一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白Cry30T及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白cry30t及其编码基因与应用。

背景技术：

水稻(oryzasatival.)是全球耕种面积最大的粮食作物，亚洲20亿人口所需热量的80％从中摄取(jaymacleanetal.,2013)。水稻褐飞虱(nilaparvatalugens)是水稻的主要害虫，每年能导致水稻减产超100万吨，在飞虱发生严重的年份可达200万吨(cheng,2015)。褐飞虱属于半翅目(hemiptera)，颈喙亚目(auchenorrhyncha)，稻虱科(delphacidae)(bourgoin,2014)，为半变态昆虫，全生育期分卵、若虫、成虫三个阶段。褐飞虱食性单一，只取食栽培水稻和普通野生稻。为害时褐飞虱成、若虫群集于稻丛基部，通过刺吸水稻韧皮部汁液为害(seoetal.,2009)，造成水稻光合产物的流失。同时，刺吸分泌凝固性的唾液形成“口针鞘”(wangetal.,2008)，阻碍稻株体内水分及养分的运输，严重时可使稻株茎秆变黑，全株枯黄死亡，甚至引起全田稻株枯死，形成所谓的“虱烧”(irri,1979)；另外，褐飞虱在产卵时还会利用产卵器划破水稻茎秆和叶片组织，影响稻株水分和养分的输送与吸收；褐飞虱还是水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病等水稻病毒病的虫媒(cabauatanetal.,2009；heinrichs,1979)。自1980年以来我国每年受到褐飞虱危害的稻田面积占总种植面积的50％，造成的损失达10％～20％，严重时可达40％～60％。

目前，防治褐飞虱主要通过栽培管理、合理使用农药、利用天敌、培育抗虫品种以及利用外源抗性基因培育转基因水稻等方式进行。农药的施用往往受限于天气条件，在高温多雨飞虱高发的季节农药的效果容易受到限制，大量消耗了人力财力的同时，对环境造成污染，危害人类健康。在经销商的促销及错误引导下农民对农药的使用往往超过使用说明的建议剂量，有证据表明，农药的过度使用是飞虱爆发的主要原因(sogawa,2015)。培育抗虫品种是对环境友好、最具经济效益的抗虫策略。自1973年以来，国际水稻研究所(internationalriceresearchinstitute，简称irri)先后选育了一系列含有抗褐飞虱主基因的水稻品种：1973年培育出含bph1基因的ir26，1976年推出含bph2基因的ir36，1982年又推出含bph3基因的ir56，这些品种的育成有效地控制了褐飞虱的暴发。虽然水稻抗褐飞虱育种已经取得了一些成绩，但是依然存在一些问题。首先，抗褐飞虱基因多来源于野生稻或原始材料，抗性基因往往与生产不利基因连锁，打破连锁所需时间长；其次，目前精细定位的抗飞虱基因及主效qtl还较少；再次，由于飞虱对抗性基因的适应性导致新的生物型的产生，使抗性品种失 效。比如含bph1基因的ir26仅在推广两年后便被生物ii型的褐飞虱攻克，含bph2基因的ir36也在推广数年后被生物型iii的褐飞虱攻克。因此，发掘和利用新的抗褐飞虱基因，采用现代育种技术培育具有持久水平抗虫性的水稻品种，是抗褐飞虱水稻育种的关键。

转基因技术作为常规育种技术的重要补充，具有着极高的效率和广阔的应用前景，为抗虫水稻培育提供了新的途径(brookesandbarfoot,2003)。目前应用于抗褐飞虱转基因水稻的基因主要有雪花莲凝集素及大蒜凝集素等植物凝集素类基因。植物凝集素多数情况下对哺乳动物具有毒性，限制了此类基因在转基因水稻上的应用。水稻内源抗褐飞虱基因bph14和bph3已经分别被克隆，为应用于抗飞虱转基因水稻品种的培育提供了可能。但目前仅克隆到两例此类基因，可用资源有限，此外，飞虱可以很快产生新的生物型而表现出对此类基因的适应性，使抗性基因失效。因此，创制发展对稻褐飞虱等害虫有高毒力的新型杀虫基因迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质为将cry30fa1蛋白氨基酸序列的第1-49位氨基酸截去，且将所述cry30fa1蛋白氨基酸序列的第515位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸、第534位氨基酸由苯丙氨酸突变为酪氨酸、第574位氨基酸由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第644位氨基酸由颉氨酸突变为甲硫氨酸、第657位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺和第680位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸，且保持其他部分氨基酸残基序列不变，得到的蛋白质，将其命名为cry30t蛋白。

