一种玉米秸秆同步发酵工艺的制作方法

本发明涉及生物质能源制备领域，具体涉及一种玉米秸秆同步发酵工艺。

背景技术：

能源危机早在几十年之前就已经悄然步入人类的视线之中，伴随着上世纪中叶的能源危机，世界上的能源储备正在急速下降，为了我们人类的繁衍生息，各国都在可再生能源这一块投入了相当大的精力。因为能源就是人类能持久生活下去的保障。石油资源虽然储备量很大，但它毕竟是有限的，从石油出口国竞相上涨的油价可以看出能源短缺的问题离我们越来越近了。可燃冰和太阳能资源一直是各国科学家研究的热点，但到目前为止，开发难度还是非常大，高额的使用成本也让很多人望而却步。最近几十年间，科学家已经将视线转移到生物质能源这一领域，生物质能源是众所周知的清洁能源，很多国家已经将生物质能源应用到汽车和家用领域。生物质能源可以以气液固三种形态存在，为其广泛的使用提供了很好的前提。

乙醇是常见的生物质能源之一，在当今社会起着不可或缺的作用，每年收割季节的废弃秸秆往往可以用来进行乙醇的生产。乙醇与可燃冰和太阳能一样是清洁能源，在开发利用时对环境污染很小，甚至可以达到无污染。玉米秸秆发酵产酒精工艺的进展正在如火如荼的探索之中。但是想进行商业化的大规模生产仍然有很多问题，如何提高乙醇的得率和获得高转化率已经是研究的热点。在我国每年收割季节之后，废弃玉米秸秆的处理方式一直都是一个不可避免的问题，在环境问题越来越重视的今天，世界各国对新能源开发这一领域都投入了相当大的力度。玉米秸秆在农户家通常采用直接集体焚烧或者自然风干售卖的方式进行处理，这两种方式都没有对玉米秸秆进行高效的利用。仅我国每年的玉米秸秆产量都达到上亿吨，如果能将这些玉米秸秆进行发酵产酒精，那么每年我国的酒精产量会大幅度上升，由此可见玉米秸秆的研究前景十分广阔。

中国是能源消耗的大国，也是始终是走在世界前列的产乙醇大国，鉴于我国能源的紧缺，乙醇这种新能源的大力开发可以解燃眉之急。我国国内乙醇的总产量每年可以达到140万吨，在所有乙醇工厂生产乙醇的过程中，使用淀粉质类和糖蜜类原材料的占相当多的比例。随着我国科学家在生物质能源方面研究的不断突破，玉米秸秆已经被科学家认为是可以低成本大批量生产乙醇的重要材料，随着生产工艺的不断扩大和改进，利用玉米秸秆中的纤维素生产乙醇的发酵工艺越来越成熟，国内各大高校和科研院所均有卓越性的进展。

而玉米秸秆的收割是整个工艺的第一步，这就涉及到玉米秸秆收割时间和存储方式的一系列问题。农作物秸秆种植普遍都具有季节性，通常都不能一次性利用，如何进行存储和存储几个月是一个影响其内部纤维素转化率的问题。如果在收获时间和收获方式上采用有利于后续发酵工艺流程的方式，就又可以在秸秆预处理和水解步骤上进一步优化，使得秸秆原材料可以得到更充分的利用。露天下阳光暴晒至秸秆含水量降至最低是农村收割季节后较常见的废弃秸秆处理方法，农村的玉米秸秆通常采用这种简单的方式，这是由于废弃秸秆较多，收集起来费时费力，一般在农作物收割后，统一收集起来进行晒干，直到玉米秸秆的含水量小于10％。根据气候和环境差异，存储的时间也由天气而定。在干存储的过程中，干物质的损失量大约在15％，而且秸秆属于易燃物品，安全问题也是需要考虑的一环。湿法青储是一种不同于干存储的存储方式，在废弃秸秆前处理工艺中是一个较新的方法。具体方法是收集还没有干旱老化的玉米秸秆，应保证秸秆中含水量在50％以上或者更多，将满足此条件的玉米秸秆收集后密封保存，在存放一定时间后再解封使用。湿存储是在玉米秸秆废弃后直接进行收集存储，这可以提高秸秆的收割效率，不必等晒干的时间，同时也增加了原料的均一性，使秸秆中干物质的损失降到最低。所以说粒径，时间和存储方式都会对玉米秸秆同步发酵的工艺产生影响，系统的分析不同前处理方式对玉米秸秆发酵工艺的影响很有必要。

