蝎α‑型神经毒素的突变体及其用途的制作方法

本申请要求2016年04月22号提交的名称为“蝎α-型神经毒素的突变体及其用途”，申请号为201610251397.0的发明专利申请的优先权。

本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽的突变体及其用途，具体涉及蝎α-型神经毒素的突变体及其在制备多肽类杀虫剂中的用途。

背景技术：

我国为农业大国，害虫种类繁多，严重威胁我国粮食和其它农作物的产量。目前，我国的害虫防治主要依赖于化学类农药(如有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类等)。这些农药的持续和大量的使用，一方面造成了害虫耐药性的日益增加；同时农药残留对环境和人类健康造成影响。为了寻求高效低毒的害虫防治措施，近几年，杀虫微生物，如白僵菌和绿僵菌正日益受到重视。与化学类农药相比，杀虫微生物具有明显的优势：1)物种选择性高导致对人畜和自然环境安全无害；2)繁殖快，生产成本低；3)害虫不易产生抗药性；4)有自然传播感染的能力，在环境中存活力强，可以长期压低虫口密度；5)害虫不易产生抗药性。尽管如此，微生物杀虫剂也有两个主要的缺点：1)杀虫谱窄，只针对特定种类的害虫；2)感染的潜伏期导致杀虫效果慢，造成实质性经济损失。

电压门控钠通道(voltage-gatedna⁺channel，nav)广泛分布于昆虫和哺乳动物的肌肉、神经元、腺体、心肌的可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其活动与细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等特异性功能密切相关，也是重要的药物靶点。哺乳动物基因组编码至少9个不同亚型的电压门控钠通道，分别命名为nav1.1-nav1.9。不同亚型的钠通道分别在不同组织中表达。以人类为例，nav1.1，nav1.6和nav1.9主要在中枢和周围神经系统表达；nav1.2和nav1.3主要在大脑表达，nav1.4分布于骨骼肌；nav1.5分布于心肌；nav1.7和nav1.8主要分布于背根神经节。这些钠通道具有相似的结构构架，分成4个相似的结构域(d1-d4)，每个结构域由6个跨膜的α-螺旋(s1-s6)组成，前四个螺旋(s1-s4)为电压感受器区，s5-s6为孔形成区。

蝎是一类有毒动物，以昆虫和蜘蛛等小型节肢动物为食。条斑钳蝎(mesobuthuseupeus)是一种小型的沙漠类蝎，主要分布在我国东北以及土耳其、伊朗、俄罗斯和蒙古等部分国家，以小型昆虫(如蟋蟀和蟑螂)为食。毒液在蝎捕食和防御过程中发挥关键作用，在大多数钳蝎科(buthidae)毒液中存在蝎α-型神经毒素，是这类蝎种主要的毒性成分。

条斑钳蝎的α-型神经毒素为一个多基因家族，由超过14个的毒素成员组成，这类毒素组成了一个进化上保守的多肽家族，由大约60-76个氨基酸组成，含有4对二硫键，属于典型的半胱氨酸稳定的α-螺旋和β-折叠构架，靶向电压门控钠通道。蝎α-型神经毒素为该家族的一个亚家族分支，其成员通过与钠通道细胞外表面的受体位点3结合，延缓通道失活过程并放大峰电流。基于毒素的药理学特征和物种选择性，α-型神经毒素被分成3个功能组：1)经典α-型神经毒素；2)昆虫α-型神经毒素；3)α-like毒素。

研究表明，这类毒素能够与猎物的电压门控钠通道的受体位点相互作用，修饰通道的门控特性(激活和失活)导致猎物软瘫和死亡。作为高亲和性配体，这类毒素为研究钠通道的结构和药理学功能提供了最佳的分子工具，并且由于其独特的结构特征，长期以来它一直是结构生物学家用于研究蛋白质结构-功能关系的理想模型；另外，由于其强的杀昆虫毒性，这类毒素也被认为是设计肽类杀虫剂的有效模板。特别是作为杀虫微生物的增效剂具有诱人的前景。