上述cry30fa1蛋白为如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。

上述b)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所创制cry30t蛋白全长为638个氨基酸，其序列经ncbiblastp分析，其结构域i的区间为：v19-i254，具有在昆虫中肠膜上形成空洞的能力；结构域ii的区间为：t261-d465，具有与水稻褐飞虱中肠膜上受体特异结合的能力；结构域iii的区间为：n468-v628，具有稳定蛋白空间结构等功能。本发明所创制蛋白分子量为71287.0da，等电点为8.00。本发明所创制cry30t蛋白氨基酸序列与ncbi数据库中已知序列比对，同源性最高为91.99％。

本发明的另一个目的是提供编码上述蛋白质的核酸分子。

上述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的dna分子；

2)其编码序列是序列表中序列3的dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的dna分子杂交且编码上述蛋白的dna分子；

4)与1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的dna分子。

本发明创制的cry30t蛋白编码基因的核酸序列全长为1,914bp，其核苷酸序列为序列1，并将其优化为水稻最优势密码子，优化后的核酸序列为序列3。序列优化时同时考虑到5’非编码区及3’非编码区对基因所转录之mrna整体二级结构的影响，以确保mrna具有更稳定，更利于高效翻译其所编码的蛋白的能力。本序列亦去除了影响mrna稳定的一些基序，包括可能的mrna剪切位点、可能的mrna加polya位点、重复的polya及polyt序列以及一些正向或反向的重复序列。为了有效的翻译起始，引入了kozak序列。另外，为了有效的提高翻译效率同时引入了ω序列。应用本优化方案所得到的序列所产生的转基因水稻株系可以高水平的表达本基因所编码蛋白，并提供高水平的防治害虫的能力。

本发明还有一个目的是提供下述1)-4)中的任一种生物材料：

1)含有上述核酸分子的表达盒；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有上述核酸分子的重组菌；

4)含有上述核酸分子的转基因细胞系。

本发明最后一个目的是提供上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系的新用途。

本发明提供了上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在作为cry类杀虫剂中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备cry类杀虫剂中的应用。

上述应用中，所述杀虫的对象为水稻褐飞虱。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在防治水稻褐飞虱中的应用也属于本发明的保护范围。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备防治水稻褐飞虱的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的实验证明，本发明所改造cry30t与已知蛋白cry30fa1具有本质上的不同，且对褐飞虱等刺吸式口器昆虫具有强杀虫活性，从而为防治稻褐飞虱等水稻害虫 提供了新的策略，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为cry30fa1与ncbi数据库中序列比对结果。

图2为cry30fa1ncbiblastpcdd分析结果。

图3为cry30t核苷酸序列pcr扩增结果。

图4为cry30t与cry30fam氨基酸序列比对结果。

图5为cry30t截断结构与cry30fa1全长结构比对示意图。

图6为cry30t与cry30fa1蛋白质三维机构比较。

图7为pet28b30t的质粒图谱及酶切鉴定。

图8为pet28b30t的原核表达。

图9为pet28b30t的蛋白纯化及定量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例构建过程中质粒提取、酶切、dna的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(sambrookandrussell2001)。

下述实施例中的含有cry30fa1基因的质粒pet22b30在文献“cloningandcharacterizationoftwonovelcrystalproteingenes,cry54aa1andcry30fa1,frombacillusthuringiensisstrainbtmc28”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中涉及的概念及其定义如下：

“杀虫蛋白”是指能够控制昆虫的的生存、生长以及繁殖的蛋白，并且主要是通过杀死昆虫的方式实现是生物活性。

“δ-内毒素”是指由苏云金芽孢杆菌在产生的，具有对不同昆虫具有毒性的蛋白质。

“靶标害虫”是指对某一特定杀虫蛋白敏感的昆虫称为此杀虫蛋白的靶标害虫，与此对应的对此蛋白不敏感的害虫称为非靶标害虫。

“结构域”：是蛋白质中的一类结构单元，是构成蛋白质三级结构的基本单元。它由不同的α螺旋、β折叠或者其它蛋白质二级结构组成，具有相对独立的空间结构和功能。

“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5’非编码区)和后面(3’非编码区)的调控序列。

“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。

“转化”是指将源核酸引入至一种宿主细胞或生物中的一个过程。

“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。

“基序”是指dna，蛋白质等生物大分子中的保守序列，在反式作用因子的结构中，基序一般指构成任何一种特征序列的基本结构(既指此具功能的基本结构，也指编码此结构的蛋白质/dna序列)，作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用。