同步糖化发酵法在以玉米秸秆为原料生产乙醇的工艺流程中表现优异，它与以往的发酵方法不同，此法可以最大程度的降低总反应体系中的反馈抑制作用。它让玉米秸秆的水解和发酵在同一个体系中进行，在这个反应体系中，纤维素酶利用玉米秸秆为底物产糖后直接被酿酒酵母发酵成为乙醇。避免了浓度过高而对反应产生的反馈抑制作用和处理分步反应时大量副产物的难题。整个工艺流程只有一步，这使得设备的利用率得到提升，也缩短了整个工艺的反应时间，此法从长远的经济效益来看是尤为必要的。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种玉米秸秆同步发酵工艺，利用农作物废弃的秸秆发酵产酒精，从而获得了燃料乙醇，也同时增加了社会的效益，解决了秸秆焚烧污染环境的问题，且通过工艺参数的优化，大大提高了乙醇的得率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种玉米秸秆同步发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：

s1、收集还没有老化的含水量在50％以上的秸秆置于低温条件密封保存3个月后，取出，粉碎至粒径为2.5cm的玉米秸秆颗粒；

s2、使用1.5％naoh溶液对所得的玉米秸秆颗粒进行浸泡，然后置于80℃恒温水浴条件下反应1h进行碱式抽提反应；反应完毕后，将所得产物用纯水水洗至中性ph，然后进行烘干处理；

s3、取酿酒干酵母适量，按od值为2的比例进行溶解，然后将菌液转移至配置好的土豆培养基上进行培养，待其上长满菌后，进行转管纯化，继续培养，待纯化后的酿酒酵母刚好长满斜面试管培养基后，备用；

s4、将步骤s2所得的玉米秸秆置于初始底物浓度为1g/100ml的反应体系内，纤维素酶用量为30fpu/g，β-葡萄糖苷酶用量为15fpu/g，加入酿酒酵母使体系中酵母的od值为2，柠檬酸钠调节ph为4.8，然后在36℃的条件下，以每分钟80rmp的速度同步糖化发酵96h，发酵完成后，使用高速离心机以10000r/min的速度离心5min，弃掉玉米秸秆残渣沉淀，得水解液；

s5、在所得的水解液中按质量比1％加入适量活性炭，从而完成水解液的脱毒处理。

本发明利用农作物废弃的秸秆发酵产酒精，从而获得了燃料乙醇，也同时增加了社会的效益，解决了秸秆焚烧污染环境的问题，且通过工艺参数的优化，大大提高了乙醇的得率。

附图说明

图1为本发明实施例中的葡萄糖标准曲线。

图2为本发明实施例中的乙醇标准曲线。

图3为本发明实施例中不同粒径条件对酒精吸光度的影响。

图4为本发明实施例中不同存储时间对酒精吸光度的影响。

图5为本发明实施例中不同存储方式对酒精吸光度影响.

图6为本发明实施例中活性炭脱毒前后对酒精吸光度的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用玉米秸秆产自吉林省吉林市九站经济技术开发区附近农村。通过以下方法完成玉米秸秆三种主要成分的测定：

(1)纤维素含量测定

①材料准备：取预处理前后的玉米秸秆样品适量，粉碎机粉碎过筛，精确称量过筛后的玉米秸秆样品0.1g加入到锥形瓶中，加入等比例醋酸和硝酸混合液共5ml，置于沸水浴中加热30分钟，水浴完毕后进行冷却，再全部转至50ml离心管中，不足45ml时加超纯水补齐，置于低速离心机中以4000r/min的速度离心20分钟，离心后取沉淀，将沉淀水洗三次后置于鼓风干燥箱中干燥备用。

②含量测定：烘干后的样品置于锥形瓶中，加10ml质量分数为10％的硫酸和10mll的0.1mol/l的重铬酸钾溶液，摇匀，沸水浴10分钟。待冷却后加体积为5ml的5％的碘化钾溶液和体积为1ml的1％的淀粉溶液，体系混合完全后用质量分数为0.2mol/l的na2s2o3滴定至溶液刚显蓝色且溶液在半分钟内不变色。另做一未加秸秆的空白对照。

