一种多肽聚合物毛细管等电聚焦分析方法与流程

本发明涉及药物分析领域,具体涉及多肽药物的分离分析领域。
背景技术：
：醋酸格拉替雷(glatirameracetate，缩写为ga)是一种人工合成多肽类混合物(相对分子量：4700-11000道尔顿)，由l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-酪氨酸和l-赖氨酸四个氨基酸所组成的随机聚合物，长为45-100个氨基酸。各氨基酸摩尔比大约为0.392-0.462，0.129-0.153，0.086-0.100，0.300-0.374。该药物由以色列药厂梯瓦制药(teva)所研发制造，商品名为于1996年获美国fda核准用于治疗多发性硬化症，目前有注射用水针和注射用冻干粉针两种产品，均用于皮下注射。醋酸格拉替雷是一个连续性很强的共聚物，其结构如下式所示：(glu，ala，lys，tyr)x·xch3cooh(c5h9no4·c3h7no2·c6h14n2o2·c9h11no3)x·xc2h4o2cas-147245-92-9对于仿制该药厂商，只能基于该药的一些固有性质来考察仿制醋酸格拉替雷与原研制剂醋酸格拉替雷的组分差异。利拉鲁肽(liraglutide)(商品名victoza)novenordisk1996年开始研发，2009年最早于丹麦上市的人glp-1(7-37)的修饰物。从结构上看liraglutide为glp-1(7-37)链上34位lys被arg取代，在26位的lys上接入经十六烷酸修饰的谷氨酰胺。glp-1经脂肪连修饰后的，增加了与白蛋白之间的亲和力，从而降低了被dpp‐ⅳ的水解速率和肾清除率，延长生物半衰期。liraglutide的生物半衰期达11～15h，每天只需给药一次皮下注射，大大提高了患者的顺应性。毛细管等电聚焦(cief)是近年来基于平板等电聚焦和毛细管电泳技术发展而来的分析方法，它利用毛细管中灌注的一系列不同等电点的两性电解质混合物在电场下形成的ph梯度，根据多肽或其他待分析物等电点的差异对其进行分离，其分离精度可达到0.1个ph单位，并克服了平板等电聚焦操作复杂、无法实现自动化、无法准确测定电荷异质体含量等缺点，因而被广泛应用于单克隆抗体药物的等电点测定和电荷异质体含量分析。与离子交换色谱相比，毛细管等电聚焦具有分析时间短、样品消耗量小、通用性强等优势，其单个样品分析时间通常是离子交换色谱的1/4，单次测试样品消耗量通常是离子交换色谱的1/10左右，且对一些电荷异质性较为复杂的样品如融合蛋白、多肽混合物样品具有更好的分离效果。尽管毛细管等电聚焦已经被广泛应用于单抗药物的质量分析，但其应用于多肽混合物药物一致性评价分析还未见报道。本发明基于本品各组分间等电点的差异，采用毛细管等电聚焦电泳对其进行分析，对比多肽的带电差异，进而分析多肽药物的一致性。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种快速测定多肽聚合物成分和差异的分析方法。该方法具有通用性强、分析周期短、数据处理简单等优点，而且适用于多肽聚合物的生产工艺开发和质量控制。一方面，本发明提供了一种多肽聚合物的分析方法，其特征在于采用毛细管等电聚焦方法，包括以下步骤：1)配制毛细管等电聚焦上样液，所述上样液为包括两性电解质、凝胶液、等电点标记物与待分析的多肽聚合物的混合液；2)将步骤1)的上样液上样于毛细管柱，在15～30℃、10～40kv下聚焦2～25min，在10～40kv迁移20～50min；并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；3)通过等电点标记物计算出多肽混合物各组分的等电点，通过各组分等电点数值；4)采用步骤1)-3)相同条件对多肽聚合物标准品进行检测，将标准品和样品的各组分等电点数值与各组分峰型进行对照。进一步地，所述凝胶液选自甲基纤维素、尿素、羟丙基甲基纤维素、甘油、蔗糖、精氨酸、亚氨基二乙酸中的一种或多种的混合物。进一步地，所述两性电解质载体选自pharmalyte2.5-5、pharmalyte3-10、pharmalyte4-6.5、pharmalyte4.2-4.9、pharmalyte4.5-5.4、pharmalyte5-6、pharmalyte5-8、pharmalyte6.7-7.7、pharmalyte8-10.5、servalyt2-4、servalyt2-9、servalyt2-11、servalyt3-4、servalyt3-5、servalyt3-6、servalyt3-7、servalyt3-10、servalyt4-5、servalyt4-6、servalyt4-7、servalyt4-9、servalyt5-6、servalyt5-7、servalyt5-8、servalyt5-9、servalyt6-7、servalyt6-8、servalyt6-9、servalyt7-9、servalyt9-11中的一种或多种的混合物(优选为pharmalyte8-10.5与另一种两性电解质载体的混合物，更优选二者的比例为1:0.5-2)；两性载体在上样液中的体积范围为1％-10％。进一步地，步骤2)中是以20-40kv下聚焦9-20min，优选是以25-30kv下聚焦9-15min。进一步地，步骤2)中是在30-40kv下迁移40-50min，优选是在30kv下迁移40-45min。进一步地，所述上样液中包含三种以上等电点标记物。进一步地，所述多肽聚合物选自醋酸格拉替雷、利拉鲁肽、杜拉鲁肽、普兰林肽等。