一种正长链十三碳二元酸的生物发酵新方法与流程

本发明属于生物化工领域，涉及一种生物法合成生产长链十三碳二元酸的方法与菌株及正长链十三碳二元酸产品。

背景技术：

长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸，一般指直链二元酸。而麝香酮是天然麝香中具有生理活性的主要有效成分之一，可以代替天然麝香配制成多种名贵的中成药，具有抗菌消炎、通经活血等疗效。用混合二元酸与乙二醇酯制成的麝香-m，为生产高级香料提供了新原料和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。以十三碳二元酸(dc13)为原料合成的麝香-t，可做定香剂，

此外，十三碳二元酸还是润滑油添加剂和耐寒性增塑剂等的重要原料；酯类润滑油基础油的分子结构容易控制，不同结构对润滑油基础油的相应指标影响比较明显。酯类润滑油分子量越大，闪点越高；支链越多，倾点越低；支链增加，粘度指数提高。因此从一元醇和长链十三碳二元酸合成优良润滑油基础油，例如以十三碳二元酸与与带支链的脂肪族一元醇直接酯化获得双酯型化合物，其凝点不高于20℃，闪点不低于210℃，通常40℃时运动粘度为10-100mm2/s，粘度指数不低于130，不同产品之间互溶性好，作为润滑油基础油能够满足绝大部分高温或低温条件下的使用要求。与普通的矿物油相比，酯类润滑油具有更加优良的黏温性和低温性，挥发率低，化学性能稳定，可降解，可再生，抗燃性好，被广泛用于航空发动机润滑油、高温链条油、压缩机油、高档汽车发动机油、精密仪表油、金属切割液等各个高端领域。

十三碳二元酸可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂；生产时需要防火、防爆和防毒装置，收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单，常温常压下就能生产，无污染、收率高，具备成本优势。然而，生物法合成十三碳二元酸的现有方法中，依然存在发酵水平不高，产品纯度达不到制备长链二元酸酯的要求，特别是二元酸产品中由于发酵菌株α，ω-氧化位点的不同，会产生一定含量的一元酸杂质，此外现有技术的发酵方法获得产品通常为粉末状产品，这给后面合成高级香料或合成尼龙的工艺带来巨大不便。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种片状形态十三碳二元酸的新方法，该方法是基于以下发现：以基因高通量筛选结合特定诱变方法，筛选出一株热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301(保藏号cctccno.m2014546，保藏日期为2014年11月4日，保藏地点为武汉大学，中国典型培养物保藏中心，分类命名candidatropicalisc1301)，其一方面能保持现有高水平发酵生产dc13的能力或略有提高，又具有高度专一的α，ω-氧化能力，使得产品一元酸的含量大大降低，即热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301为具有单一产品二元酸的高产菌株。此外，该菌株发酵并使用本发明的精制方法获得产品十三碳二元酸，形态为片层结构，大大减少了粉末程度，使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求，更加符合欧美市场特别是欧盟市场对无尘化产品的要求，特别适合高级润滑油、高级尼龙树脂的加工利用。

热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301的生理特征如下：

一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，l-阿戊糖+，d-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鲜醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。

三、生长素的需要：生物素++，维生素b1++，维生素b2+，维生素b6+，维生素b12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。

四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。

发明所述的发酵转化正十三烷(nc13)生产十三碳二元酸(dc13)的方法是以热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301为发酵菌种，在以正十三烷为基质的培养基混合液中同步发酵，生产α，ω-正十三碳二元酸。

发明所述的发酵转化正十三烷(nc13)生产十三碳二元酸(dc13)的方法的步骤为：

第一阶段为生产热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301的种子培养，即

优选地，把用一株热带假丝酵母c1301(candidatropicalis)培养成的种母液接入ph值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。

优选地，本发明的种子培养基：

(1)、10巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)、10巴林糖度的麦芽汁液体培养基；

(3)、烷烃种子培养基包含：kh2po46～12g/l，酵母膏3～8g/l，玉米浆3～8g/l，蔗糖3～6g/l，重蜡40～70g/l，自来水配置，自然ph。

优选地，培养种子的过程为：取一接种环热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(φ15×180试管，每支装6～7ml培养基，灭菌后放成斜面)，于29～30℃培养40小时。取1～2支上述培养好的菌种全部刮入装有30ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中，于29～30℃220转/分的旋转摇床上培养40～48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的斜面菌种全部刮入装有500ml培养基的5000ml三角瓶中，于200转/分的旋转摇床29～30℃培养44～48小时，菌株生长od值达到0.6～0.85时，作为发酵液的种子。

