一种酶法生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。

背景技术：

5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-methylpyrazine-2-carboxylicacid)是一种重要的药物中间体，主要用于合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪(glipizide)，新一代长效降血脂药阿昔莫司(acipimox)和治疗结核病的有效药物(pae)。

现有5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法包括化学合成法、电化学合成法和生物合成法，其中化学合成法已实现工业化。

现行的化学合成法较多的是采用2,5-二甲基吡嗪为原料，经双氧水氧化得到n-氧代-2,5-二甲基吡嗪后与乙酸酐反应生成2-乙酰氧甲基-5-甲基吡嗪，然后碱水解得到2-羟甲基-5-甲基吡嗪，最后通过高锰酸钾氧化得到目标产物。该方法收率较低且操作安全性低。

cn1141299c《用kmno4一步氧化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法》公开了一种用kmno4一步氧化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。该方法以2.5-二甲基吡嗪为原料，在抑制剂的存在下，加入kmno4溶液反应，热过滤除去mno2的滤液经浓缩，酸析，过滤得到部分5-甲基吡嗪-2-羧酸。这种方法由于制备过程中使用大量的高价金属盐，容易生成大量废水，不符合现代化工的环保要求。

本领域迫切需要开发新的高效生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。

本发明首先保护特定蛋白质在制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用；

所述特定蛋白质为如下(a1)或(a2)：

(a1)醛脱氢酶；

(a2)在(a1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

所述标签见表1。

表1标签的序列

本发明还保护特定蛋白质在以5-甲基-2-吡嗪醛为原料制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用；

所述特定蛋白质为如下(a1)或(a2)：

(a1)醛脱氢酶；

(a2)在(a1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。

以上任一所述醛脱氢酶是如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

本发明还保护一种5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法，包括如下步骤：采用所述特定蛋白质催化5-甲基-2-吡嗪醛转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸。

所述催化反应体系由缓冲液、底物、特定蛋白质和nad+组成。

所述缓冲液为0.5mtris-hcl(ph为8.0)。

所述底物为5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为20mm。

所述特定蛋白质在反应体系中的浓度为1000u/l。

所述nad+在反应体系中的浓度为20mm。

所述催化反应条件为30℃、200rpm反应12h。

本发明还保护一种5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)将重组菌进行诱导表达，然后收集菌体并进行菌体破碎，然后收集上清液；所述重组菌为具有编码所述特定蛋白质的基因的重组菌；

(2)从步骤(1)得到的上清液中纯化所述特定蛋白质；

(3)采用步骤(2)得到的特定蛋白质催化5-甲基-2-吡嗪醛转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸。

所述“编码所述特定蛋白质的基因”为如下(c1)-(c3)中任一所述的dna分子：

(c1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；

(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna序列杂交且编码权醛脱氢酶的dna分子；

(c3)与(c1)或(c2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码醛脱氢酶的dna分子。

所述重组菌是将重组质粒导入出发菌株得到的；所述重组质粒为将pet21a(+)载体的ndei和xhoi酶切位点间的小片段替换为了序列表的序列1所示的双链dna分子得到的重组质粒；所述出发菌为大肠杆菌。所述出发菌具体可为大肠杆菌bl21(de3)。

所述步骤(1)中，所述“将重组菌进行诱导表达”具体为：将所述重组菌在含氨苄青霉素的lb液体培养基中培养至菌液od600nm＝1-2；向培养体系中加入iptg进行诱导。所述lb液体培养基中，氨苄青霉素的浓度为50μg/ml。所述培养条件为37℃、220rpm培养。所述iptg的浓度为30ppm。所述诱导的条件为30℃、220rpm诱导16h。

所述步骤(1)中，所述“收集菌体并进行菌体破碎，然后收集上清液”具体为：收集菌体，用磷酸缓冲液重悬所述重组菌菌体后超声，将超声破碎产物离心后收集上清液。所述磷酸缓冲液为20mm(ph7.5)磷酸缓冲液。所述超声的功率为250w，超声时间为20min(超声5s，停10s)。所述离心的条件为4℃、12000×g离心1h。

所述步骤(2)中，纯化采用镍柱(gehealthcarebio-scienceab，货号：17-5248-01)和脱盐柱(gehealthcarebio-scienceab，货号：17-1408-01)实现。

所述步骤(3)中，所述催化反应体系由缓冲液、底物、特定蛋白质和nad+组成。

所述缓冲液为0.5mtris-hcl(ph为8.0)。

所述底物为5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为20mm。

所述特定蛋白质在反应体系中的浓度为1000u/l。

所述nad+在反应体系中的浓度为20mm。

所述催化反应条件为30℃、200rpm反应12h。

本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述特定蛋白质和5-甲基-2-吡嗪醛；所述试剂盒的用途为制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。所述试剂盒中还包括0.5mtris-hcl(ph为8.0)。所述试剂盒中还包括nad+。

本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述重组菌和5-甲基-2-吡嗪醛；所述试剂盒的用途为制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。所述试剂盒中还包括0.5mtris-hcl(ph为8.0)。所述试剂盒中还包括nad+。

本发明首次利用特定的酶高效地实现了5-甲基吡嗪-2-羧酸的一步化生产。本发明工艺简单，所有原料和酶在一个反应器内一步反应即可制备5-甲基-2-吡嗪酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，催化氧化反应基本上不受产物5-甲基-2-吡嗪酸的抑制，高浓度的转化可以获得高收率，简化了提取工艺，有利于大规模工业化生产。