但是，蝎钠通道毒素特异性作用于哺乳动物、昆虫和甲壳虫动物神经细胞的钠通道，使动物出现神经症状并导致死亡。进一步地，尽管目前已经发现了大量的α-型神经毒素，并获得了广泛的药理学和空间结构数据，但是这类毒素的物种选择性的结构和进化基础仍没有分辨。基于这两点，极大的限制了蝎钠通道毒素作为肽类杀虫剂的应用。

技术实现要素：

基于上述不足，本发明人利用定点突变，结合电生理和活体功能检测技术，系统完成了蝎α-型神经毒素中加速替代的氨基酸位点的分子解剖和功能评估。本发明人惊奇地发现，蝎α-型神经毒素的大多数正选择位点定位于毒素-钠通道受体位点的作用界面，通过对蝎α-型神经毒素正选择位点的系统性功能评估，发现了蝎α-型毒素调控物种(昆虫/哺乳动物)选择性的关键氨基酸位点，以及其在调节毒素对哺乳动物/昆虫选择性中的关键作用，其中的热点氨基酸残基的突变导致了蝎α-型神经毒素对哺乳动物钠通道毒性的不同程度直至完全丧失，而毒素的昆虫毒性得以保留甚至不同程度地加强。因此，本发明提供了一种蝎α-型神经毒素的突变体，该突变体可以高度选择性地靶向昆虫钠通道，从而可以作为肽类杀虫剂应用，并且也为进一步构建转基因的增效型微生物杀虫剂奠定基础。

一方面，本发明提供了一种蝎α-型神经毒素的突变体或其片段，其中，所述蝎α-型神经毒素的序列如seqidno：1所示，并且所述突变体或其片段的突变位点位于所述蝎α-型神经毒素的n-转角、b环和/或j环三个结构域中：

seqidno：1：ardayiakphncvyecfdafssycngvctkngaksgycqilgtygngcwcialpdnvpiripgkch。

其中，所述n-转角位于seqidno：1的第8位到第12位氨基酸、所述j环位于seqidno：1的第17位到第23位氨基酸和/或所述b环位于seqidno：1：的第39位到第47位氨基酸。

所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段相对于野生型蝎α-型神经毒素至少有一个氨基酸发生突变，所述突变包括氨基酸的取代、缺失或插入。在本发明的蝎α-型神经毒素的突变体或其片段中，可以有一个至六个氨基酸发生突变，优选地，只有一个氨基酸位点发生突变。

优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的至少一个突变的氨基酸位点位于seqidno：1所示的序列的k8、p9、e15、d18、a19、f20、s22、i40、l41、t43和/或a52处。

优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段可以包括将第八位的赖氨酸突变为丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸；

第九位的脯氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；

第十五位的谷氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；

第十八位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或精氨酸；

第十九位的丙氨酸突变为苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；

第二十位的苯丙氨酸突变为酪氨酸或色氨酸；

第二十二位的丝氨酸突变为丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甘氨酸；

第四十位的异亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

第四十一位的亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

第四十三位的苏氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸或谷氨酸；

第五十二位的丙氨酸突变为缬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。

优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的一个突变选自k8a、p9a、e15a、d18a、s22g、i40a、l41a、t43a和a52k。

本发明中所有的突变命名是基于国际上突变的命名原则，包含了三部分，突变前氨基酸-突变的氨基酸位置-突变后氨基酸，如k8a，即突变导致了第8个氨基酸由突变前的赖氨酸(k)变成了突变后的丙氨酸(a)，核苷酸突变同理。

优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的序列如seqidno：2-11中任一项所示。

更优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的序列如seqidno：7或8所示。

优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段还包括删除突变体或其片段，其中如seqidno：1所示的序列中的19和20位点被删除(δ19af20)，优选地，所述删除突变体或其片段的序列如seqidno：12所示。