“mrna剪切”是指从dna模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的rna分子的过程。

“密码子”是指信使rna链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基亦称三联体密码。同一个氨基酸可由不同的密码子编码称为“密码子的简并性”。

“密码子偏爱性”是指由于密码子的简并性，每个氨基酸至少对应1种密码子，最多有6种对应的密码子。不同物种、不同生物体的基因密码子使用存在着很大的差异。各种生物体似乎更偏爱使用某些同义三联密码子。其中在某一物种中使用频率高的密码子称为该物种的“优势密码子”。

“保护碱基”是指限制性内切酶识别特定的dna序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到dna双链并发挥切割dna作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

“半致死浓度”是指在动物急性毒性试验中，使受试动物半数死亡的毒物浓度，用lc50表示。

实施例1、新型杀虫蛋白基因cry30t的获得

一、新型杀虫蛋白基因cry30t的获得

1、cry30fa1的测序分析

将含有cry30fa1基因的质粒pet22b30转化大肠杆菌表达菌株bl21(de3)并选取3个独立的单克隆用t7启动子引物(5’-taatacgactcactataggg-3’)进行了测序验证。并根据测序结果翻译成氨基酸序列。

结果如图1所示，pet22b30的氨基酸序列与ncbi数据库提交序列(aci22625.1)同源性为98.98％，存在7个氨基酸突变。任何一个氨基酸的突变都可能严重的影响到蛋白质的结构和功能，这表明获得的突变后的cry30fa1基因是一条新的基因，并命名为cry30fam。

为了进一步的序列优化和蛋白质工程改造，利用ncbiblastp对cry30fa1的氨基酸序列进行了保守结构分析，在ncbi保守结构域数据库(conserveddomaindatabase, cdd)中得到三个结构域的具体位点，其中endotoxin_n、endotoxin_m和delta_endotoxin_c分别对应cry蛋白的结构域i，结构域ii和结构域iii，其ncbi数据库结构示意图如图2所示。从图2可以看出，在cry30fa1的n端，结构域i前有一段短的非功能冗余序列，可能对蛋白的杀虫活性造成不利影响。根据cdd分析结果，cry30fa1的结构域i的区间为：v68-i303，结构域ii的区间为：t310-d514，结构域iii的区间为：n517-v677。

2、cry30t基因的获得

(1)引物的设计

根据以上结构域区间分析结果，在cry30fa1结构域i的n末端v68向上游方向寻找第一个甲硫氨酸m50，并根据对应的核苷酸序列设计引物，上游引物5’端带有bamhi酶切位点及保护碱基，下游引物5’端带有hindiii酶切位点及保护碱基，引物序列如下所示(下划线标识引物所带酶切位点)：

cry30tfb:5’-tttgtggatcctatgtgtcaaactattact-3’

cry30r:5’-gggcaaagcttgttcactggacaagcaaatgc-3’

(2)pcr扩增

以pet22b30质粒为模板，采用cry30tfb和cry30r进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，即为截短后的cry30fa1。将pcr扩增产物电泳，电泳结果如图3所示。电泳结果表明，pcr扩增得到大小约为1900bp的产物。将pcr扩增产物进行切胶回收，并插入peasy-blunt克隆载体，随后每个构建挑取3阳性个克隆，用通用引物m13f/r进行测序。

测序结果表明：pcr扩增产物的核苷酸序列如序列1所示，序列1所示的基因编码的氨基酸序列如序列2所示。将序列2所示的氨基酸序列用dnaman8.0进行序列比对，比对结果表明，截短后的氨基酸序列与全长氨基酸序列相比，除n端去除部分冗余序列外，其它部分没有引入突变。三个结构域在序列上的分布分别用蓝绿红三种颜色下划线进行标识，序列比对结果如图4所示。

将截短后的蛋白序列进行ncbicdd数据库分析，证实截短后的氨基酸序列n端第一个结构域结构依然完整，没有受到破坏，截短前后结构比较如错误！未找到引用源。所示，可以看出在保证结构域完整的情况下已经将原始序列尽可能的截短了，截短后的cry蛋白从一级结构上看更加紧密。cry30fa1截短前后的参数对比如其中，cry30fa1为截短前，30t为截短后。

