本发明涉及保健品制备技术领域，具体是一种用于骨关节修复的带鱼活性提取物的制备方法。
背景技术：
多肽从二十世纪初才开始受到关注，研究发现它区别于蛋白质区别于氨基酸，具有药物的作用。到了上个世纪九十年代才有了长足发展，在不断更新的技术指导下，多肽的应用范围越来越广，作用也越来越大，这才迈进了我们的生活，在我们生活中占据的份额越来越大，多肽类药物高效低毒特异性强具有区别于其他药物的特有优势，正不断影响着我们的生活。而且多肽潜力巨大，是生物科学发展的又一大突破和发展方向。
天然存在的海洋活性多肽由于在生物体中含量低，而且提取困难，难以实现大量生产供给所需，化学人工合成多肽成本昂贵。所以，人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物获得活性多肽这条途径上来。由于海洋生物生存的环境与陆地生物完全不同，如高压、低温、高温和高盐等极端环境，为了适应这些极端的海洋生物环境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，同时，海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。海洋生物蛋白资源是21世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，但我国目前的蛋白类水产品中，除一部分直接食用外，大部分通过简单的加工技术制成食品进入市场，加工技术落后，产品结构单一，产品的附加值低，使得产品在国际市场上的竞争力较差。因此，我国急需对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。
现有技术如授权公告号为cn103333940b的中国发明专利，公开了一种利用带鱼制备二肽基肽酶iv抑制肽的方法，步骤包括：将带鱼加水绞碎成均匀的鱼肉浆；鱼肉浆放入酶解罐中，添加内切蛋白酶，搅拌水解4～12h，得水解液；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；将水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，搅拌水解2～8h；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、neutrase中性蛋白酶、alcalase碱性蛋白酶中的一种。外切蛋白酶为flavourzyme风味蛋白酶。将上述所得灭酶后的水解液离心取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1mpa，超滤膜的截留分子量为3000da，收集超滤膜透过液；采用亲和层析方法分离纯化dpp-iv抑制肽。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，上述方法采用陆地上提取的蛋白酶对海洋生物进行酶解，酶解效率低。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种使用从海洋生物中提取的蛋白酶酶解的用于骨关节修复的带鱼活性提取物的制备方法，制备得到的带鱼活性提取物能有效消除关节肿痛，促进关节滑液的生成，加速软组织的重建和恢复。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：用于骨关节修复的带鱼活性提取物的制备方法，包括复合酶酶解、多级膜过滤、纳滤、hplc洗脱和冷冻干燥，上述复合酶酶解步骤为采用海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶酶解带鱼鱼肉匀浆液，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶同时对带鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段。
作为优选，冷冻干燥步骤为：预冻：-35~-45℃预冻3~5h；冷冻干燥：-45~-35℃，3~5pa冷冻干燥5~7h，-10~-5℃，10~20pa冷冻干燥2~3h；升华干燥：10~15℃，50~60pa升华干燥3~4h；解析干燥:7~14℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到用于骨关节修复的带鱼活性提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性肽的活性；低压下干燥，活性肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
作为优选，冷冻干燥前加入30~40wt%辅料，辅料的成分及其重量份为：80~90份右旋糖酐-40和2~5份活性肽。上述辅料利于产品成型，即防止在抽真空时药物与水蒸气一起飞散或成形时收缩，并且可保护活性肽。
作为优选，活性肽的氨基酸序列为hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通过氢键与具有骨关节修复的活性肽连接，能以极少量的量就能很好的保护功能性肽，使其免于储藏过程中氧气及其他因素对其结构的破坏。
作为优选，复合酶酶解步骤中海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶的加入量为1~2wt%，酶解温度为25~35℃，ph为7.0~9.0，酶解时间为40~60min。上述条件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。
作为优选，多级膜过滤步骤为先将滤液用0.2~0.4µm微滤膜过滤，滤液再分别通过截留分子量14-18kda、6-8kda的超滤膜，浓缩滤液。通过物理方式对滤液进行纯化处理，操作简单，不会破坏功能肽的活性，得到的超滤液中对骨关节有修复作用的功能肽的含量高。