另一方面，本发明提供了编码所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的dna序列和表达盒，用于转化所述序列的宿主细胞。

所述表达盒包括编码蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的dna序列和与该序列操作性相连接的启动子，该启动子是在宿主细胞中起作用的。将表达盒插入转化载体中并在转化细胞中生产蝎α-型神经毒素的突变体。然后可从宿主细胞或宿主细胞上清液中纯化获得蝎α-型神经毒素的突变体。

蝎α-型神经毒素的突变体或其片段也可通过类似定点或随机诱变的方式筛选和选择自发突变体来制得。蝎α-型神经毒素的突变体可用体外诱变或从某步骤产生的片段半合成法来制得。最后，蝎α-型神经毒素的突变体或其片段可用化学合成方法来制得。

生产蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的方法包括，用包括该表达盒的载体转化或转染宿主细胞，在允许宿主细胞表达蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的条件下培养宿主细胞。

本领域技术人员可以使用各种方法来制得编码本发明的蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的dna序列。可以使用编码基本对应野生型蝎α-型神经毒素的蛋白的dna序列作为模板dna来制得编码蝎α-型神经毒素的突变体的dna序列。编码野生型蝎α-型神经毒素的dna序列如seqidno：13所示。

seqidno：13：

gctcgtgatgcttatattgccaagccccataactgtgtatacgaatgttttgatgcatttagtagttattgcaacggtgtatgtaccaagaacggtgctaagagtggctattgccaaatcctcggtacatatggaaatggttgctggtgcatagcgttgcccgataatgtaccgattagaataccaggaaaatgccat

本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的dna序列可以编码相同的氨基酸序列。本发明包括具有不同的核苷酸序列但编码相同的氨基酸序列的dna序列。

此外，本发明的蝎α-型神经毒素的突变体可通过化学合成来制得。可以参照wallace，fasebj.7：505(1993)描述的方法来化学合成蛋白。也可以合成部分蛋白，然后用酶连接在一起，或直接化学缩合。化学合成尤其适用于制备野生型蝎α-型神经毒素突变体的片段。

任选地，dna序列可以与不同的启动子结合以在特定类型的宿主细胞中表达或增强在宿主细胞中的表达水平。

一旦将编码蝎α-型神经毒素突变体的dna序列与合适的启动子结合成表达盒，就将该表达盒亚克隆到合适的转化载体中。合适的转化载体包括至少一种可检测的标记物基因，它最好是能在大肠杆菌和革兰阳性微生物中扩增的穿梭载体。合适的穿梭载体例子包括pmin164和pce104。其它类型的载体包括病毒载体如杆状病毒载体，sv40，痘病毒如牛痘、腺病毒和巨细胞病毒。较佳的载体是pmin164载体，一种可在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中扩增的穿梭载体。

一旦形成了携带编码蝎α-型神经毒素突变体表达盒的转化载体，就将其引入供表达蝎α-型神经毒素突变体的合适宿主细胞中。合适的宿主细胞是那些能高水平表达突变型毒素并使其它不需要的分子(如内毒素和m蛋白)污染可能性最少的细胞。合适的宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌细胞如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌属、酵母细胞以及昆虫细胞。

转化方法是本领域技术人员已知的，其包括原生质体转化、脂质体介导的转化、磷酸钙沉淀和电穿孔。较佳的方法是原生质体转化。

再另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括本发明所述的突变体、编码所述突变体的dna序列、表达盒和/或用于转化所述序列的宿主细胞。

