。在本发明的一个或多个实施例中，所述重组慢病毒具体为将所述重组慢病毒载体转染病毒包装细胞(如hek293t细胞)后获得。在本发明的一个或多个实施例中，所述重组腺相关病毒具体为将所述重组腺相关病毒载体转染病毒包装细胞(如aav-293细胞)后获得。第四方面，本发明要求保护如下任一应用：(d1)前文所述dna片段a或前文所述dna片段b在构建重组病毒载体或制备用于构建重组病毒载体的产品中的应用。(d2)前文所述dna片段a或前文所述dna片段b在包装重组病毒或制备用于包装重组病毒的产品中的应用。(d3)前文所述dna片段a或前文所述dna片段b或前文所述生物材料在表达重组人β-珠蛋白或制备用于表达重组人β-珠蛋白的产品中的应用。(d4)前文所述dna片段a或前文所述dna片段b或前文所述生物材料在治疗血红蛋白病或制备用于治疗血红蛋白病的产品中的应用。(d5)前文所述dna片段a或前文所述dna片段b或前文所述生物材料在治疗β-地中海贫血或制备用于治疗β-地中海贫血的产品中的应用。(d6)前文所述dna片段a或前文所述dna片段b或前文所述生物材料在治疗镰刀型贫血或制备用于治疗镰刀型贫血的产品中的应用。(d7)前文(c4)所述的dna片段a3(h560序列)在增强目的蛋白表达或制备用于增强目的蛋白表达的产品中的应用。其中，所述目的蛋白可为人β-珠蛋白。(d8)前文(c2)所述的dna片段a1(mlcr)和前文(c4)所述的dna片段a3(h560序列)在增强目的蛋白表达或制备用于增强目的蛋白表达的产品中的应用。其中，所述目的蛋白可为人β-珠蛋白。(d9)前文(c4)所述的dna片段a3(h560序列)在低氧环境下增强β-珠蛋白表达或制备用于在低氧环境下增强β-珠蛋白表达的产品中的应用。(d10)前文(c2)所述的dna片段a1(mlcr)和前文(c4)所述的dna片段a3(h560序列)在低氧环境下增强β-珠蛋白表达或制备用于在低氧环境下增强β-珠蛋白表达的产品中的应用。其中，所述低氧环境通常指的任何一种生理性氧量不足或组织需氧量不足的状态。空气当中正常的氧气浓度为20.9％；在生理状态下，动脉血氧分压为100mmhg，静脉血氧分压为40mmhg。在体外模拟实验中，通常用0.5-5％o2浓度制造模拟低氧环境。第五方面，本发明要求保护一种基于基因疗法治疗血红蛋白病的产品。本发明所要求保护的基于基因疗法治疗血红蛋白病的产品，含有前文所述dna片段a前文所述dna片段b或前文所述的生物材料。进一步地，所述血红蛋白病为β-地中海贫血或镰刀型贫血。在前文各方面中，所述产品均可为药品。实验证明，转导本发明构建的新型hbb表达载体的小鼠红白血病细胞mel在体外能定向分化为红细胞并表达高水平的人hbb蛋白。用转导本发明构建的新型hbb表达载体的小鼠造血干细胞移植到致死剂量辐照的受体小鼠中，可救活小鼠，并在小鼠体内检测到人hbb基因表达。另外，本发明构建的新型hbb表达载体转导细胞后较现有bb305载体的vcn较低，但是hbb表达水平却更高。因此，本发明提供的hbb表达载体具有高效表达外源hbb蛋白的能力，在β-地中海贫血及镰刀型贫血症的治疗中具有极高的应用价值。附图说明图1为h560序列的确定。a为h560序列和emcv基因组序列blast比对结果。h560与emcv基因组5’-utr的第272-831位多核苷酸完全重合。b为h560序列在emcv基因组中的位置。图2为靶向gata1的chip-seq结果。图中展示了hbb基因座及上游30kb序列区域的gata1富集区、dna酶i高敏位点和h3k27ac富集位点。图3为本发明涉及的4种不同hbb表达模块的结构示意图。图4为plv-egfp质粒图谱。图5为paav-mcs质粒图谱。图6为pcmv-dr8.91质粒。图7为pcmv-vsv-g质粒图谱。图8为phelper质粒图谱。图9为paav-rc质粒图谱。图10为包含不同hbb表达模块的慢病毒滴度和慢病毒感染ht1080或mel细胞后hbb质粒拷贝数及vcn的计算方法。a为用不同拷贝数plv-egfp标准质粒为模板，q-pcr测定wpre的ct值，制作标准曲线。b为用不同拷贝数plv-malb质粒为模板，q-pcr测定malb基因ct值，制作标准曲线。c为plv-egfp质粒拷贝数和病毒活性单位的线性拟合度曲线。d为包含不同hbb表达模块的慢病毒感染mel细胞后人hbb的vcn。图11为包含不同hbb表达模块的慢病毒和腺相关病毒滴度。a为慢病毒；b为腺相关病毒。图12为包含不同hbb表达模块的慢病毒感染mel细胞中人hbb的mrna和蛋白表达水平。a为q-pcr检测常氧环境和低氧环境mel细胞中人hbb的mrna表达。b为流式检测常氧环境和低氧环境mel细胞内的人hbb蛋白水平。图中，normal表示常氧环境，hypoxia表示低氧环境。图13为包含不同hbb表达模块的慢病毒感染的小鼠造血干细胞移植同种异体受体小鼠16周后，受体小鼠外周血人hbb的蛋白表达水平。a为实验流程图。b为流式检测小鼠外周血中人hbb蛋白水平。c为hplc检测外周血hbb四聚体丰度。具体实施方式本发明提供一种hbb表达模块，所述hbb表达模块包括依次连接的三个dna酶i高敏的位点(hs2-4)、hbb启动子(promoter)、翻译增强子、优化的hbb表达框、hbb转录增强子(enhancer)。本发明在hbb表达模块中创新地加入具有ires活性的翻译增强子序列。现有技术已在包括emcv在内的多种病毒基因组，以及多个真核基因的5’-utr区域鉴定出具有ires活性的多核苷酸序列。ires序列各不相同，它们的共同特征是折叠形成二级结构，促进核糖体招募到翻译起始位点和提高蛋白质合成效率。实验结果表明，包含emcvires序列的翻译增强子可以在体外和体内显著提高外源转导的hbb基因表达水平。除了emcv的ires序列，可以作为翻译增强子的序列还包括vegf、hif1α、xiap、c-myc、fgf等基因5’-utr具有ires活性的序列。可以用报告基因检测法比较不同ires活性的强弱。本发明所述的hbb表达模块还包括依次连接的三个dna酶i高敏的位点hs2-4，它们构成了hbb基因的mlcr，对hbb基因表达起到顺式增强的作用。过往文献报道中选用的lcr序列大小不一，最长的达到了6.5kb。传统的鉴定dna酶i高敏位点的方法主要采用了酶切图谱比对法，无法精确划定最精简的lcr序列范围。本发明在查阅大量文献资料的基础上，通过生物信息学手段分析hbb基因lcr的最小必须元件。该元件必须满足三个条件：1.具有多个红系分化转录因子结合位点；2.具有较高的h3k27ac乙酰化修饰水平；3.序列范围位于chr11；5,267,071-5,297,071范围内的dna酶i高敏区域。最终选用hs2(424bp)、hs3(344bp)和hs4(410bp)拼接成hbb的mlcr序列，长度约为1.2kb。精简的mlcr可以克服现有技术lcr长度过长的问题，可应用于腺相关病毒载体。本发明也包括包含hbb表达模块的病毒制备方法及人hbb基因表达测定方法。确定了hbb表达模块的多核苷酸序列后，申请人进一步将该序列连接到慢病毒或腺相关病毒载体，制备高效表达人hbb的慢病毒或腺相关病毒。在体外测定慢病毒或腺相关病毒滴度，确定用于感染小鼠造血干细胞的病毒数量。用慢病毒在小鼠造血干细胞中转导外源人hbb基因，建立体外小鼠红细胞诱导分化模型和体内的小鼠造血干细胞移植模型，运用q-pcr法或流式检测法检测外源人hbb基因表达、蛋白含量、平均质粒拷贝数(vcn)等。实验结果表明，转导人hbb基因的小鼠红白血病细胞mel在体外能定向分化为红细胞并表达高水平的人hbb蛋白。用转导人hbb基因的小鼠造血干细胞移植到致死剂量辐照的受体小鼠中，可救活小鼠，并在小鼠体内检测到人hbb基因表达。另外，本发明构建的新型hbb表达载体转导细胞后较现有bb305载体的vcn较低，但是hbb表达水平却更高。因此，申请人认为，本发明提供的hbb表达载体具有高效表达外源hbb蛋白的能力，在β-地中海贫血及镰刀型贫血症的治疗中具有极高的应用价值。以下通过一系列实验实施例，对本发明进行进一步详细描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、hbb表达模块基因序列的确定1、hbb表达框序列的优化从ncbi网站数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取天然人hbb的mrna序列(检索号：nm_000518.5)、基因序列(geneid：3043)。