作为优选，hplc洗脱步骤中洗脱步骤为0~5min，用1~3%三氟乙酸和98~99%乙腈洗脱，流速为0.8~1.5ml/min；5~15min，用5~7%三氟乙酸和93~95%乙腈洗脱，流速为0.8~1.5ml/min；15~30min，用8~12%三氟乙酸和88~92%乙腈洗脱，流速为0.8~1.5ml/min。根据功能肽的极性设计洗脱液组分及洗脱操作，将对骨关节有修复作用的功能肽与其他物质分离开来，对产品进行进一步纯化。
作为优选，hplc洗脱步骤中洗脱结束后收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩。对骨关节修复作用优异的功能肽在250nm处有较强吸收。上述操作得到的带鱼活性提取物能促进软骨细胞的生成，能大量催生和补充关节滑液，润滑关节软骨面，减少磨损，增加关节部位的灵活度；能有效促进胶原基质的生成，刺激结缔组织细胞再生，进而加速软组织的重建和恢复；具有抑制微血管衍生的因子，还可增加抗体的产生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以减轻疼痛，改善运动能力；可以抑制软骨降解酶的活性，从而起到预防和治疗关节退行性变的作用；分子量小，人体对带鱼活性提取物的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延缓骨质疏松。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶同时对带鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段；2）冷冻干燥前在产品中加入辅料，辅料中有氨基酸序列为hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr的活性肽。上述活性肽通过氢键与具有骨关节修复的活性肽连接，能以极少量的量就能很好的保护功能性肽，使其免于储藏过程中氧气及其他因素对其结构的破坏；3）得到的带鱼活性提取物能促进软骨细胞的生成，能大量催生和补充关节滑液，润滑关节软骨面，减少磨损，增加关节部位的灵活度；能有效促进胶原基质的生成，刺激结缔组织细胞再生，进而加速软组织的重建和恢复；具有抑制微血管衍生的因子，还可增加抗体的产生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以减轻疼痛，改善运动能力；可以抑制软骨降解酶的活性，从而起到预防和治疗关节退行性变的作用；分子量小，人体对带鱼活性提取物的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延缓骨质疏松。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
用于骨关节修复的带鱼活性提取物的制备方法，包括复合酶酶解、多级膜过滤、纳滤、hplc洗脱和冷冻干燥，上述复合酶酶解步骤为采用海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶酶解带鱼鱼肉匀浆液，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶同时对带鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段。
冷冻干燥步骤为：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到用于骨关节修复的带鱼活性提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性肽的活性；低压下干燥，活性肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性肽中含水量低，且有利于长途运输和长期保存。
冷冻干燥前加入36wt%辅料，辅料的成分及其重量份为：87份右旋糖酐-40和3份活性肽。上述辅料利于产品成型，即防止在抽真空时药物与水蒸气一起飞散或成形时收缩，并且可保护活性肽。
活性肽的氨基酸序列为hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通过氢键与具有骨关节修复的活性肽连接，能以极少量的量就能很好的保护功能性肽，使其免于储藏过程中氧气及其他因素对其结构的破坏。
复合酶酶解步骤中海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶的加入量为1.6wt%，酶解温度为30℃，ph为8.0，酶解时间为50min。上述条件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。
多级膜过滤步骤为先将滤液用0.3µm微滤膜过滤，滤液再分别通过截留分子量15kda、7kda的超滤膜，浓缩滤液。通过物理方式对滤液进行纯化处理，操作简单，不会破坏功能肽的活性，得到的超滤液中对骨关节有修复作用的功能肽的含量高。
hplc洗脱步骤中洗脱步骤为0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脱，流速为1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脱，流速为1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脱，流速为1ml/min。根据功能肽的极性设计洗脱液组分及洗脱操作，将对骨关节有修复作用的功能肽与其他物质分离开来，对产品进行进一步纯化。
hplc洗脱步骤中洗脱结束后收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩。对骨关节修复作用优异的功能肽在250nm处有较强吸收。
实施例2：