本发明还提供了一种肽类杀虫剂，所述肽类杀虫剂包括本发明所述的突变体、编码所述突变体的dna序列、表达盒和/或用于转化所述序列的宿主细胞。

本发明还提供了一种杀虫微生物的增效剂，所述增效剂包括本发明所述的突变体、编码所述突变体的dna序列、表达盒和/或用于转化所述序列的宿主细胞。

本发明提供了一种蝎α-型神经毒素(来自条斑钳蝎m.eupeus的α-型神经毒素，其影响电压门控钠通道)的突变体mt-5。该α-型神经毒素来自条斑钳蝎毒液中的α-型神经毒素，该毒素能够靶向昆虫和哺乳动物的钠离子通道，造成昆虫和哺乳动物死亡；本发明利用进化指导的设计策略，发现蝎α-型毒素调控物种(昆虫/哺乳动物)选择性的关键氨基酸位点，并由此设计高度选择性靶向昆虫钠通道的蝎α-型神经毒素突变体，其不仅消除了对老鼠的毒性，而且保留甚至增强了对昆虫的毒性，本发明的突变体不仅为进一步构建转基因的杀虫微生物奠定基础，可以用于研发增效型微生物杀虫剂，还可以用作肽类杀虫剂；而且本发明首次使用进化生物信息学的方法指导开发杀虫分子的先导物，具有十分广阔的应用前景。

当前，微生物杀虫剂是新型的生物农药，本发明提供的蝎α-型神经毒素的突变体可以用于制备增效型微生物杀虫剂或用作微生物杀虫剂的增效器：

1)当前的微生物杀虫剂杀虫谱窄，只能针对特定种类的害虫，而本发明的蝎α-型神经毒素的突变体是昆虫钠通道的高亲和性配体，能够高效选择性的靶向昆虫的钠通道，因此可以用于昆虫类害虫；

2)当前微生物杀虫剂的感染的潜伏期长，导致杀虫效果慢，会造成实质性经济损失，而本发明的蝎α-型神经毒素突变体能够克服当前的微生物杀虫剂潜伏期长，杀虫效果慢的确定，提高经济效益；

3)本发明的蝎α-型神经毒素突变体的作用效果不受环境条件(温度、湿度和光照)的影响，使得其应用范围更加广泛。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出为蝎α-型神经毒素(mt-5)的序列和正选择位点定位；

其中，图a为本发明的蝎α-型神经毒素与其他物种的序列做的多序列比对。粗体表示的8个半胱氨酸形成二硫键。富含正选择位点的结构区域加虚框示意；灰色线示意二硫键的连接方式；蛋白质二级结构元件从mt-5实验性结构提取(pdbentry2lkb)。

序列来源：mt-5来自条斑钳蝎mesobuthuseupeus；bmkm1来自东亚钳蝎mesobuthusmartensii；lqh3，lqh2和lqhαit来自以色列金蝎leiurusquinquestriatushebraeus；aah2来自黄肥尾蝎androctonusaustralis。

图1b为本发明的蝎α-型神经毒素mt-5的空间结构的带状模型，并且该图示出了正选择氨基酸(用α-碳原子的球体模型显示)在mt-5的空间结构中的位置，其位于所述序列的n-转角，b环和j环三个结构域中。

图2示出为本发明的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5的rp-hplc，其中峰图显示其洗脱时间和纯度；

图3示出为重组野生型蝎α-型神经毒素(rmt-5)及其突变体的圆二色谱分析；

图4为卵母细胞电压钳技术，检测本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5对不同钠通道及其亚型的效应；其中rnav1.1、rnav1.2、rnav1.4、rnav1.5和mnav1.6为老鼠电压门控钠通道(其中m表示小鼠；r表示大鼠)；dmnav1为果蝇的电压门控钠通道；

图5示出为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5及其突变体对电压门控钠通道门控特性的影响，其中图5a为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5及其突变体对rnav1.1的影响；图5b为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5及其突变体对果蝇dmnav1钠通道门控特性的影响；

图6示出为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5突变体对rnav1.2，rnav1.4和mnav1.6a电压门控钠通道门控特性的影响。其中图6a为非热点残基突变体；图6b为热点残基突变体。

图7示出为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5及其突变体对rnav1.1的剂量-效应曲线；

图8示出为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5和rnav1.1受体的复合物模型；

图9示出为本发明所述的重组野生型蝎α-型神经毒素rmt-5及其突变体对家蝇的活体毒性试验。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用的鼠品种均为icr小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司；家蝇muscadomesticatjs，deltamethrin-sensitivestrain，购自中国科学院动物研究所。