从nm_000518.5序列中提取天然hbb表达框(外显子)序列，将此序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，得到基因优化的hbb外显子序列。用所述基因优化的hbb外显子序列替换天然人hbb外显子序列，同时删除天然人hbb内含子ii中psti位点之间374bp序列，获得优化的hbb表达框。所述优化的hbb表达框多核苷酸序列如seqidno.1的第2046-3277位、seqidno.2的第2944-4175位、seqidno.3的第1486-2717位或seqidno.4的第308-1539位核苷酸所示。2、翻译增强子序列的选择从ncbi网站数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取emcv基因组序列，与addgene网站(https://www.addgene.org/)mscv-ires-gfp载体序列进行blast比对。选取比对完全相同的序列即ires序列，该序列位于emcv蛋白质编码序列上游，长度为560bp，ires序列在emcv基因组中标出，比对结果见图1。选择该序列作为翻译增强子装配到hbb表达模块的启动子和翻译起始位点(atg)之间。所述翻译增强子的多核苷酸序列如seqidno.1的第1486-2045位核苷酸所示。3、精简mlcr序列的组装从ncbi网站数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取hbb基因座及上游30kb～60kb范围lcr序列(chr11：5,225,464-5,297,071)。从公开的基因组数据库encode(https://www.encodeproject.org/)检索分析人红系细胞基因组的染色质免疫共沉淀(chip-seq)数据，用ucsc基因组浏览器查看lcr序列范围中dna酶i高敏区域和红系细胞特异性转录因子(gata1，gata2，fli-1，tal1，lmo2，nfe2)结合位点，结合chip-seq和组蛋白修饰(h3k27ac)数据，确定hbb上游hs2、hs3、hs4序列范围及边界。图2显示的是在k562细胞中以gata1为靶点的chip-seq结果，可以根据该结果确定gata1在k562基因组中的结合位点与dna酶i高敏区域的重叠区域。运用同样的方法确定主要红系转录因子在k562基因组中的结合位点与dna酶i高敏区域的重叠区域。选用hs2(424bp)、hs3(344bp)和hs4(410bp)拼接成hbb的mlcr序列，长度约为1.2kb。所述hs2的多核苷酸序列如seqidno.1第1-410位或seqidno.3第1-410位核苷酸所示；所述hs3的多核苷酸序列如seqidno.1第411-754位或seqidno.3第411-754位核苷酸所示；所述hs4的多核苷酸序列如seqidno.1第755-1178位或seqidno.3第755-1178位核苷酸所示；所述hs2、hs3、hs4按照hs4-hs3-hs2的顺序从5’到3’依次串联放置。4、启动子和下游增强子序列的确定hbb基因启动子区域应是具有最多数量的转录因子结合位点和最大dna聚合酶结合能力的多核苷酸序列。可运用生物信息学分析工具promo(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirdb＝tf_8.3)分析hbb表达框上游500bp以内的转录因子结合情况。选择具有最多数量转录因子结合的区域，包括hbb基因cap位点上游307bp序列。所述hbb启动子的多核苷酸序列如seqidno.1第1179-1485位、seqidno.2第2637-2943位、seqidno.3第1179-1485位或seqidno.4第1-307位核苷酸所示。hbb下游的增强子包含天然hbb表达框下游500bp处，位于psti位点之间长度为259bp的片段；所述位于hbb下游的增强子多核苷酸序列如seqidno.1第3278-3536位、seqidno.2第4176-4434位、seqidno.3第2718-2976位或seqidno.4第1540-1798位核苷酸所示。5、hbb表达模块的组装根据以上优化序列，构建以下4种hbb表达模块序列(图3)：1.hbb0：仅包含依次连接的hbb启动子、优化的hbb表达框、hbb转录增强子。hbb0的多核苷酸序列如seqidno.4所示。seqidno.4的第1-307位为hbb启动子，第308-1539位为优化的hbb表达框，第1540-1798位为hbb转录增强子。2.hbb1：包含依次连接的精简dna酶i高敏的位点(hs2-4)、hbb启动子、优化的hbb表达框、hbb转录增强子。hbb1的多核苷酸序列如seqidno.3所示。seqidno.3的第1-1178位为精简dna酶i高敏的位点(hs2-4)，第1179-1485位为hbb启动子，第1486-2717位为优化的hbb表达框，第2718-2976位为hbb转录增强子。3.hbb2：包含bb305载体中的lcr、hbb启动子、优化的hbb表达框、hbb转录增强子。hbb2的多核苷酸序列如seqidno.2所示。seqidno.2的第1-2636位为bb305载体中的lcr，第2637-2943位为hbb启动子，第2944-4175位为优化的hbb表达框，第4176-4434位为hbb转录增强子。4.hbb3：包含依次连接的精简dna酶i高敏的位点(hs2-4)、hbb启动子、翻译增强子、优化的hbb表达框、hbb转录增强子。hbb3的多核苷酸序列如seqidno.1所示。seqidno.1的第1-1178位为精简dna酶i高敏的位点(hs2-4)，第1179-1485位为hbb启动子，第1486-2045位为翻译增强子，第2046-3277位为优化的hbb表达框，第3278-3536位为hbb转录增强子。以上全部多核苷酸在擎科生物科技有限公司合成，克隆在puc57载体上，并再次测序确定。实施例2、过表达hbb的慢病毒和腺相关病毒载体的构建和病毒包装分别在上述hbb0，hbb1，hbb2，hbb3序列末端增加ecorv和xbai酶切位点，连接到慢病毒载体plv-egfp(addgene)(图4)的ecorv和xbai位点之间，得到plv-hbb0，plv-hbb1，plv-hbb2，plv-hbb3。另外，在hbb0、hbb1和hbb3序列末端增加noti酶切位点，连接到腺相关病毒载体paav-mcs(图5)的noti位点之间，得到paav-hbb0，paav-hbb1，paav-hbb3。上述连接产物转化到感受态大肠杆菌(dh5α)。使用qiagen公司的无内毒素质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到的质粒经测序验证正确后可进行慢病毒和腺相关病毒包装实验。另以gfp取代基因片段的plv-egfp和paav-gfp作为空载对照。1、慢病毒包装(1)hek293t细胞按照5×106个细胞/10cm培养皿进行铺板，37℃，5％co2培养20-22h。(2)镜检细胞状态，使细胞融合率达到50％，提前1h更换新鲜的完全培养基(含25μmchloroquine)，配制1.25ml含有1.25mcacl2、15μgplv-hbb/gfp(即plv-hbb0，plv-hbb1，plv-hbb2，plv-hbb3或plv-egfp，下同)、15μgpcmv-dr8.91质粒(addgene)(图6)、8μgpcmv-vsv-g质粒(图7)预混液；混匀后，加入2×hbs(ph＝7.05)1.25ml，连续吹打10s。质粒预混液混匀后立即逐滴滴加到hek293t细胞培养皿中，混合均匀。37℃孵育6h，小心吸弃细胞培养上清，更换新鲜完全培养基，37℃孵育2-3天。(3)病毒收集：培养2天后，小心吸取上清至新离心管中，2500rpm、离心10min，去除细胞碎片，用0.45μm过滤病毒上清，分装置细胞冻存管中备用。补加7ml完全培养基至细胞中继续培养24h。同样方法收集病毒上清，废弃细胞。(4)病毒浓缩：用超速离心沉淀法对慢病毒粗提液进行浓缩。