应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到od值达到0.6～0.85，作为发酵液的种子即可。

优选地，用本发明的c1301菌株生产长链二元酸，特别是十三碳二元酸的第二阶段是：

优选地，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入ph值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。

更优选地，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入ph6.0～6.8的含有15～30％(v/v)的c13的正烷烃和85～70％(v/v)发酵培养基的混合液中。

优选地，发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～15g/l，最好为6～10g/l，氯化钠0.5～2.5g/l，最好为1.0～2.0g/l，消泡剂400～1200ppm，重蜡或蔗糖15～30g/l及一些其他公知的营养源。

应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以根据菌体在不同培养罐中的环境对上述条件进行改变。

优选地，所述热带假丝酵母c1301(candidatropicalis)的发酵培养阶段为：将所述混合液在24～34℃下转化48～168小时，然后将生产的十三碳二元酸进行分离纯化。

更优选地，所述热带假丝酵母c1301(candidatropicalis)的发酵培养阶段为：在ph6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最优选地在27～31℃通气发酵72～168小时。

优选地，发酵阶段的第一阶段中，体系ph控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系ph控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。更优选地，从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从kh2po4或nah2po4中选一种。

优选地，本发明还包括将发酵液中产物十三碳二元酸分离回收阶段：

即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至ph10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集dc13钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集dc13钠盐和dc13，用水或有机溶剂进行重结晶，得到dc13白色结晶。

用本发明的热带假丝酵母c1301菌株和发酵方法，可在50m³发酵罐，从nc13发酵生产dc13时，发酵150小时，产酸量达265g/l以上，转化率达到90％以上，dc13纯度达到99％以上，其中一元酸的含量小于0.01％。此外，令人意外地，本发明的dc13产品具有令人满意的片层状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的dc13产品具有令人满意的片层状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。

附图说明

图1为本发明方法实施例1制备的十三碳二元酸片层状产品；

图2为本发明对比例1制备的十三碳二元酸粉末产品；

图3为本发明方法实施例2制备的十三碳二元酸片层状产品；

图4为本发明对比例2制备的十三碳二元酸片层状产品。

具体实施方式

在本发明的一个实施例中，提供了以热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301为发酵菌种，在以正十三烷为基质的培养基混合液中同步发酵，生产α，ω-正十三碳二元酸的方法。

优选地，在本发明的一个实施例中，所述的发酵方法为转化正十三烷(nc13)生产十三碳二元酸(dc13)的方法的步骤为：

第一阶段为生产热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301的种子培养，即

优选地，把用一株热带假丝酵母c1301(candidatropicalis)培养成的种母液接入ph值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。

优选地，在本发明的一个实施例中，所述种子培养基为：

(1)、10巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)、10巴林糖度的麦芽汁液体培养基；

(3)、烷烃种子培养基包含：kh2po46～12g/l，酵母膏3～8g/l，玉米浆3～8g/l，蔗糖3～6g/l，重蜡40～70g/l，自来水配置，自然ph。

优选地，在本发明的一个实施例中，培养种子的过程为：取一接种环热带假丝酵母(candidatropicalis)c1301酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(φ15×180试管，每支装6～7ml培养基，灭菌后放成斜面)，于29～30℃培养40小时。取1～2支上述培养好的菌种全部刮入装有30ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中，于29～30℃220转/分的旋转摇床上培养40～48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的斜面菌种全部刮入装有500ml培养基的5000ml三角瓶中，于200转/分的旋转摇床29～30℃培养44～48小时，菌株生长od值达到0.6～0.85时，作为发酵液的种子。

应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到od值达到0.6～0.85，作为发酵液的种子即可。

优选地，在本发明的一个实施例中，用本发明的c1301菌株生产长链二元酸，特别是十三碳二元酸的第二阶段是：

优选地，在本发明的一个实施例中，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入ph值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。