实施例1蝎α-型神经毒素正选择位点的检测

本实施例中使用的软件为paml(phylogeneticanalysisbymaximumlikelihood)程序包(http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html)，由英国伦敦大学杨子恒教授开发。

发明人选取了来自条斑钳蝎的mt-5、东亚钳蝎的bmkm1、以色列金蝎的lqh3，lqh2和lqhαit和黄肥尾蝎的aah2，与本发明的α-型神经毒素进行生物信息学分析，在本发明的α-型神经毒素中发现了一系列的正选择位点。

其中，本发明所使用的序列的信息如表1所示

表1序列信息

利用最大似然法的密码子替代模型，申请人从mesobuthus蝎α-型毒素中检测到了11个正选择位点(k8、p9、e15、d18、a19、f20、s22、i40、l41、t43和a52)。这些位点主要分布在毒素分子的三个结构区域，n-转角，b环和j环，如图1a和图1b所示。图1a为本发明的蝎α-型神经毒素与其他物种的序列做的多序列比对。粗体表示的8个半胱氨酸形成二硫键。富含正选择位点的结构区域加虚框示意；灰色线示意二硫键的连接方式；蛋白质二级结构元件从mt-5实验性结构提取(pdbentry2lkb)。图1b为本发明的蝎α-型神经毒素mt-5的空间结构的带状模型，并且该图示出了正选择氨基酸(用α-碳原子的球体模型显示)在mt-5的空间结构中的位置，其位于所述序列的n-转角，b环和j环三个结构域中。

实施例2蝎α-型神经毒素mt-5及其突变体的设计、制备和鉴定

通过pcr策略，使用本领域技术人员已知的方法，获得了一系列的正选择位点的突变体，分别包括了10个点突变(k8a、p9a、e15a、d18a、s22g、i40a、l41a、t43a、a52k和a52l)以及一个删除突变体(δ19af20)。突变体的氨基酸序列如以下表2所示：

表2序列信息

所述序列使用的引物如表3所示：

表3使用的引物

注：突变的密码子使用粗体表示，并且限制性核酸内切酶位点(bamhiandsali)使用下划线表示。所列出的所有引物由sbsgenetech合成。

利用大肠杆菌表达策略，发明人获得了除了t43a之外的所有重组蛋白，包括有大肠杆菌重组制备的野生型蝎α-型神经毒素rmt-5，其中，所述突变体由以下方法制备：

1.利用pcr策略，首先构建了pet-28a-mt-5重组表达载体，所用内切酶为ncoi和sali；

2.将测序正确的pet-28a-mt-5质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)plyss细胞；

3.选取过夜培养的单克隆接种到lb培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g)，37℃培养至od600＝0.2-0.3，加入iptg至终浓度0.5mm，诱导4小时；

4.离心收集菌体，超声波破菌后收集包涵体沉淀，悬浮于下列缓冲液(0.1mtris-hcl，ph8.5，0.1mnacl)；

5.用2m尿素，2％triton100，0.1mtris-hcl，ph8.5，0.1mnacl缓冲液洗涤包涵体3次；

6.用6m盐酸胍，0.1mtris-hcl(ph8.5)，1mmedta，and30mmβ巯基乙醇溶解包涵体，室温放置2小时；

7.用0.2m乙酸铵(ph9.0)20倍稀释上述包涵体溶解液，启动复性过程，室温放置48小时；

8.复性的毒素用80％饱和硫酸铵沉淀，超滤脱盐后用rp-hplc分离纯化目的产物。

使用maldi-tof测定了它们的分子量，与理论分子量完全吻合，如表4所示。圆二色谱技术证实了这些突变体的空间结构与野生型高度相似，如图3所示。

其中，maldi-tof分析在中国科学院微生物所完成；圆二色谱技术在中科院生物物理所完成。cd仪器为chirascanplusspectropolarimeter(uk)，测量蛋白质浓度为0.1mg/ml。波长范围190-260nm。石英比色皿光程为1毫米。