具体方法为：取ultra-clearsw28离心管，每管分别加入约32ml的预先处理的病毒上清液。在离心管底部缓慢加入20％蔗糖溶液。用pbs调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。用beckmansw28超速离心机，4℃，25,000rpm.(82,700g)离心2小时。小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。每管中加入100ml不含钙和镁的pbs重悬沉淀。在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个sw28离心管中。集中后的病毒悬液分装成小管，储存在-80℃。2、腺相关病毒包装(1)用于病毒包装的aav-293细胞按照5×106个细胞/10cm培养皿进行铺板。培养至80-90％汇合度，即可转染。(2)按照10μgpaav-hbb/gfp(即paav-hbb0，paav-hbb1，paav-hbb3或paav-mcs，下同)，20μgphelper质粒(图8)，10μgpaav-rc质粒(图9)，100μllipofiter的比例配制质粒预混液。转染后6h更换新鲜培养液。(3)转染后72h，收集所有细胞，用液氮反复冻融3次，收集上清液，然后使用benzonase消化，所得上清用biomiga纯化柱纯化，所得病毒分装后于-80℃保存。实施例3、病毒滴度测定慢病毒采用流式检测病毒滴度，而腺相关病毒采用q-pcr法检测病毒滴度。区别在于慢病毒的病毒滴度通常用每毫升病毒液的活性单位数(tu/ml)来表示，而腺相关病毒通常采用每毫升病毒液的病毒物理颗粒数(v.g/ml)来表示。慢病毒的病毒滴度测定的具体实验操作方法：1、ht1080细胞按照1.5×105个细胞/3ml/孔密度接种至6孔板中。37℃培养24h。2、吸弃原培养基，补加0.5ml含5％fbs的dmem完全培养基(含8μg/mlpolybrene)，按照0、6.25、12.5、25、50、100μl梯度滴加浓缩plv-egfp病毒液。37℃培养1h，补加2ml培养基/孔，期间每间隔15min，摇动混匀。继续培养2天。3、流式测定慢病毒plv-egfp滴度：2mlpbs清洗感染后ht1080细胞残留培养基，加入0.1ml胰酶/孔，消化细胞，0.5ml完全培养基终止消化后离心收集，一部分细胞留存提取dna，剩余细胞用facsbuffer洗涤2次。流式上机测定plv-egfp病毒感染阳性率(％)。根据病毒感染阳性率，计算plv-egfp病毒滴度(每毫升病毒液的活性单位数，tu/ml)。计算公式为：病毒滴度(tu/ml)＝初始细胞数×阳性率(％)/病毒液体积(ml)。4、q-pcr法测定慢病毒plv-hbb0-3质粒(即plv-hbb0，plv-hbb1，plv-hbb2或plv-hbb3，下同)拷贝数和计算滴度：提取各组ht1080细胞dna，检测a280吸光值和a260/a280比值。分别根据载体骨架序列wpre基因设计引物，用不同拷贝数的plv-egfp标准质粒作为模板，检测其ct值。根据质粒拷贝数和ct值的关系绘制标准曲线(图10中a)。以200ng的感染了plv-hbb0-3质粒ht1080细胞的基因组dna为模板，q-pcr测定plv-hbb0-3感染ht1080细胞后的wpre的ct值。根据图10中a所示的标准曲线，已知plv-hbb0-3质粒感染后基因组内wpre的ct值，可以计算基因组中plv-hbb0-3质粒拷贝数(copynumber)。根据plv-egfp总质粒拷贝数和病毒滴度的关系，绘制标准曲线(图10中c)。可以看到，病毒的滴度和载体质粒拷贝数之间存在较好的线性关系(r2＝0.9977)，由于plv-hbb0-3几个病毒没有gfp标签，因此需要通过上述的拷贝数和滴度的关系，根据q-pcr检测载体dna的ct值，换算出几个病毒的滴度。plv-hbb0-3病毒滴度的计算方法为：ht1080细胞按照1.5×105个细胞/3ml/孔密度接种至6孔板，37℃培养24h。吸弃原培养基，加0.5ml含5％fbs的dmem完全培养基(含8μg/mlpolybrene)，按照0、6.25、25μl梯度滴加浓缩plv-hbb0-3病毒液，37℃培养1h。收集以上各组ht1080细胞，提取基因组dna，检测a280吸光值和a260/a280比值。以200ng基因组dna为模板，q-pcr法测定各组plv-hbb0-3感染ht1080细胞后wpre的ct值。根据图10中a和图10中c的标准曲线换算出plv-hbb0-3病毒的滴度(tu/ml)。qpcr引物序列为：wpre-l：5’-tggattctgcgcgggac-3’；wpre-r：5’-gaaggaaggtccgctggatt-3’。腺相关病毒paav-gfp/hbb滴度测定方法：用定量pcr的方法测定腺相关病毒paav-gfp，paav-hbb0，paav-hbb1，paav-hbb3的滴度。具体方法按照现有技术，详见“许瑞安等，一种测定重组腺相关病毒滴度的定量pcr方法，专利号：201310046098.x。”测得的慢病毒plv-gfp，plv-hbb0，plv-hbb1，plv-hbb2，plv-hbb3滴度分别为2.5×108tu/ml，3.1×108tu/ml，2.86×108tu/ml，1.39×108tu/ml，2.22×108tu/ml(图11中a)；腺相关病毒paav-gfp，paav-hbb0，paav-hbb1，paav-hbb3滴度分别为1.5×1012v.g./ml，1.3×1012v.g/ml，1.18×1012v.g/ml和0.93×1012v.g./ml(图11中b)。实施例4、小鼠mel细胞体外分化模型的建立和人hbb体外表达检测为了方便地根据hbb表达情况对包含不同hbb表达模块的病毒载体进行筛选，申请人建立小鼠红白血病细胞(mel)体外诱导分化模型，并且用流式细胞术和q-pcr法检测人hbb在mel细胞中mrna和蛋白水平的表达。以下以慢病毒为例，说明具体实验操作方法：1、慢病毒感染mel细胞和体外诱导分化(1)病毒感染mel细胞前一天，用终浓度为15μg/ml的retronectin包被24孔培养板，每孔250μl。避光，4℃过夜备用。(2)吸弃封闭液。用hbss洗板，每孔250μl，洗板一次。(3)病毒感染：吸弃洗板液，新鲜病毒液加入孔内，每孔加1×106tu慢病毒液，32℃，2000rpm，离心2h，弃去上清液。(4)用1640完全培养基调整mel细胞浓度为2.5×104/ml，每孔加入2ml细胞悬液，1000rpm离心1min，37℃，5％co2培养2天。(5)1500rpm5min收集病毒感染的mel细胞，吸弃上清。用含2％dmso的1640完全培养基调整细胞浓度至5×104/ml。(6)取2ml细胞悬液接种于24孔板，使每孔细胞数量达到1×105。在37℃5％co2条件下培养4天，诱导mel细胞分化。(7)另设低氧诱导分化组，细胞置于低氧培养箱中，在37℃，5％co2，0.5％o2条件下培养4天。(8)收集分化后的mel细胞，1500rpm5min离心，去上清。用于人hbb表达检测。2、流式检测mel细胞中人hbb蛋白表达(1)加入200μlfacsbuffer重悬mel细胞，1500rpm5min，弃上清。(2)加入细胞固定-破膜液160μl，混匀后4℃避光孵育20min。(3)facsbuffer洗1次，加入fitc-anti-humanhbb(biolegend，1:200)20μl，4℃避光孵育30min。(4)加入200μlfacsbuffer重悬细胞，流式上机测定fitc阳性率(用标记fitc的hbb抗体检测，阳性率与hbb表达水平呈正比)。3、q-pcr检测mel细胞中质粒拷贝数(vcn)用不同滴度的慢病毒提取各组mel细胞基因组dna，检测a280吸光值和a260/a280比值。以200ng基因组dna为模板，检测mel细胞中小鼠alb基因和载体骨架wpre的ct值。按照实施例1的方法从ncbi数据库中获取小鼠alb基因序列(geneid:11657)，参照实施例2的方法将小鼠alb基因插入plv-egfp慢病毒载体。制备包含小鼠alb基因的标准质粒(plv-malb)。q-pcr测定不同拷贝数plv-malb对应alb基因的ct值并制作标准曲线(图10中b)。