表1所示。其中，cry30fa1为截短前，30t为截短后。

表1、cry30fa1截短前后的参数比较

蛋白质的三级结构决定蛋白的功能。为了进一步分析截短是否影响到两个蛋白的三级结构，利用swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)数据库分析了截短前后蛋白的三级结构，结果如错误！未找到引用源。所示。通过构象比对可以看出，改造前后仅有结构域i的环区(loop)有轻微的构象差异，最明显的是位于cry30fa1n端s233-s240的环区，其它结构域的构象没有明显改变。这样的轻微构象变化通常不会影响蛋白的活性。

3、cry30t基因的序列优化

将cry30t基因的序列进行优化，优化后的cry30t基因序列如序列3所示，将序列3所示的基因命名为cry30t，该基因编码的蛋白命名为cry30t，其氨基酸序列为序列表中序列2。cry30t蛋白为将cry30fa1蛋白(cry30fa1蛋白的氨基酸序列为序列4)的第1-49位氨基酸截去，且将cry30fa1蛋白的第515位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸、第534位氨基酸由苯丙氨酸突变为酪氨酸、第574位氨基酸由丝氨酸突变为苯丙氨酸、第644位氨基酸由颉氨酸突变为甲硫氨酸、第657位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺、第680位氨基酸由天冬氨酸突变为甘氨酸后得到的蛋白质。优化的具体方法如下：优化采用金斯瑞公司密码子优化软件optimumgene^tm，采用水稻(oryzasativasubsp.indica)优势密码子，去除xmai、kpni、noti和xhoi等酶切位点。序列优化时同时考虑到5’非编码区及3’非编码区对基因所转录之mrna整体二级结构的影响，去除影响mrna稳定的一些基序，包括可能的mrna剪切位点、可能的mrna加polya位点、重复的polya及polyt序列以及一些正向或反向的重复序列。另外，加入了kozak序列gccgccatgg及ω序列。优化后的cry30t基因序列与优化前的参数比较如下表2所示。

表2、cry30t基因优化前后参数比较

二、杀虫晶体蛋白cry30t的原核表达及纯化

1、重组载体的构建

(1)将上述实施例1获得的pcr产物(优化前)经1％琼脂糖凝胶6v/cm，20min分离后从琼脂糖中切出目标条带，并用svgelandpcrclean-upsystem试剂盒纯化回收，得到回收产物。

(2)将回收产物(cry30t基因)用bamhi及hindiii双酶切(全部酶切)，并连接入同是bamhi及hindiii双酶切的原核表达载体pet28b(100ng/μl×45μl)。酶切产物再次经过1％琼脂糖凝胶6v/cm，20min分离并用svgelandpcrclean-upsystem试剂盒纯化回收，回收产物16℃连接1h。其中，连接酶购自neb公司；t4dnaligase(货号为m0202l)。

(3)连接产物全部转化trans1-t1phageresistant化学感受态细胞(货号为cd501)，并涂布含50mg/μlkanamycinlb平板(1llb平板配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，琼脂粉15g，121℃高压灭菌20min)。

第二天挑单克隆于10ml含50mg/μlkanamycin不含琼脂的lb液体培养基(1llb液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，121℃高压灭菌20min)中，37℃，200rpm摇菌12h，用plussvminiprepsdnapurificationsystem提取质粒用ndei/xhoi进行酶切鉴定，结果见图7a。酶切鉴定正确后送睿博兴科公司进行测序，结果表明该质粒为将序列表中序列1所示的cry30t基因插入pet28b载体的bamhi和hindiii酶切位点间，且保持pet28b载体的其他序列不变得到的载体，将其命名为pet28b30t，其结构见图7b。

将序列5所示的cry30fa1蛋白的编码基因序列插入pet28b载体的bamhi和hindiii酶切位点间，且保持pet28b载体的其他序列不变得到的载体，将其命名为pet28b30fa1。

2、重组菌的构建及目的蛋白的表达和纯化

将上述重组载体pet28b30t转化大肠杆菌表达菌株transbl21(de3)(货号：cd601)，转化操作按照产品说明进行操作，得到重组菌bl21(de3)/pet28b30t。