表4rmt-5的分子量

实施例3蝎α-型神经毒素mt-5及其突变体的功能检测

电生理检测：

1.卵母细胞的分离：爪蟾冰麻醉1小时后，腹部朝上冰上取卵，取完后缝合好肌肉和皮肤，浸泡在2-3cm高室温水里复苏。卵母细胞取出后用含有胶原酶(1mg/ml)的nd96溶液消化1-2小时，用零钙和1.8钙的nd96各冲洗3次，在显微镜下挑选出无瑕疵的5-6期细胞保存在含有50mg/l硫酸庆大霉素的nd96中，16℃培养2-3小时后注射通道crna。

2.钠通道crna的制备和显微注射：通道线性化质粒用mmessagemmachinet7/sp6kit(ambionam1344)转录，用nanoliter2000显微注射仪(worldprecisioninstruments，usa)注射crna。

3.电生理记录：用oocyteclampamplifier(oc-725c，harvardapparatuscompany)室温记录电流。数据采集器为pclamp10.2控制的digidata1440a，axoncns)。漏差减按p/4方案进行。双电极电阻控制在0.5-1.5mω。去极化电流用1khz的四极低通bessel滤波器过滤，采样频率20khz。

4.数据处理：毒素的剂量效应(延缓失活)用i30ms/ipeak计算(i30ms为去极化后30ms测量的稳态电流电流，ipeak为对照峰电流)。数据用hill方程拟合，用sigmaplot11.0将三次独立实验的数据以平均值±标准误的形式呈现。

利用卵母细胞电压钳技术，发明人分析了mt-5及其突变体对钠通道功能的影响。五个老鼠钠通道亚型和一个果蝇钠通道用于评估重组mt-5的药理学活性。结果表明，该毒素能够显著延缓rnav1.1和昆虫钠通道dmnav1的失活过程并放大峰电流，并且对rnav1.4和rnav1.6也有弱的活性(图4)。因此，发明人选择了rnav1.1和dmnav1两个通道作为代表评估了系列突变体的活性。结果表明，虽然突变正选择位点导致了对rnav1.1差异的活性，但是它们都对dmnav1没有明显的影响(图5)。发明人发现，突变40和41位点(i40a和l41a)，以及删除19和20位点(δ19af20)，导致了mt-5对rnav1.1活性的完全丧失(1μm)(图5)。利用其它通道亚型，包括rnav1.2,rnav1.4和mnav1.6，我们研究了上述突变体的突变效应，结果发现上述这些突变体对这三个哺乳动物通道亚型的活性也显著下降了(图6)。剂量-效应曲线分析进一步表明这些位点的突变导致了毒素对rnav1.1通道活性下降超过100倍(表5和表6)，支持它们属于毒素-通道作用的热点氨基酸残基。

表5mt-5及其突变体对rnav1.1的效应

n.a.指使用1μm的突变体，在检测通道中没有活性。

表6mt-5及其突变体对rnav1.1和家蝇钠通道的活性

备注：倍数减少通过使用(突变体的ec50-rmt-5的ec50)除以rmt-5的ec50来计算的；n.d.指没有检测；

实施例4蝎α-型神经毒素mt-5及其突变体与rnav1.1受体位点的相互作用

操作步骤：基于玻璃海鞘cionaintestinalis的实验性结构(pdbentry4g7v)，我们在swiss-model服务器(http://www.swissmodel.expasy.org/)通过同源模建的方法构建了大鼠rnav1.1受体区域(从1540位到1655位氨基酸)的三维结构模型。

利用分子对接软件zdock(version3.0.2)建立了mt-5和rnav1.1受体的结构复合物模型。该模型建立方法参考了实验确定的毒素和通道氨基酸的数据信息，并完成了能量最小化。