更优选地，在本发明的另一个实施例中，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入ph6.0～6.8的含有15～30％(v/v)的c13的正烷烃和85～70％(v/v)发酵培养基的混合液中。

优选地，在本发明的一个实施例中，发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～15g/l，最好为6～10g/l，氯化钠0.5～2.5g/l，最好为1.0～2.0g/l，消泡剂400～1200ppm，重蜡或蔗糖15～30g/l。

应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以根据菌体在不同培养罐中的环境对上述条件进行改变。

优选地，在本发明的一个实施例中，所述热带假丝酵母c1301(candidatropicalis)的发酵培养阶段为：将所述混合液在24～34℃下转化48～168小时，然后将生产的十三碳二元酸进行分离纯化。

优选地，在本发明的一个实施例中，所述热带假丝酵母c1301(candidatropicalis)的发酵培养阶段为：在ph6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最优选地在27～31℃通气发酵72～168小时。

优选地，发酵阶段的第一阶段中，体系ph控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系ph控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。更优选地，从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从kh2po4或nah2po4中选一种。

优选地，在本发明的一个实施例中，还包括将发酵液中产物十三碳二元酸分离回收阶段：

即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至ph10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集dc13钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集dc13钠盐和dc13，用水或有机溶剂进行重结晶，得到dc13白色结晶。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)、取一接种环热带假丝酵母c1301菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。

(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有kh2po48g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，ph5.0。

(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6nnaoh调一次ph至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含kh2po410g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nc13200ml/l，自来水配置，ph7.2。在110℃下灭菌30分钟。

发酵结束后，用6n的hcl调节ph至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到dc13白色结晶，用15ml中性乙醇溶解后，用标准naoh溶液滴定，计算出发酵液中dc13含量为130g/l，纯度98.23％，其中一元酸含量0.030％。

实施例2：

(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。

(2)把3000ml培养两天，od(×30，620nm)为0.81ph3.8，健壮，无杂菌种液接入装有700l种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。

(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700l种液接入装有6.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。

(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有33m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nc134m³，30小时内，体系ph控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生28.5g/ldc13，然后体系ph在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到120g/l，70小时后每天补加一定量nc13，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达235.8g/l，发酵到163小时结束，产酸量达265g/l。

发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc13，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状dc13产品。nc13转化率为94.5％，后处理总收率达到91.5％，dc13纯度达到99.65％，其中一元酸的含量0.002％。

对比例1：

该对比例使用中国科学院微生物所许可专利菌株热带假丝酵母热带假丝酵母(candidatropicalis)突变株p-12-242，保藏号为cgmccno.0297菌株(参见专利zl97103876.7)，其他方法同实施例1即：

(1)、取一接种环热带假丝酵母p-12-242菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。

(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有kh2po48g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，ph5.0。

(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6nnaoh调一次ph至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含kh2po410g/l，蔗糖20/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nc13200ml/l，自来水配置，ph7.2。在110℃下灭菌30分钟。

发酵结束后，用6n的hcl调节ph至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到dc13白色粉末，用15ml中型乙醇溶解后，用标准naoh溶液滴定，计算出发酵液中dc13含量为81.6g/l，纯度90.23％，其中一元酸的含量为大于3.6％。

此外，通过附图1的比较，本发明的实施例1获得产品晶体更大，而对比例1获得产品基本为粉末状。

对比例2：

该对比例使用中国科学院微生物所许可专利菌株热带假丝酵母热带假丝酵母(candidatropicalis)突变株p-12-242，保藏号为cgmccno.0297菌株(参见专利zl97103876.7)，其他方法同实施例2即：

(1)、种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。

(2)、把3000ml培养两天，od(×30，620nm)为0.81ph3.8，健壮，热带假丝酵母p-12-242无杂菌种液接入装有700l种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。

(3)、把步骤(2)中培养的健壮，无杂菌的700l种液接入装有6.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。

(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的无杂菌种液种液，接入装有33m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nc134m³，30小时内，体系ph控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生21.3g/ldc13，然后体系ph在7.0～8.0，继续发酵，70小时后每天补加一定量nc13，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达142g/l，发酵到163小时结束，产酸量达190g/l。

发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nc13，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓h2so4至ph3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色粉末状dc13产品。nc13转化率为93.1％，dc13纯度达到96.54％，其中一元酸的含量大于3.8％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。