本发明的另一个方面，提供了一种多肽聚合物药物质量检测方法，其包括以下步骤：1)配制毛细管等电聚焦上样液，所述上样液为包括两性电解质、凝胶液、等电点标记物与待分析的多肽聚合物样品的混合液；2)将步骤1)的上样液上样于毛细管柱，在15～30℃、10～40kv下聚焦2～25min，在10～40kv迁移20～50min；并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；3)通过等电点标记物计算出多肽混合物各组分的等电点，通过各组分等电点数值与各组分的峰型考察峰型也需要考察。；4)采用步骤1)-3)相同条件对多肽聚合物标准品进行检测，将标准品和样品的各组分等电点数值与各组分峰型进行对照。具体地，采用毛细管等电聚焦电泳对醋酸格拉替雷各组分和杜拉鲁肽各组分的带电情况进行分离分析，并判断试制样品与市售商品制剂(标准品)的差异。采用毛细管等电聚焦分离多肽药物(如醋酸格拉替雷、利拉鲁肽)包括如下步骤：1)将两性电解质、cief凝胶液、等电点标记物与待分析的多肽混合物样品进行混合，形成混合液；其中，凝胶液组成包括：甲基纤维素、尿素、羟丙基甲基纤维素、甘油、蔗糖、精氨酸、亚氨基二乙酸中的一种或多种，可使用自制凝胶液或商品化产品；2)将步骤1)的混合液上样于毛细管柱，在15～30℃、10～40kv下聚焦2～15min，在10～40kv迁移20～50min；并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；3)通过等电点标记物计算出多肽混合物各组分的等电点，通过各组分等电点数值与各组分的峰型考察试制样品与市售商品制剂(标准品)的差异。所述步骤1)中，两性电解质载体包括pharmalyte3-10、pharmalyte4-6.5、pharmalyte8-10.5中的一种或多种；两性载体在混合液中的体积范围为1％～10％；等电点标记物，包括：sigma公司提供的小分子等电点标记物、beckman公司提供的小分子等电点标记物或蛋白等电点标记物；其中sigma公司提供的小分子等电点标记物(小分子标记物系列)包括：pi10.4、pi9.0、pi8.4等；beckman公司提供的小分子等电点标记物(小分子标记物系列)包括：pi10.0、pi9.5、pi7.0、pi5.5pi4.1；混合液中通常包含三种或以上等电点标记物，用于计算所测样品各组分等电点。待分析的多肽混合物样品包括：试制品或对照品；其中，待分析的多肽混合物样品在混合液中的浓度范围为0.1～5mg/ml。所述步骤2)中，毛细管柱包括：agilent公司的氟涂层(fc)毛细管组件或ht毛细管组件，或beckman公司的ecap中性毛细管，或其他带有适当涂层的毛细管。所使用的毛细管总长范围在30～40cm之间(柱有效长度为柱总长减去8.5cm)，柱内径可选用25～75μm。本发明毛细管电泳的电极电压为10～50kv，优选可为20～40kv。本发明所述方法的毛细管电泳采用高压进样，压力范围为1～5bar，时间范围为50～150s。优选进样压力范围为2～3bar，时间范围为70～100s；本发明所使用的柱温范围为10～30℃，优选为15～25℃；本发明所使用检测波长优选为280nm。有益效果采用本发明的方法能够快速，准确判断两种多肽聚合物的成分是否相同。用样量少，速度快，成本低，结果准确性高。附图说明下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：附图1为实施例1分析条件分析原研品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图2为实施例1分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图3为实施例2分析条件分析原研品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图4为实施例2分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图5为实施例3分析条件分析原研品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图6为实施例3分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图7为实施例4分析条件分析原研品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图8为实施例4分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图9为实施例5分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图10为实施例5分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图11为实施例5分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。附图12为实施例5分析条件分析试制品的毛细管等电聚焦结果谱图。具体实施方式实施例1：根据表1组成配制毛细管等电聚焦上样液，置于agilent7100毛细管等电聚焦仪的自动进样器中，采用氟涂层毛细管组件(agilent/194-8111)对样品进行分析，两端到检测器窗口的距离分别是8.5cm和24.5cm。毛细管电泳系统配有外部水浴，温度设置为15℃。采用2bar高压进样100s，15℃下，25kv聚焦9min，阳极电解液为200mm磷酸，阴极电解液为300mm氢氧化钠。迁移条件为：30kv迁移45min。在280nm下进行检测，采用openlabcontrolpanel软件对所测样品等电点进行计算。