利用分子对接方法，发明人将mt-5毒素分子的4个热点氨基酸(a19，f20，i40和l41)定位到了rnav1.1受体位点(图七)，建立了毒素通道相互作用的关键氨基酸配对，包括：a19和f20(毒素)-y1628和f1629(通道)；i40(毒素)-e1623(通道)；l41(毒素)-t1570(通道)。这说明这些正选择位点以及正选择环插入位点构成了毒素-通道相互作用的关键氨基酸。

实施例5蝎α-型神经毒素mt-5及其突变体的活体毒性试验

活体毒性测定：

1.昆虫毒性测定：用昆虫生理盐溶液(200mmnacl，3.1mmkcl，5.4mmcacl2，5mmmgcl2，2mmnahco3，0.1mmnah2po4，ph7.2)将每个毒素溶解成5个不同的溶度。利用微量进样枪注射到家蝇，每只1μl剂量，实验重复3次，每组10只家蝇成虫。记录12小时的死亡率。利用sigmaplot11.0软件计算半致死浓度(ld50)。剂量效应曲线用hill方程进行拟合，公式为y＝(a-b)/[1+(x/ld50)n]+b。“y”为家蝇死亡率(％)，“x”为毒素剂量(pmol/g)，“n”变量斜率因子，“a”为最大死亡百分比，“b”为最小死亡百分比。

2.小鼠毒性测定：

用0.9％的nacl生理盐水将毒素溶解成5个不同的溶度。采用尾静脉给药的方式将这些毒素注射入无特定病原体(specificpathogen-free，spf)小鼠体内。每组10个小鼠，大约25克/小鼠。24小时后记录死亡率。利用bliss方法计算毒素的半致死剂量(ld50)(spssstatistics17.0.1，spssinc.)。

表7mt-5及其突变体对家蝇和小鼠的活性

n.d.指没有检测到。相对毒性通过使用rmt-5的ld50除以家蝇幼虫的突变体的ld50来计算的；

发明人评估了mt-5以及突变体对家蝇的活体毒性，发现所有的突变体都整体上保留了野生型的抗昆虫活性，其中δ19af20活性比mt-5显著提高。i40a和l41a整体活性也显著下降(图七，表4)。小鼠毒性实验表明3个mt-5突变体(i40a，l41a和δ19af20)，对老鼠的毒性显著下降(表4)，整体下降25-78。正选择及其相近的插入氨基酸位点的突变可以改变毒素对昆虫/哺乳动物选择性，从而可以用于调整mt-5的毒性，为定向设计针对昆虫电压门控钠通道的肽类杀虫剂和微生物杀虫剂的增效剂提供了基础。

序列表

<110>中国科学院动物研究所

<120>蝎α-型神经毒素的突变体及其用途

<130>dic16110006r

<160>40

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素

<400>1

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>2

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体k8a

<400>2

alaargaspalatyrilealaalaprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>3

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体p9a

<400>3

alaargaspalatyrilealalysalahisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>4

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体e15a

<400>4

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyralacys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>5

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体d18a

<400>5

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

phealaalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>6

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体s22g

<400>6

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalapheserglytyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>7

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体i40a

<400>7

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnalaleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>8

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体l41a

<400>8

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnilealaglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>9

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体t43a

<400>9

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglyalatyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>10

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体a52k

<400>10

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysilelysleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>11

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体a52l

<400>11

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysileleuleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>12

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素突变体δ19af20

<400>12

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspsersertyrcysasnglyvalcysthrlysasnglyalalys