用于骨关节修复的带鱼活性提取物的制备方法，包括复合酶酶解、多级膜过滤、纳滤、hplc洗脱和冷冻干燥，上述复合酶酶解步骤为采用海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶酶解带鱼鱼肉匀浆液，并采用超声波辅助酶解。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶同时对带鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段。
冷冻干燥步骤为：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，3pa冷冻干燥5h，-5℃，12pa冷冻干燥2h；升华干燥：13℃，52pa升华干燥3.4h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到用于骨关节修复的带鱼活性提取物。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性肽的活性；低压下干燥，活性肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性肽中含水量低，且有利于长途运输和长期保存。
冷冻干燥前加入34wt%辅料，辅料的成分及其重量份为：85份右旋糖酐-40和3份活性肽。上述辅料利于产品成型，即防止在抽真空时药物与水蒸气一起飞散或成形时收缩，并且可保护活性肽。
活性肽的氨基酸序列为hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通过氢键与具有骨关节修复的活性肽连接，能以极少量的量就能很好的保护功能性肽，使其免于储藏过程中氧气及其他因素对其结构的破坏。
复合酶酶解步骤中海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶的加入量为1.5wt%，酶解温度为30℃，ph为8.0，酶解时间为44min。上述条件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。
多级膜过滤步骤为先将滤液用0.3µm微滤膜过滤，滤液再分别通过截留分子量16kda、7kda的超滤膜，浓缩滤液。通过物理方式对滤液进行纯化处理，操作简单，不会破坏功能肽的活性，得到的超滤液中对骨关节有修复作用的功能肽的含量高。
hplc洗脱步骤中洗脱步骤为0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脱，流速为1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脱，流速为1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脱，流速为1ml/min。根据功能肽的极性设计洗脱液组分及洗脱操作，将对骨关节有修复作用的功能肽与其他物质分离开来，对产品进行进一步纯化。
hplc洗脱步骤中洗脱结束后收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩。对骨关节修复作用优异的功能肽在250nm处有较强吸收。
实施例3：
1）复合酶酶解：采用海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶酶解带鱼鱼肉匀浆液，并采用超声波辅助酶解。海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶的加入量为1.4wt%，酶解温度为30℃，ph为8.0，酶解时间为44min，超声波频率为25khz。酶解结束后沸水浴灭酶3min。海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢杆菌产碱性蛋白酶和条斑紫菜蛋白酶同时对带鱼蛋白进行酶解，可得到大量有活性的肽段；
2）多级膜过滤：先将滤液用0.3µm微滤膜过滤，滤液再分别通过截留分子量16kda、7kda的超滤膜，浓缩滤液至原来体积的1/20。通过物理方式对滤液进行纯化处理，操作简单，不会破坏功能肽的活性，得到的超滤液中对骨关节有修复作用的功能肽的含量高；
3）纳滤：将步骤2得到的浓缩液进行纳滤操作，纳滤膜的分离机理为筛分和溶解扩散并存，同时又具有电荷排斥效应，可以有效地去除二价和多价离子、去除分子量大于200的各类物质，可部分去除单价离子和分子量低于200的物质，能很好的达到去盐和分子量大于200的杂质的目的；
4）hplc洗脱：hplc洗脱步骤中洗脱步骤为0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脱，流速为1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脱，流速为1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脱，流速为1ml/min。洗脱结束后收集在250nm有吸收的洗脱物，合并并浓缩至原来体积的1/30；
5）冷冻干燥：在步骤4得到的浓缩液中加入35wt%辅料进行冷冻干燥。辅料的成分及其重量份：86份右旋糖酐-40和3份活性肽。活性肽的氨基酸序列为hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，3pa冷冻干燥5h，-5℃，12pa冷冻干燥2h；升华干燥：13℃，52pa升华干燥3.4h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到用于骨关节修复的带鱼活性提取物。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>兰溪市捷喜食品加工技术有限公司
<120>用于骨关节修复的带鱼活性提取物的制备方法
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