编码蜘蛛多肽P1的核酸及在制备抗弓形虫的药物中的应用的制作方法

本发明属于多肽药物研发技术领域，具体涉及一种编码蜘蛛多肽p1的核酸及在制备抗弓形虫的药物中的应用。

背景技术：

弓形虫(toxoplasmagondii)是一种单细胞真核寄生性原虫，广泛寄生于人和各种温血动物，由它所引起的弓形虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病；全球大约有1/3的人口感染弓形虫。虽然我国弓形虫的人群平均感染率大约为7.9％，但是随着我国饲养宠物家庭数量的增多，人们饮食习惯的改变，弓形虫病的感染率有急剧上升的趋势。孕妇感染弓形虫后，可通过胎盘垂直把虫体传给胎儿，从而可致流产、早产、畸胎和死胎，对我国的优生优育工作造成严重影响。在免疫功能严重受损时，弓形虫脑炎是艾滋病等患者最常见的机会性疾病，往往引发致死性病变。家畜也受到弓形虫病的严重威胁，家畜的弓形虫感染率为10％-50％，这会给畜牧业造成重大损失。目前还没有预防弓形虫病的疫苗，治疗弓形虫病的药物主要有磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、螺旋霉素、阿奇霉素、青蒿素、蒿甲醚等，但是仍然存在可选药物少、治疗周期长、复发率高、药物毒副作用大、产生抗药性等难题，特别是目前尚无杀灭弓形虫包囊内缓殖子和清除包囊的药物，这是抗弓形虫药物研发的重点和难点。

p1是从蜘蛛(lycosacoelestis)毒液中分离的一种由24个氨基酸组成的分子量为2900.37da，等电点为10.48的碱性线性多肽，包含8个赖氨酸且没有半胱氨酸残基。p1的生物学活性及其在抗弓形虫方面的作用还未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的空白，本发明提供一种编码蜘蛛多肽p1的核酸及在制备抗弓形虫的药物中的应用，目的是提供一种新的多肽在制备抗弓形虫的药物中的用途，以期获得所述的核酸分子编码蜘蛛多肽p1。

所述的核酸分子，编码序列由seq1所示核酸序列构成，为：atgaaaattaagtggtttaaagcaatgaaatctatagcaaaattcatcgcaaaagatcagctgaagaaacatctttga。

所述的蜘蛛多肽p1包括seq2所示氨基酸序列，在c末端残基有酰胺化修饰，为：kikwfkamksiakfiakdqlkkhl-conh2。

蜘蛛多肽p1用于制备抗弓形虫的药物的用途，能够降低弓形虫速殖子活性，抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞，抑制弓形虫速殖子在宿主细胞中的繁殖，控制弓形虫感染，减轻急性弓形虫病产生炎症所导致对宿主细胞的损害，直接导致弓形虫虫体解体和重要细胞器结构的改变。

所述的蜘蛛多肽p1是通过fmoc固相化学合成法合成的，利用高效液相色谱法进行纯化。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

本发明中蜘蛛多肽p1用于制备抗弓形虫的药物，能够降低弓形虫速殖子活性，抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞，抑制弓形虫速殖子在宿主细胞中的繁殖，控制弓形虫感染，减轻急性弓形虫病产生炎症所导致对宿主细胞的损害，直接导致弓形虫虫体解体和重要细胞器结构的改变。