采用同样的方法将pet28b空载体转化大肠杆菌表达菌株transbl21(de3)中，得到重组菌bl21(de3)/pet28b。

采用同样的方法将pet28b30fa1转化大肠杆菌表达菌株transbl21(de3)中，得到重组菌bl21(de3)/pet28b30fa1。

第二天分别挑选重组菌bl21(de3)/pet28b30t、bl21(de3)/pet28b和bl21(de3)/pet28b30fa1单克隆于10ml含50mg/μlkanamycin不含琼脂的lb液体培养基中，37℃，200rpm摇菌12h。然后按照1:100接入新鲜的含50mg/μlkanamycin的100mllb液体培养基中，37℃，200rpm摇菌，2h左右检测od600值，当od600＝0.6时取500ul未诱导样品作为阴性对照。加入终浓度为1mm的iptg，并每2h取500ul 诱导样品，重组菌bl21(de3)/pet28b的样品只取第6个小时的样品。诱导6个小时后将各样品12000rpm离心1min加50μl1×pbs(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmkh2po4,ph7.4)涡旋混匀，加50μl2×sds-pageloadingbuffer(120mmtris-hcl6.8,20％glycerol,4％sds,3％β-mercaptoethanol,0.02％bromophenolblue)混匀，沸水浴5min，8％sds-page凝胶电泳检测。

结果如图8所示，其中，m:proteinmarkeri；28b-:pet28b空载体未诱导对照；28b+:pet28b空载体诱导对照；0:pet28b30t未诱导对照；2～8：pet28b30t诱导结果。诱导条带大小为71.3kda，与理论相符，说明蛋白cry30t蛋白在大肠杆菌中得到诱导表达。而重组菌bl21(de3)/pet28b30fa1未诱导表达出蛋白。

上述纯化过程为：挑选单克隆于10ml含50mg/μlkanamycin不含琼脂的lb液体培养基中，37℃，200rpm摇菌12h。然后按照1:100接入新鲜的含50mg/μlkanamycin的200mllb液体培养基中，37℃，200rpm摇菌，2h左右检测od600值，当od600＝0.6时加入终浓度为1mm的iptg，16℃，200rpm诱导过夜。收集过夜诱导表达菌体，10,000g离心10min收集菌体。弃上清，用20ml1×ni-nta结合缓冲液(50mmnah2po4,ph8.0,300mmnacl,10mm咪唑)重悬。并将重悬液置于大小合适的容器中，200w，10s，10s，超声至澄清。裂解物14,000g离心20min去除细胞碎片。离心后上清经0.45μm滤膜过滤(nmlsyringefilters-17598)，与ni-ntahis·bind树脂混合，旋转混合器200rpm，4℃结合1h。用4ml1×ni-nta漂洗缓冲液(50mmnah2po4,ph8.0,300mmnacl,20mm咪唑)漂洗2次，用1ml1×ni-nta洗脱缓冲液(50mmnah2po4,ph8.0,300mmnacl,250mm咪唑)洗脱，收集洗脱液。

将洗脱液用sds-page检测，结果如图9。洗脱后的蛋白用1×pbs透析缓冲液(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmkh2po4,10％v/v甘油,ph10.0)，4℃透析12h，中间换两次缓冲液。透析后的蛋白加入终浓度为10％的无菌甘油保存于-80℃。将bsa标准品倍比稀释成1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml,0.0625mg/ml共5个浓度梯度，将标准品及待测样品均上样10μl，根据bsa标准品建立标准曲线，并根据拟合公式计算出cry30t的浓度为250ng/μl。

实施例2、杀虫晶体蛋白cry30t抗虫生物活性测定

供试虫源：水稻褐飞虱(nilapavatalugens)为中国水稻所，赖凤香老师实验室提供。

供试样品：实施例1制备的抗稻褐飞虱蛋白cry30t，为原核表达纯化可溶蛋白，-80℃保存；对照(ck)：纯人工饲料。

实验地点：委托中国水稻所赖凤香老师实验室进行。

实验方法：实验于中国水稻所人工气候培养室进行，环境温度为：27±1℃。飞虱饲喂采用全人工饲料，饲育器为长15cm，直径2.5cm的无底的圆筒形玻璃器皿，饲料室由双层拉薄的parafilm膜夹饲料液滴组成。

生测时将各待测样品进行50μg/μl、100μg/μl及200μg/μl终浓度的梯度稀释混入人工饲料饲喂飞虱，并设定无蛋白添加的纯阴性对照(ck)。

实验具体方案为：每管接初孵(1龄)若虫25头后用纱布封口，平放，用黑布遮光保湿，只露出parafilm膜封口端。每处理设4次重复，每2天查虫，记录活虫数。以第6天统计数据计算其对褐飞虱的半数致死浓度lc50，具体结果见表3。

表3、30t及54t蛋白的褐飞虱生物活性测试

以上结果表明，杀虫蛋白cry30t对水稻褐飞虱具有较强的杀虫活性。