同时参照实施例3中的wpre基因和ct值的标准曲线，已知plv-hbb/gfp病毒感染后wpre的ct值，可以计算总的hbb基因质粒拷贝数(copynumber)，以alb作为内参，进一步计算单个mel细胞中的平均质粒拷贝数(vcn)。计算公式为：vcn＝plv-hbb/gfp质粒拷贝数/alb基因拷贝数。不同hbb表达模块基因转导的mel细胞中hbb的vcn各不相同。高低次序依次为hbb0>hbb1>hbb2>hbb3(图10中d)。4、mel细胞中人和小鼠hbb基因表达检测(1)总rna提取：用trizol法提取mel细胞总rna。(2)rna反转录：用thermo公司的superscriptivreversetranscriptase反转录试剂盒进行rna反转录和cdna合成。(2)以步骤(2)中提取cdna为模板，β-actin为内参，q-pcr测定人hbb、小鼠hbb的mrna相对表达量，以及人hbb相对小鼠hbb的mrna相对表达量。q-pcr的引物序列如下：humanhbb-rt-l：5’-tgctgttatgggcaacccta-3’；humanhbb-rt-r：5’-ccaggagcctgaagttctca-3’。mouseβ-actin-rt-l：5’-ttactgctctggctcctagc-3’；mouseβ-actin-rt-r：5’-ccaccgatccacacagagta-3’。q-pcr检测人hbb基因mrna相对小鼠hbb基因mrna表达水平为hbb2>hbb3>hbb1>hbb0(图12中a)。步骤2中，流式检测人hbb蛋白表达水平为hbb3>hbb2>hbb1>hbb0(图12中b)。从实验结果看出，同时安装mlcr和h560的hbb表达模块(hbb3)具有最低的拷贝数和最高的人hbb蛋白表达水平。选用mlcr而没有h560的hbb表达模块(hbb1)，hbb表达水平较低。hbb2的人hbb基因mrna表达水平虽然较高，但是人hbb蛋白表达水平不如hbb3，说明hbb3具有ires活性的翻译增强子增强了蛋白质合成效率。说明hbb3具有ires活性的翻译增强子增强了hbb基因表达效率。另外，在低氧环境下诱导，hbb2和hbb3的mrna表达水平略有下降，但是hbb2的蛋白表达水平下降明显。相对而言，hbb3的蛋白水平下降程度不如hbb2(图12中b)，说明hbb3的ires序列具有抵抗低氧环境，促进人hbb表达的作用。实施例5、小鼠骨髓干细胞的体外转导、细胞移植和人hbb体内表达检测1、小鼠骨髓干细胞分离(1)5-6周龄雌性c57bl/6小鼠。颈椎脱臼法处死小鼠，75％酒精浸泡5s。分离股骨和胫骨，除去肌肉。(2)放置于含10mlxvivo培养基的10cm培养皿，xvivo培养基冲洗股骨和胫骨，用10ml注射器吸取新的培养基，针头插入骨腔中，冲出细胞。(3)收集细胞悬液，1600rpm离心10min，吸弃上清。(4)加入3-5倍体积红细胞裂解液，室温静置1min，1500rpm离心5min，收集细胞沉淀。(5)用10mlmacsbuffer进行重悬。用70μm滤网过滤，用5mlmacsbuffer清洗细胞滤网。(6)按照miltenyibiotech公司的lineagecelldepletionkit试剂盒说明书磁珠分选小鼠lin-骨髓干细胞。2、病毒感染小鼠骨髓干细胞(1)病毒感染lin-骨髓干细胞前一天，用终浓度为15μg/ml的retronectin包被24孔培养板，每孔250μl。避光，4℃过夜备用。(2)吸弃封闭液。用hbss洗板，每孔250μl，洗板一次。(3)吸弃洗板液，按照moi＝10进行慢病毒感染。新鲜病毒液加入孔内，每孔加1×107tu慢病毒液，32℃，2000rpm，离心2h，弃去上清液。(4)每孔加入1×106/1mllin-骨髓干细胞悬液，1000rpm2min。(5)37℃培养24h后，收集细胞。pbs洗涤一次，将细胞重悬于pbs中，使浓度达到1×106/300μl/支，用于小鼠同种异体移植。3、小鼠辐射处理和同种异体骨髓干细胞移植(1)5-6周龄雌性c57bl/6小鼠。用5gy+5gy(190cgy/min，每次5gy)辐射处理小鼠2次，间隔4h，辐射后24h内进行移植。(2)用预先分离好的同种异体骨髓干细胞经尾静脉注射至经致死辐射照射的小鼠体内。细胞量为1×106/300μl。4、外源人hbb基因在小鼠体内表达情况分析(1)细胞移植后4/8/12/16周(图13中a)，枸橼酸钠抗凝，经尾静脉采集小鼠外周血10μl。(2)细胞洗涤：facsbuffer200μl，1500rpm5min离心洗涤红细胞，重复2次。(3)20μlapc-ter119抗体(biolegend，1:200)室温孵育10min。(4)细胞洗涤：facsbuffer200μl，1500rpm5min离心洗涤红细胞，重复2次(5)0.05％戊二醛室温固定10min。(6)细胞洗涤：facsbuffer200μl，1500rpm5min离心洗涤红细胞。(7)透膜：加入0.1％tritonx-100200μl室温孵育10min。(8)细胞洗涤：facsbuffer200μl，1500rpm5min离心洗涤红细胞，重复2次。(9)加入fitc-hbb(biolegend，1:200)20μl抗体，4℃，避光孵育30min。(10)细胞洗涤：facsbuffer200μl，1500rpm5min离心洗涤红细胞，重复2次。(11)流式检测ter119/hbb细胞表达情况。流式结果表明，移植后16周时，小鼠外周血人hbb蛋白的表达水平为hbb3>hbb2>hbb0(图13中b)。5、hplc检测受体小鼠外周血人hbb的四聚体(1)细胞移植后4/8/12/16周，眼眶后取外周血50μl加入至10μl枸橼酸钠抗凝剂中，缓慢颠倒混匀。(2)取20μl小鼠抗凝血加入1.5mleppendorf管中，加入1mlpbs，12000rpm，离心5min。(3)小心吸弃上清，加入100μlddh2o，混匀，室温放置5min，1200rpm，离心5min。(4)小心吸取上清血红蛋白溶液20μl，加入至200μl流动相a中，混匀后用岛津lc-20at的polycatatmcolumns测定hbb四聚体峰。反应条件如表1所示。流动相成分如表2所示。表1hplc检测受体小鼠外周血人hbb的四聚体的反应条件时间(min)流动相a(％)流动相b(％)流速(ml/min)09281.2860401.21501001.216-2090101.2注：表中％表示体积百分含量。表2hplc检测受体小鼠外周血人hbb的四聚体的流动相成分流动相a20mmbis-tris+2mmkcn,ph6.96流动相b20mmbis-tris+2mmkcn+200mmnacl,ph6.55hplc实验结果表明，移植后16周时，小鼠体内人hbb四聚体的丰度高低顺序为hbb3>hbb2>hbb0(图13中c)。从实验结果看出，同时安装mlcr和h560的hbb表达模块(hbb3)具有最高的人hbb蛋白表达水平。<110>浙江康佰裕生物科技有限公司<120>用于表达重组人β-珠蛋白的病毒载体及其应用<130>gncln200668<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>3536<212>dna<213>artificialsequence<400>1caggcttggattcaaagctcctgactttctgtctagtgtatgtgcagtgagccccttttc60ctctaactgaaagaaggaaaaaaaaatggaacccaaaatattctacatagtttccatgtc120acagccagggctgggcagtctcctgttatttcttttaaaataaatatatcatttaaatgc180ataaataagcaaaccctgctcgggaatgggagggagagtctctggagtccaccccttctc240ggccctggctctgcagatagtgctatcaaagccctgacagagccctgcccattgctgggc300cttggagtgagtcagcctagtagagaggcagggcaagccatctcatagctgctgagtggg360agagagaaaagggctcattgtctataaactcaggtcatggctattcttattgggggtata420ggggagcagtcccatgtagtagtagaatgaaaaatgctgctatgctgtgcctcccccacc480tttcccatgtctgccctctactcatggtctatctctcctggctcctgggagtcatggact540ccacccagcaccaccaacctgacctaaccacctatctgagcctgccagcctataacccat600ctgggccctgatagctggtggccagccctgaccccaccccaccctccctggaacctctga660tagacacatctggcacaccagctcgcaaagtcaccgtgagggtcttgtgtttgctgagtc720aaaattccttgaaatccaagtccttagagactccacgtatatgtgtatatatatatatat780attcaggaaataatatattctagaatatgtcacattctgtctcaggcatccattttcttt840atgatgccgtttgaggtggagttttagtcaggtggtcagcttctccttttttttgccatc900tgccctgtaagcatcctgctggggacccagataggagtcatcactctaggctgagaacat960ctgggcacacaccctaagcctcagcatgactcatcatgactcagcattgctgtgcttgag1020ccagaaggtttgcttagaaggttacacagaaccagaaggcgggggtggggcactgacccc1080gacaggggcctggccagaactgctcatgcttggactatgggaggtcactaatggagacac1140acagaaatgtaacaggaactaaggaaaaactgaagcttcgatcttcaatatgcttaccaa1200gctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatt1260tgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtc1320caactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacct1380caccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcagg1440agccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttccccccccctaacgt1500tactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccac1560catattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgag1620cattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaa1680ggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcag1740gcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataaga1800tacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaag1860agtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtacc1920ccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgag1980gttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacga2040tgataacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggt2100gcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtgggacaaggtgaacgtgga2160tgccgttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaagga2220gaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactg2280actctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttgga2340cccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaacc2400ctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacc2460tggacaacctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgcacg2520tggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttctt2580ttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacacatattgacca2640aatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatactttt2700ttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgataca2760atgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggc2820aatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggt2880ttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttggg2940ataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctct3000tatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttgg3060caaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaa3120tgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggt3180tcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatc3240tggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcgtgctagtctcccggaactatca3300ctctttcacagtctgctttggaaggactgggcttagtatgaaaagttaggactgagaaga3360atttgaaaggcggctttttgtagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcatagg3420cccaccccaaatggaagtcccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaaga3480gatcagaggtctgctggctcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgca3536<210>2<211>4434<212>dna<213>artificialsequence<400>2cctcaagatgataacttttattttctggacttgtaatagctttctcttgtattcaccatg60ttgtaactttcttagagtagtaacaatataaagttattgtgagtttttgcaaacacagca120aacacaacgacccatatagacattgatgtgaaattgtctattgtcaatttatgggaaaac180aagtatgtactttttctactaagccattgaaacaggaataacagaacaagattgaaagaa240tacattttccgaaattacttgagtattatacaaagacaagcacgtggacctgggaggagg300gttattgtccatgactggtgtgtggagacaaatgcaggtttataatagatgggatggcat360ctagcgcaatgactttgccatcacttttagagagctcttggggaccccagtacacaagag420gggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagcc480atgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatg540gcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctct600gtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagaga660ctctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttatt720ttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaata780ttttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacata840cactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgag900aaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaa960atgatttccaatggctctcatttcaatacaaaatttccgtttattaaatgcatgagcttc1020tgttactccaagactgagaaggaaattgaacctgagactcattgactggcaagatgtccc1080cagaggctctcattcagcaataaaattctcaccttcacccaggcccactgagtgtcagat1140ttgcatgcacagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccag1200acctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggat1260cagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaa1320gaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaatt1380ttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtc1440tatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggccc1500agatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggt1560ggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatggga1620aaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcc1680cctatacccccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctat1740aaagtaagagtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgc1800acactctctggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatgtatgg1860gtcagtggtctcaatgtagcaggcaagttccagaagatagcatcaaccactgttagagat1920atactgccagtctcagagcctgatgttaatttagcaatgggctgggaccctcctccagta1980gaaccttctaaccaggggaggcggaggttgcagtgagctgagatcgtgccactgcactcc2040agcctgggggacagagcacattataattaactgttattttttacttggactcttgtgggg2100aataagatacatgttttattcttatttatgattcaagcactgaaaatagtgtttagcatc2160cagcaggtgcttcaaaaccatttgctgaatgattactatactttttacaagctcagctcc2220ctctatcccttccagcatcctcatctctgattaaataagcttcagtttttccttagttcc2280tgttacatttctgtgtgtctccattagtgacctcccatagtccaagcatgagcagttctg2340gccaggcccctgtcggggtcagtgccccacccccgccttctggttctgtgtaaccttcta2400agcaaaccttctggctcaagcacagcaatgctgagtcatgatgagtcatgctgaggctta2460gggtgtgtgcccagatgttctcagcctagagtgatgactcctatctgggtccccagcagg2520atgcttacagggcagatggcaaaaaaaaggagaagctgaccacctgactaaaactccacc2580tcaaacggcatcataaagaaaatggatgcctgagacagaatgtgacatattctagacgat2640cttcaatatgcttaccaagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggagg2700atgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggag2760ggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacgg2820ctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactccc2880aggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattg2940cttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgc3000atctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtgggacaaggtgaacgtggatg3060ccgttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggaga3120ccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgac3180tctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacc3240cagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccct3300aaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctg3360gacaacctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtg3420gatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttctttt3480ctatggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacacatattgaccaaa3540tcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatactttttt3600gtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaat3660gtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaa3720tagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggttt3780catattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggat3840aaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctctta3900tcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggca3960aagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatg4020ccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttc4080ctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctg4140gattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcgtgctagtctcccggaactatcact4200ctttcacagtctgctttggaaggactgggcttagtatgaaaagttaggactgagaagaat4260ttgaaaggcggctttttgtagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcataggcc4320caccccaaatggaagtcccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaagaga4380tcagaggtctgctggctcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgca4434<210>3<211>2976<212>dna<213>artificialsequence<400>3caggcttggattcaaagctcctgactttctgtctagtgtatgtgcagtgagccccttttc60ctctaactgaaagaaggaaaaaaaaatggaacccaaaatattctacatagtttccatgtc120acagccagggctgggcagtctcctgttatttcttttaaaataaatatatcatttaaatgc180ataaataagcaaaccctgctcgggaatgggagggagagtctctggagtccaccccttctc240ggccctggctctgcagatagtgctatcaaagccctgacagagccctgcccattgctgggc300cttggagtgagtcagcctagtagagaggcagggcaagccatctcatagctgctgagtggg360agagagaaaagggctcattgtctataaactcaggtcatggctattcttattgggggtata420ggggagcagtcccatgtagtagtagaatgaaaaatgctgctatgctgtgcctcccccacc480tttcccatgtctgccctctactcatggtctatctctcctggctcctgggagtcatggact540ccacccagcaccaccaacctgacctaaccacctatctgagcctgccagcctataacccat600ctgggccctgatagctggtggccagccctgaccccaccccaccctccctggaacctctga660tagacacatctggcacaccagctcgcaaagtcaccgtgagggtcttgtgtttgctgagtc720aaaattccttgaaatccaagtccttagagactccacgtatatgtgtatatatatatatat780attcaggaaataatatattctagaatatgtcacattctgtctcaggcatccattttcttt840atgatgccgtttgaggtggagttttagtcaggtggtcagcttctccttttttttgccatc900tgccctgtaagcatcctgctggggacccagataggagtcatcactctaggctgagaacat960ctgggcacacaccctaagcctcagcatgactcatcatgactcagcattgctgtgcttgag1020ccagaaggtttgcttagaaggttacacagaaccagaaggcgggggtggggcactgacccc1080gacaggggcctggccagaactgctcatgcttggactatgggaggtcactaatggagacac1140acagaaatgtaacaggaactaaggaaaaactgaagcttcgatcttcaatatgcttaccaa1200gctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatt1260tgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtc1320caactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacct1380caccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcagg1440agccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgac1500acaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggaga1560agtctgccgttactgccctgtgggacaaggtgaacgtggatgccgttggtggtgaggccc1620tgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcat1680gtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtc1740tattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcc1800tttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggc1860aagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacc1920tttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagg1980gtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgt2040cataggaaggggataagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatt2100tgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaat2160actttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgca2220ccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatctctgcata2280taaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagc2340tacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggataaggctggattattctga2400gtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagctcc2460tgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattcaccccaccag2520tgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggctaatgccctggcccacaagtatc2580actaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtcca2640actactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaa2700acatttattttcattgcgtgctagtctcccggaactatcactctttcacagtctgctttg2760gaaggactgggcttagtatgaaaagttaggactgagaagaatttgaaaggcggctttttg2820tagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcataggcccaccccaaatggaagtcc2880cattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaagagatcagaggtctgctggctc2940ccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgca2976<210>4<211>1798<212>dna<213>artificialsequence<400>4cgatcttcaatatgcttaccaagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaag60gaggatgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagag120ggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggt180acggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctac240tcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatct300attgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg360gtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtgggacaaggtgaacgtg420gatgccgttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaag480gagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcac540tgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttg600gacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaa660ccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctca720cctggacaacctcaagggcacctttgcccagctgagtgagctgcactgtgacaagctgca780cgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttc840ttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataagtaacagggtacacatattgac900caaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatactt960ttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctttcagggcaataatgata1020caatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaag1080gcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagag1140gtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttg1200ggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacct1260cttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcacttt1320ggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggct1380aatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaag1440gttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagca1500tctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcgtgctagtctcccggaactat1560cactctttcacagtctgctttggaaggactgggcttagtatgaaaagttaggactgagaa1620gaatttgaaaggcggctttttgtagcttgatattcactactgtcttattaccctgtcata1680ggcccaccccaaatggaagtcccattcttcctcaggatgtttaagattagcattcaggaa1740gagatcagaggtctgctggctcccttatcatgtcccttatggtgcttctggctctgca1798<210>5<211>147<212>prt<213>artificialsequence<400>5metvalhisleuthrprogluglulysseralavalthralaleutrp151015asplysvalasnvalaspalavalglyglyglualaleuglyargleu202530leuvalvaltyrprotrpthrglnargphephegluserpheglyasp354045leuserthrproaspalavalmetglyasnprolysvallysalahis505560glylyslysvalleuglyalapheseraspglyleualahisleuasp65707580asnleulysglythrphealaglnleusergluleuhiscysasplys859095leuhisvalaspprogluasnpheargleuleuglyasnvalleuval100105110cysvalleualahishispheglylysgluphethrproprovalgln115120125alaalatyrglnlysvalvalalaglyvalalaasnalaleualahis130135140lystyrhis145当前第1页12