附图说明

图1是本发明实施例制备的蜘蛛多肽p1的分子量质谱鉴定图；

图2是本发明实施例中不同浓度的蜘蛛多肽p1(2.5-40μμ)溶液分别和弓形虫速殖子共同孵育2h后切片的显微荧光图；

图3是本实施例的蜘蛛多肽p1在mtt实验中对人包皮成纤维细胞(hff)的细胞毒性作用图；

图4是本发明实施例的蜘蛛多肽p1抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞hff实验图；

图5是本发明实施例的蜘蛛多肽p1抑制弓形虫速殖子在宿主细胞hff中的繁殖实验图；

图6是本发明实施例的蜘蛛多肽p1的噬斑实验图；

图7是本发明的实施例的蜘蛛多肽p1对感染弓形虫的hff细胞分泌白介素-6和白介素-8的影响；

图8是本发明实施例的蜘蛛多肽p1干预弓形虫速殖子后的扫描电镜超微表膜构象图；

图9是本实施例的蜘蛛多肽p1干预弓形虫速殖子后的透射电镜观察其超微内部结构图。

具体实施方式

本发明实施例中编码蜘蛛多肽p1的基因序列如seq1所示，为：

atgaaaattaagtggtttaaagcaatgaaatctatagcaaaattcatcgcaaaagatcagctgaagaaacatctttga。

所述的蜘蛛多肽p1的氨基酸序列如seq2所示，为：

kikwfkamksiakfiakdqlkkhl-conh2，c末端残基有酰胺化修饰。

本发明实施例中蜘蛛多肽p1的合成及纯化：

通过fmoc固相化学合成法合成多肽p1，利用高效液相色谱法进行纯化，并通过质谱分析，检验其纯度达到98％以上，如图1所示，ms分子量鉴定为2900.37da(图1)。

实施例

本发明实施例将蜘蛛多肽p1用于制备抗弓形虫的药物的药效进行检测，包括以下指标：

1.对弓形虫速殖子活力的影响

用不同浓度的p1(2.5-40μμ)溶液分别和弓形虫速殖子共同孵育2h后，做成切片，置于荧光显微镜下观察各组荧光强度。设感染后仅培基处理组(dmem)为阴性对照组，可观察到阴性对照组荧光强度最强，p1各组随着作用浓度的增加荧光强度逐渐减弱，20和40μμ的p1处理组荧光几乎不可见(图2)。

实验结果表明本实施例的蜘蛛多肽p1能够降低弓形虫速殖子活性，且杀灭效果呈浓度依赖性递增。

2.mtt实验

采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)法，实验原理主要为：在活细胞的线粒体内存在着琥珀酸脱氢酶，它能够将外源性的黄色mtt溶液还原成不溶于水的紫蓝色结晶甲臢并沉积在细胞内，而死细胞的线粒体无此酶，因此不能使mtt还原，在一定细胞数目范围内，mtt结晶的形成与细胞数目成正相关，可用酶标仪在490nm或570nm波长处检测细胞的吸光度，并根据所测吸光度值(od值)来判断所剩活细胞的数目，od值越大所对应的细胞活性便越强；

(1)将培养瓶中的hff细胞进行消化并计数，按1×10⁵个/孔接种于96孔板中，置于细胞培养箱中过夜，培养条件：37℃5％co2；

(2)待细胞增殖至80％左右后，弃上清，pbs清洗3次，随后加入不同浓度的p1(0-500μg/ml)，每个浓度3个复孔，将96孔板放入37℃5％co2的细胞培养箱中孵育24h；

(3)将5×mtt用dmso稀释成1×备用；

(4)取出96孔板，弃去上清，用pbs清洗3次，每孔加入50μl1×mtt溶液，置于37℃温箱中孵育4h，使得mtt还原成甲臢；

(5)从温箱中取出96孔板，每孔加入150μldmso溶液溶解甲臢，将板放在摇床上摇10min；

(6)将板置于酶标仪上，检测每孔在570nm处的吸光度(od值)；

(7)对od值进行处理并分析结果，算出细胞存活率，细胞存活率％＝(实验组od值/空白对照组od值)×100％，p1对细胞的抑制率(即细胞毒性作用)＝1-细胞存活率。如图3所示，即为p1对hff的细胞毒性作用，ic50＝30.29μμ。

3.对弓形虫速殖子侵入率的影响

用不同浓度的p1预处理弓形虫速殖子，培养时间为2小时，磺胺嘧啶(sfz)作为阳性对照药。然后离心去除药物后，分别感染24孔板中已贴壁的hff细胞(弓形虫与宿主细胞的比值为20:1)，细胞培养2小时后，弃每孔中培养基，用pbs洗2遍；吉姆萨染色；在放大40×10倍的光镜下随机计数200个细胞中，数出有多少个细胞感染了弓形虫，即为弓形虫的侵入率，该实验重复三次。感染后仅加dmem处理组为阴性对照组，磺胺嘧啶为阳性对照组(n＝3，*p﹤0.05；**p﹤0.01；***p﹤0.001与阴性对照组比)，如图4所示，1.25μμ的p1就具有明显的抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞hff。

4.对弓形虫速殖子繁殖力的影响

弓形虫速殖子加入到装有盖玻片的单层人包皮成纤维细胞hffs的培养皿中(弓形虫与宿主细胞的比值为20:1)，培养2小时后，弃去培养基，去除未进入宿主细胞的弓形虫速殖子。分别用不同浓度的p1处理已感染弓形虫的宿主细胞，磺胺嘧啶(sfz)组作为阳性对照组，培养24或48小时后，取盖玻片染色镜检。计算100个纳虫泡内的虫体总数，同时分别记录含有1、2、4、8、16、32、64个弓形虫速殖子的纳虫泡数目，然后进行统计学分析，抑制率＝(对照组繁殖率-实验组繁殖率)÷对照组繁殖率，阴性对照组为弓形虫感染后不加p1处理组(dmem)，该实验重复三次。

吉姆萨染色后，通过光学显微镜观察发现，空白对照组纳虫泡中含较多的速殖子，而10μμ的p1处理组纳虫泡中含较少的速殖子(箭头所指为纳虫泡里的弓形虫速殖子)(图5b，d)；同时，采用单因素方差分析(one-wayanova)统计，干预24小时10μμ(图5a)或干预48小时5μμ(图5c)的p1明显抑制了弓形虫速殖子在宿主细胞hff中的繁殖。针对纳虫泡中速殖子的个数，采用wilcoxon秩和检验法统计发现，如图5e-f所见，感染弓形虫的hff细胞用化合物干预24小时，p1(20μm)组中仅含有1个速殖子的纳虫泡数目是最多的，含有16个速殖子的纳虫泡数目最少；干预48小时，p1(20μm)组中仅含有1个速殖子的纳虫泡数目也最多，sfz和p1(10μm和20μm)组中不含有64个速殖子的纳虫泡，含有32个速殖子的纳虫泡数目最少的是p1(10μm)组。而阴性对照组(dmem)的结果恰好相反，含有1个速殖子的纳虫泡数目最少，含有16(干预24小时)和64(干预48小时)个速殖子的纳虫泡数目最多(n＝3，*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001与阴性对照组比)。这些结果说明，多肽p1抑制弓形虫速殖子的繁殖作用呈现浓度依赖性和时间依赖性。

5.噬斑实验

噬斑实验可以同时反映弓形虫的侵袭力和繁殖力，斑块的数量通过直接计数确定，而斑块的像素面积通过adobephotoshopcs7软件的magicwand工具量化。图6a中阴性对照组(dmem)和p1(10μm)组形成了肉眼可见白色斑块，而sfz(400μm)和空白对照组无斑块形成。图6b,c中数据显示sfz(400μm)组无斑块(***p<0.001)；与阴性对照组相比(斑块数目：mean＝38，sd＝8.72；斑块面积:mean＝983.3，sd＝124.7)，p1(10μm)组斑块面积显著下降(斑块数目：mean＝30，sd＝5.29；斑块面积:mean＝680.0，sd＝79.08)(**p<0.01)；而p1(10μm)组斑块数目降低不明显。这些数据表明，p1和sfz均能控制弓形虫感染，但sfz在此实验中抑制效果更突出。

6.蜘蛛多肽p1对感染弓形虫的hff细胞分泌白介素-6和白介素-8的影响

hff细胞感染弓形虫速殖子后，用10μμ的p1作用48小时后，提取总rna，然后逆转录为cdna，通过qrt-pcr，检测白介素-6(il-6)和白介素-8(il-8)mrna的相对表达量。对照组为感染弓形虫速殖子后的hff细胞(t.g)，未做处理的hff细胞(-)，用p1处理的hff细胞(p1)，用p1处理已感染弓形虫速殖子的hff细胞(p1+t.g)。

弓形虫速殖子感染宿主细胞后，诱导宿主细胞产生大量的致炎因子白介素-6和白介素-8。当用蜘蛛多肽p1处理感染了弓形虫速殖子的宿主细胞后，致炎因子白介素-6和白介素-8的分泌受到明显的抑制，如图7所示(n＝3，*p﹤0.05，**p﹤0.01，***p﹤0.001与对照组比)，表明p1可能有助于减轻急性弓形虫病产生炎症所导致对宿主细胞的损害。