附图说明

图1为pet21a-xylc质粒图谱。

图2为5-甲基-2-吡嗪羧酸标准品液相色谱图。

图3为5-甲基-2-吡嗪羧酸标准曲线。

图4为核磁共振碳谱(cnmr)图。

图5为核磁共振氢谱(hnmr)图。

图6为产物5-甲基-2-吡嗪羧酸结构式。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

假单胞菌pseudomonasputida来源的xylc基因如序列表的序列1所示。假单胞菌pseudomonasputida来源的醛脱氢酶蛋白如序列表的序列2所示。序列1所示的基因编码序列2所述的蛋白质。

5-甲基-2-吡嗪醛：北京伊诺凯科技有限公司，cas：50866-30-3。

pet21a(+)质粒：novagen，产品目录编号：69740-3cn。

大肠杆菌bl21(de3)：天根生化科技(北京)有限公司，货号：cb105-02。

实施例1、高表达假单胞菌pseudomonasputida来源xylc基因的重组表达载体

采用序列表的序列1所示的双链dna分子取代pet21a(+)质粒的ndei和xhoi酶切位点间的小片段，得到重组表达载体pet21a-xylc(质粒图谱见图1)。

实施例2、醛脱氢酶的制备

1、将实施例1制备的重组表达载体pet21a-xylc转化大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌。重组菌表达可以得到c端融合有his6标签的醛脱氢酶蛋白。

2、将步骤1得到的重组菌接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm培养至菌液od600nm＝1-2，向培养体系中加入30ppmiptg，30℃、220rpm诱导16h。

3、完成步骤2后，将培养体系8000rpm离心，收集菌体沉淀。

4、完成步骤3后，采用20mm(ph7.5)磷酸缓冲液重悬菌体后超声，超声功率为250w，超声时间为20min(超声5s，停10s)。

5、完成步骤4后，将超声破碎产物4℃、12000×g离心1h后收集上清液。

6、对步骤5得到的上清采用镍柱(gehealthcarebio-scienceab，货号：17-5248-01)进行纯化，将上清液加载到镍柱，依次采用流动相a和流动相b洗脱，收集流动相b的洗脱液；再对洗脱液采用脱盐柱(gehealthcarebio-scienceab，货号：17-1408-01)进行脱盐处理，采用流动相c洗脱，最终得到纯化后的蛋白溶液。

流动相a：20mm(ph7.5)磷酸缓冲液(含20mm咪唑和0.5mnacl)；流动相b：20mm(ph7.5)磷酸缓冲液(含200mm咪唑和0.5mnacl)；流动相c：20mm(ph7.5)磷酸缓冲液。

7、对步骤6得到的纯化后的蛋白溶液进行蛋白定量，蛋白浓度为6.4mg/ml。

8、对步骤6得到的纯化后的蛋白溶液进行醛脱氢酶酶活力检测；反应体系中加入5-甲基-2-吡嗪醛、nad+和待测蛋白溶液1μl，h2o定容至1ml。5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为10mm，nad+在反应体系中的浓度为5mm。

待测蛋白溶液：采用20mm(ph7.5)磷酸缓冲液将步骤6得到的蛋白溶液稀释至浓度为1mg/ml。

采用分光光度计(仪器型号：uv-1800pc型)在线监测5min后，根据nadh在340nm的消光系数(6.22cm^-1·mmol^-1)计算得到酶的比活力为5u/mg。

酶的比活力(u/mg)＝(od340nm×1000)/(6.22cm^-1·mmol^-1×1cm×5min×1mg·ml^-1×0.001ml)

实施例3、醛脱氢酶制备5-甲基-2-吡嗪羧酸

反应体系(1ml)由缓冲液、底物、醛脱氢酶和nad+组成；缓冲液：0.5mtris-hcl(ph为8.0)；底物：5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为20mm；醛脱氢酶：实施例2步骤6得到的醛脱氢酶蛋白溶液，醛脱氢酶在反应体系中的浓度为1000u/l；nad+在反应体系中的浓度为20mm。

反应条件：30℃、200rpm反应12h。

反应结束后将反应体系稀释10倍后hplc检测产物浓度。

hplc色谱条件：仪器型号：agilent1200series；色谱柱：nucleosil100c18，4.6×250mm，5μm；柱温：25℃；紫外检测波长：275nm；采集时间：10min；进样量：5μl；流速：1.00ml/min；流动相由a相和b相组成，a相为0.1％(体积百分含量)tfa水溶液，b相为乙腈，a相和b相的体积比为80:20。

采用5-甲基-2-吡嗪羧酸作为标准品(上海百舜生物科技有限公司，cas：5521-55-1)。

标准品色谱图见图2，5-甲基-2-吡嗪羧酸标准品的出峰时间为3.776min；在相同条件下出峰位置为±0.5min以内，可以认定为同一物质。

5-甲基-2-吡嗪羧酸标准曲线见图3。

收集5-甲基-2-吡嗪羧酸对应的洗脱峰，通过核磁一步验证产物表征。

核磁共振碳谱(cnmr)图见图4。核磁共振氢谱(hnmr)图见图5。

经过上述检测，结果表明，产物为5-甲基-2-吡嗪羧酸(结构式如图6所示)；每个反应体系底物消耗量为88％(约17.60mm)，得到产物5-甲基-2-吡嗪羧酸的量为17.02mm。

sequencelisting

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸

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<213>假单胞菌(pseudomonasputida)

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