试制样品与对照品各组分的等电点见表2，试制样品与对照品的电泳图谱见附图1，附图2。表1毛细管等电聚焦上样液配比试剂名称用量0.5％甲基纤维素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(3-10)6μl500mml-精氨酸10μl200mm亚氨基二乙酸5μl等电点混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl表2是对比11批原研品与4批试制样品主组分等电点数据批号pi范围原研品批次110.197-9.642原研品批次210.176-9.699原研品批次310.164-9.697原研品批次410.194-9.650原研品批次510.181-9.658原研品批次610.195-9.655原研品批次710.183-9.661原研品批次810.196-9.656原研品批次910.181-9.633原研品批次1010.203-9.654原研品批次1110.190-9.639试制品批次110.203-9.635试制品批次210.197-9.6845试制品批次310.176-9.688试制品批次410.160-9.626实施例2：根据表3组成配制毛细管等电聚焦上样液，置于agilent7100毛细管等电聚焦仪的自动进样器中，采用氟涂层毛细管组件(agilent/194-8111)对样品进行分析，两端到检测器窗口的距离分别是8.5cm和24.5cm。毛细管电泳系统配有外部水浴，温度设置为15℃。采用2.5bar高压进样80s，15℃下，30kv聚焦15min，阳极电解液为200mm磷酸，阴极电解液为300mm氢氧化钠。迁移条件为：30kv迁移40min。在280nm下进行检测，采用openlabcontrolpanel软件对所测样品等电点进行计算。试制样品与对照品的电泳图谱见附图3，附图4。表3毛细管等电聚焦上样液配比试剂名称用量0.5％甲基纤维素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(8-10.5)6μl500mml-精氨酸10μl200mm亚氨基二乙酸5μl等电点混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl实施例3：根据表4组成配制毛细管等电聚焦上样液，置于agilent7100毛细管等电聚焦仪的自动进样器中，采用氟涂层毛细管组件(agilent/194-8111)对样品进行分析，两端到检测器窗口的距离分别是8.5cm和24.5cm。毛细管电泳系统配有外部水浴，温度设置为15℃。采用2.5bar高压进样80s，15℃下，30kv聚焦15min，阳极电解液为200mm磷酸，阴极电解液为300mm氢氧化钠。迁移条件为：30kv迁移40min。在280nm下进行检测，采用openlabcontrolpanel软件对所测样品等电点进行计算。试制样品与对照品的电泳图谱见附图5，附图6。表4毛细管等电聚焦上样液配比试剂名称用量0.5％甲基纤维素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(8-10.5)：(3-10)是1:16μl500mml-精氨酸10μl200mm亚氨基二乙酸5μl等电点混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl实施例4：根据表5组成配制毛细管等电聚焦上样液，置于agilent7100毛细管等电聚焦仪的自动进样器中，采用氟涂层毛细管组件(agilent/194-8111)对样品进行分析，两端到检测器窗口的距离分别是8.5cm和24.5cm。毛细管电泳系统配有外部水浴，温度设置为20℃。采用2bar高压进样100s，20℃下，10kv聚焦8min，阳极电解液为200mm磷酸，阴极电解液为300mm氢氧化钠。迁移条件为：30kv迁移35min。在280nm下进行检测，采用openlabcontrolpanel软件对所测样品等电点进行计算。对照品与自制品的电泳图谱见附图7、附图8。表5毛细管等电聚焦上样液配比试剂名称用量1％甲基纤维素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(4-6.5)3μl500mml-精氨酸4.5μl200mm亚氨基二乙酸5μl等电点混合物3μl醋酸格拉替雷(3-8mg/ml)20μl实施例5：根据表6组成配制毛细管等电聚焦上样液，置于agilent7100毛细管等电聚焦仪的自动进样器中，采用氟涂层毛细管组件(agilent/194-8111)对样品进行分析，两端到检测器窗口的距离分别是8.5cm和24.5cm。毛细管电泳系统配有外部水浴，温度设置为20℃。采用2bar高压进样100s，20℃下，30kv聚焦11min，阳极电解液为200mm磷酸，阴极电解液为300mm氢氧化钠。迁移条件为：30kv迁移45min。在280nm下进行检测，采用openlabcontrolpanel软件对所测样品等电点进行计算。利拉鲁肽对照品与自制品及各自光照处理样品的电泳图谱见附图9、附图10、附图11、附图12。表6毛细管等电聚焦上样液配比试剂名称用量1％甲基纤维素(含有3m尿素)100μlpharmalyte(4-6.5)3μl500mml-精氨酸4.5μl200mm亚氨基二乙酸5μl等电点混合物3μl利拉鲁肽(2-3mg/ml)20μl由以上实施例可知，本发明用于分析醋酸格拉替雷、利拉鲁肽样本中各个组分的带电情况的方法是有效可行的，可以用于上述药物的对比分析与质量一致性研究。当前第1页12