202530

serglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycystrpcys

354045

ilealaleuproaspasnvalproileargileproglylyscyshis

505560

<210>13

<211>198

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神经毒素的dna序列

<400>13

gctcgtgatgcttatattgccaagccccataactgtgtatacgaatgttttgatgcattt60

agtagttattgcaacggtgtatgtaccaagaacggtgctaagagtggctattgccaaatc120

ctcggtacatatggaaatggttgctggtgcatagcgttgcccgataatgtaccgattaga180

ataccaggaaaatgccat198

<210>14

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>东亚钳蝎的bmkm1

<400>14

valargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

alaargasnglutyrcysasnaspleucysthrlysasnglyalalys

202530

serglytyrcysglntrpvalglylystyrglyasnglycystrpcys

354045

ilegluleuproaspasnvalproileargvalproglylyscyshis

505560

<210>15

<211>67

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>以色列金蝎的lqh3

<400>15

valargaspglytyrilealaglnprogluasncysvaltyrhiscys

151015

pheproglyserserglycysaspthrleucyslysglulysglygly

202530

thrserglyhiscysglyphelysvalglyhisglyleualacystrp

354045

cysasnalaleuproaspasnvalglyileilevalgluglyglulys

505560

cyshisser

65

<210>16

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>以色列金蝎的lqh2

<400>16

ilelysaspglytyrilevalaspaspvalasncysthrtyrphecys

151015

glyargasnalatyrcysasngluglucysthrlysleulysglyglu

202530

serglytyrcysglntrpalaserprotyrglyasnalacystyrcys

354045

tyrlysleuproasphisvalargthrlysglyproglyargcysarg

505560

<210>17

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>以色列金蝎的lqhαit

<400>17

valargaspalatyrilealalysasntyrasncysvaltyrglucys

151015

pheargaspalatyrcysasngluleucysthrlysasnglyalaser

202530

serglytyrcysglntrpalaglylystyrglyasnalacystrpcys

354045

tyralaleuproaspasnvalproileargvalproglylyscyshis

505560

<210>18

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>黄肥尾蝎的aah

<400>18

vallysaspglytyrilevalaspaspvalasncysthrtyrphecys

151015

glyargasnalatyrcysasngluglucysthrlysleulysglyglu

202530

serglytyrcysglntrpalaserprotyrglyasnalacystyrcys

354045

tyrlysleuproasphisvalargthrlysglyproglyargcyshis

505560

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>meunatxα-12/13f

<400>19

ccatggctcgtgatgcytatatt23

<210>20

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>meunatxα-13r

<400>20

gtcgacttaatggcattttcctggtat27

<210>21

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>k8a-f

<400>21

gcgccccataactgtgtatacgaa24

<210>22

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>k8a/p9a-r

<400>22

ggcaatataagcatcacgagccat24

<210>23

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>p9a-f

<400>23

aaggcgcataactgtgtatacgaa24

<210>24

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>k8a/p9a-r

<400>24

ggcaatataagcatcacgagccat24

<210>25

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>e15a-f

<400>25

gcgtgttttgatgcatttagtagt24

<210>26

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>e15a-r

<400>26

gtatacacagttatggggcttggc24

<210>27

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>d18a-f

<400>27

gcggcatttagtagttattgcaac24

<210>28

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>d18a-r

<400>28

aaaacattcgtatacacagttatg24

<210>29

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>s22g-f

<400>29

ggctattgcaacggtgtatgtacc24

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>s22g-r

<400>30

actaaatgcatcaaaacattcgta24

<210>31

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>i40a-f

<400>31

gcgctcggtacatatggaaatggt24

<210>32

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>i40a/l41a-r

<400>32

ttggcaatagccactcttagcacc24

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>l41a-f

<400>33

atcgcgggtacatatggaaatggt24

<210>34

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>i40a/l41a-r

<400>34

ttggcaatagccactcttagcacc24

<210>35

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t43a-f

<400>35

gcgtatggaaatggttgctggtgc24

<210>36

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t43a-r

<400>36

accgaggatttggcaatagccact24

<210>37

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>a52k-f

<400>37

aaattgcccgataatgtaccgattaga27

<210>38

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>a52k-r

<400>38

tatgcaccagcaaccatttccatatgt27

<210>39

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>δaf-f

<400>39

agtagttattgcaacggtgtatgt24

<210>40

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>δaf-r

<400>40

atcaaaacattcgtatacacagtt24