7.p1对弓形虫速殖子表面构像的影响

通过扫描电镜(sem)观察用p1处理后的弓形虫速殖子的超微结构，看其表膜结构是否完整或改变。根据先前报道的方法操作，实验步骤如下：

(1)收集刚涨破细胞游离出来的弓形虫速殖子于ep管中，并置于离心机中离心(3000转/min，10min)。吸弃上清液，ep管中加入1mlpbs缓冲液，用微量移液枪吹打沉淀，使弓形虫悬液混匀。

(2)再往ep管中加入p1溶液，使其终浓度为10μm；对照组加dmem溶液。

(3)常温下多肽分子和弓形虫相互作用2小时后，将ep管置于离心机中离心(3000转/min，10min)，吸弃上清液(除去反应溶液)。沉淀用pbs缓冲液漂洗2遍。

(4)然后加入4％戊二醛溶液，置于4℃冰箱中过夜。

(5)弓形虫样本采用梯度脱水：分别在30％，50％，70％，90％，95％乙醇中脱水一次，最后在100％酒精中脱水3次，每次10min。

(6)用临界点干燥法对样品进行干燥。

(7)用金属镀膜法将样品表面镀一层金。

(8)最后在扫描电镜下观察弓形虫表面结构。

p1干预速殖子后，通过扫描电镜观察其超微表膜构象：对照组中的速殖子形态正常，大小均一，虫体表面光滑、完整、具有典型新月形态结构(一端尖锐，另一端圆顿)。虫体中间部位还可见微孔，它是胞吞作用最主要的入口(图8a,b，箭头所示为微孔)。而p1组显微照片显示，弓形虫失去了新月形状，虫体大小不一，表面形成了深脊，凹痕和褶皱(图8c,d)。还有一部分速殖子因虫体破坏而崩解(图8e，星号所示为崩解速殖子)。另外还有一些速殖子虫体膨胀肿大(图8f，对勾所示为膨胀速殖子)。

8.多肽p1对弓形虫速殖子内部器官结构的影响

(1)收集刚涨破细胞游离出来的弓形虫速殖子于ep管中，并置于离心机中离心(3000转/min，10min)。吸弃上清液，ep管中加入1mlpbs缓冲液用微量移液枪吹打沉淀，使弓形虫悬液混匀。

(2)再往ep管中加入p1溶液，使其终浓度为10μm；对照组加dmem溶液。

(3)常温下多肽分子和弓形虫相互作用2h后，将ep管置于离心机中离心(3000转/min，10min)，吸弃上清液(除去反应溶液)。沉淀用pbs缓冲液漂洗2遍。

(4)再将ep管置于离心机中离心(3000转/min，10min)，沉淀加入4％戊二醛溶液固定。

(5)然后将样品置于100mm二甲胂酸盐缓冲液中洗涤两次，并在含有1％四氧化锇的100mm二甲胂酸中固定2小时(4℃)。

(6)样本在离心机中离心后，沉淀在蒸馏水中漂洗3遍，然后梯度脱水：分别在30％，50％，70％，90％，95％乙醇中脱水一次，最后在100％酒精中脱水3次，每次10min。

(7)将样品包埋在环氧树脂中，并使其在60℃下聚合48h。

(8)再将包埋树脂用超薄切片机切片，并用双醋酸铀和柠檬酸铅染色。

(9)最后置于透射电镜下观察。

p1干预速殖子后，通过透射电镜观察其超微内部结构：显微照片显示了对照组速殖子的纵向和横向视图(图9a)。对照组速殖子保持了正常的形态和细胞学特征，如完整的细胞膜(cm)，细胞核(n)，核膜(nm)，圆锥体(c)，微线体(mn)，致密颗粒(dg)，脂质体(lb)和高尔基复合体(go)。同时保持着新月形的尖形前端和顿圆的后端，它们都具有完整的核膜和细胞膜。还可以清晰地看见虫体内的线粒体，些许致密颗粒，核呈椭圆形状，染色质结构也正常。此外，微线体和圆锥体整齐排列在速殖子头部(图9b)。而p1组速殖子呈现出虫体解体和重要细胞器结构的改变，包括染色质浓缩和细胞质空泡化。另外寄生虫的细胞质体积减少，且大部分虫体完全丧失正常细胞结构，细胞膜、致密颗粒、棒状体、圆锥体、线粒体和微丝消失，仅留下均质的染色质以及被破坏的核膜(图9c-f)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中南大学

<120>编码蜘蛛多肽p1的核酸及在制备抗弓形虫的药物中的应用

<141>2020-02-09

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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