一种含有保护剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种能够准确检测生物制药如抗体纯度的毛 细管凝胶电泳检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE)技术由传统凝胶电泳（gel electrophoresis)发展而来，其以高压电产生的强电场为驱动力，以微内径的石英毛细管 为分离通道。相比传统的凝胶电泳，CE具有自动化、快速、准确定量性、高分辨率等优点，很 多生物分子，例如蛋白质、多糖及核酸等都可以使用毛细管电泳来进行分析。十二烷基磺酸 钠毛细管电泳（CE-SDS)技术是在毛细管分离缓冲液中加入线性凝胶形成分子筛，加入阴 离子表面活性剂十二烷基磺酸钠 （sodium dodecyl sulfate, SDS)缓冲液至样品中使蛋白 变性，并且和蛋白质通过1 : 1.4的质量比结合，由于这种SDS结合蛋白的质荷比相同，使 得该结合蛋白在进行毛细管分离时受到的电场力也相同，但由于不同分子的大小不同，因 而在线性凝胶分子筛中迁移受到的阻力大小不同，使得迁移速率不同，从而实现表观上分 子量不同的分子得到分离。非还原型CE-SDS用碘乙酰胺处理，主要检测单克隆抗体样品中 的不同碎片、轻重链及共价结合的多聚体杂质。
[0003] 美国Beckman公司PA800+型毛细管电泳仪及配套的检测试剂盒含有以下组分：样 品缓冲液（sample buffer),凝胶缓冲液（gel buffer),清洗液（0· 1M Na0H，0. 1M HC1)，内 标（inter standard)，对照标准品（control standard)，其中样品缓冲液（sample buffer) 含有100mM Tris-HCl，1% SDS及12. 5mM碘乙酰胺。我们在使用该试剂盒中的样品缓冲液 对重组抗HER2人源化单克隆抗体（mAbl)进行非还原型CE-SDS分子大小异构分析时，发现 在Beckman厂家推荐的检测条件（70°C加热10分钟）下，得到的碎片含量（如含有一个抗体 轻链L和含有抗体重链-重链-轻链HHL的碎片）（见图1，CE-SDS主峰含量89. 5 %，碎片 含量10. 5% )明显高于使用其他方法如分子排阻色谱法（SEC-HPLC)所得到的含量（见图 2, SEC-HPLC 主峰含量 >99%，碎片含量 <0.5%)。通过文献（Taylor FR 等.Suppression of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis sample preparation aritfacts for analysis of IgG4half-antibodies. Analytical Biochemistry,2006, 353,204-208.)及我们的数据分析，这些增加的碎片杂质可能是由于抗体和SDS结合并进 行加热处理过程中形成的降解产物。使用厂家推荐的碘乙酰胺作为抑制剂能明显减少碎片 含量，但碎片含量仍明显偏高（如含有12. 5mM碘乙酰胺作为保护剂能使抗体mAbl纯度从 81 %增加到89. 5%，但继续增加碘乙酰胺浓度至37. 5mM只能使纯度增加至90. 6% )。因此， 如何找到一种能够明显降低碎片的形成，从而提高生物制药如抗体检测准确度的方法是亟 待解决的问题。
[0004] 我们发现，在含有碘乙酰胺的基础上，加入其他类型的保护剂还可以进一步提高 抗体，例如mAbl的CE-SDS检测纯度，即能够更加准确地反映出抗体药物的质量，从而完成 了本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明实际所要解决的技术问题，就是针对现有的非还原型CE-SDS检测方法的 不足，提供了一种含有保护剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒，该试剂盒能提高非还原型 CE-SDS检测抗体分子大小异构体的准确性。
[0006] 本发明采用的技术方案为：
[0007] -种含有样品缓冲液的毛细管凝胶电泳检测试剂盒，所述样品缓冲液（sample buffer)中含有一种保护剂，所述保护剂浓度为10-5000mM，优选为100-2000mM，更优选 500-1000mM〇
[0008] 其中，本发明所述保护剂能够抑制生物药如单抗由于在样品处理过程中发生降解 形成碎片（fragmentation)，该保护剂选自糖、多元醇或氨基酸。本发明中，氨基酸均为本 领域的宽泛含义，包括其可药用盐的形式。其中，所述糖可选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、 甘露糖、乳糖、麦芽糖、山梨糖、葡聚糖、糊精、环糊精、羟乙基淀粉或其组合，优选葡萄糖、蔗 糖、海藻糖或甘露糖。所述多元醇可选自甘露醇、甘油、山梨醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、 丙二醇、聚乙二醇或其组合，优选甘露醇。氨基酸可选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨 酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨 酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或其组合。
[0009] 其中，本发明所述样品缓冲液进一步含有缓冲液，所述缓冲液选自Tris缓冲液、 磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、葡萄酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、抗坏血酸缓冲液、 酒石酸缓冲液、顺丁烯二酸缓冲液、乳酸缓冲液、碳酸缓冲液、苯甲酸缓冲液、咪唑缓冲液或 氨基酸缓冲液，优选Tris缓冲液，更优选Tris-HCl缓冲液。该缓冲液的含量使得所述样品 缓冲液的pH值在3. 0-10. 0之间。
[0010] 其中，本发明所述样品缓冲液进一步含有十二烷基磺酸钠（SDS)，其含量在 0.1-5%(￥/\￥)之间，优选0.5-2%(界/\￥)，更优选1%(￥/\￥)。
[0011] 其中，本发明所述试剂盒进一步含有碘乙酰胺，其含量在l_200mM之间，优选 5-50mM之间，更优选10-30mM。其中碘乙酰胺和试剂盒中的其他组分分开单独储存，使用前 配置好混合。
[0012] 优选的，本发明所述的试剂盒中的样品缓冲液含有如下组分：
[0013] (l)Tris-HCl 缓冲液 100mM
[0014] (2)十二烷基磺酸钠（SDS) 1 % (w/w)
[0015] (3)葡萄糖或蔗糖或海藻糖或甘露醇500mM
[0016] pH 值为 9.0。
[0017] 本发明进一步提供了如上所述的样品缓冲液的制备方法，包括：将处方量的缓冲 液，优选Tris缓冲液，处方量的十二烷基磺酸钠和处方量的保护剂，优选葡萄糖，蔗糖，海 藻糖或甘露醇，溶解在适量的去离子水中，用盐酸调节pH值至3. 0-10. 0,优选9. 0,接着用 去离子水定容至500mL，得到样品缓冲液。使用时，将处方量的碘乙酰胺溶解在去离子水中， 配制成250mM的碘乙酰胺溶液，然后将待测样品用样品缓冲液稀释至lmg/ml，再与碘乙酰 胺溶液按照95yL : 5yL的比例进行混合，之后再进行抗体分子大小异构体的非还原型 CE-SDS的纯度检测。
[0018] 本发明进一步提供了如上所述的试剂盒在对抗体分子进行非还原型CE-SDS检测 时，抑制抗体分子裂解中的用途，其中，所述抗体分子优选为重组抗HER2人源化单克隆抗 体、重组人鼠嵌合抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体、重组抗白介素-6受体人源化单克隆抗 体、T-DM1、重组抗肿瘤坏死因子-a全人源单克隆抗体或重组抗⑶52人源化单克隆抗体， 更优选为重组抗HER2人源化单克隆抗体。
[0019] 本发明的有益效果为：
[0020] 使用本发明的添加了保护剂的毛细管凝胶电泳检测试剂盒，根据CE厂商Beckman 公司推荐的样品处理方法（70°C加热10分钟），可以提高毛细管电泳法检测生物制药如抗 体纯度的准确性，降低由于实验操作过程产生的检测偏差，更能反映出样品本身含有的抗 体分子大小异构体特别是碎片的实际含量。
【附图说明】
[0021] 图1未加入保护剂的重组抗HER2人源化单克隆抗体（mAbl)的非还原型CE-SDS 图谱
[0022] 图2重组抗HER2人源化单克隆抗体（mAbl)的SEC-HPLC图谱
[0023] 图3实施例2中不同类型保护剂对重组抗HER2人源化单克隆抗体（mAbl)的非还 原型CE-SDS纯度影响
[0024] 图4实施例3中不同类型保护剂对重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体 (mAb2)的非还原型CE-SDS纯度影响
[0025] 图5实施例4中不同蔗糖浓度对重组抗HER2人源化单克隆抗体（mAbl)的