③纤维素含量计算：

x＝t(a1-a2)/(m*24)(1)

其中：t-硫代硫酸钠的浓度，单位为mol/l；a1-空白滴定所消耗的na2s2o3的体积，单位为ml；a2-溶液所消耗的na2s2o3的体积，单位为ml；m-玉米秸秆的质量；“24”-1molc6h10o5所对应的na2s2o3的摩尔分数。

(2)半纤维素含量测定

①材料准备：取预处理前后的玉米秸秆样品适量，粉碎机粉碎过筛，精确称量过筛后的玉米秸秆样品0.1g加入到锥形瓶中，加入体积为10ml的80％的硝酸钙溶液，摇匀后置于沸水浴加热5分钟后放冷，加入蒸馏水稀释溶液并过滤残渣，残渣用蒸馏水水洗3～5次，置于鼓风干燥箱中烘干备用。烘干后的样品加10ml2mol/l盐酸，沸水浴45分钟，待溶液完全冷却后滴加一滴酚酞指示剂，再用2mol/lnaoh中和溶液至玫瑰色，然后进行过滤，并水洗滤渣，最后合并滤液和洗涤液测体积。

②葡萄糖标准曲线的制作：按表1每个试管加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水，结果如图1所示。

表1标准曲线的配置

③含量测定：取1ml待测定的液体于刻度试管中，加入放置7天后可以使用的dns溶液2ml，混合均匀之后置于水浴锅中沸水加热5分钟，完毕后让试管冷却至室温，再加入蒸馏水定容至15ml，于紫外分光光度计540nm波长下测光吸收值，每组平行测定三次吸光值，将结果取平均值后代入公式计算还原糖的量，最后将计算后的结果乘以0.9即可以得到半纤维素的量。

(3)木质素含量测定

①材料准备：取预处理前后的玉米秸秆样品适量，粉碎机粉碎过筛，精确称量过筛后的玉米秸秆样品0.1g加入到锥形瓶中，加入总体积为10ml的1％的醋酸溶液，浸泡30分钟过滤，用1％醋酸溶液洗涤滤渣一次，于鼓风干燥箱中烘干备用。烘干后的样品放入等体积的乙醇和乙醚混合液共计4ml进行浸泡处理，5分钟之后将待测液体离心取沉淀，将沉淀物用蒸馏水水洗3～5次，水洗完毕后再加入总体积为3ml的73％的硫酸溶液，轻微搅拌后将溶液放置16小时，再加入体积为10ml水，置于水浴锅加热3～5分钟，最后补加体积为5ml的蒸馏水和体积为0.5ml的10％的氯化钡溶液，离心取沉淀，将离心后的沉淀残渣水洗2～3次，转置于鼓风干燥箱烘干备用。

②含量测定：烘干后的样品置于锥形瓶中，加10ml质量分数为10％的硫酸和10ml浓度为0.1mol/l的重铬酸钾溶液，摇匀，沸水浴10分钟。待冷却后加体积为5ml的5％的碘化钾溶液和体积为1ml的1％的淀粉溶液，体系混合完全后用质量分数为0.2mol/l的na2s2o3滴定至溶液刚显蓝色且溶液在半分钟内不变色。另做一未加秸秆的空白对照。

③木质素含量计算：

x＝t(a1-a2)/(m*48)(2)

其中：t-na2s2o3的浓度，单位为mol/l；a1-空白滴定消耗的na2s2o3的体积，单位为ml；a2-溶液消耗na2s2o3的体积，单位为ml；m-玉米秸秆的质量，单位为g；“48”-1molc11h12o4所对应的na2s2o3的摩尔分数。

实施例

步骤一、玉米秸秆的前处理

(1)不同粒径大小处理：将玉米秸秆按照一定的尺寸粉碎至2.5cm、1.5cm、0.5cm。

(2)不同存储时间处理：即将收割后的玉米秸秆晒干后室温储存3个月、6个月、12个月。

(3)不同存储方式处理：包括不粉碎干储存(将收集的秸秆置于室外干燥)；粉碎干储存(将收集的秸秆按需求进行不同程度的粉碎后置于室外干燥)；不粉碎湿储存(收集还没有老化的含水量在50％以上的秸秆置于低温条件密封保存)；粉碎湿储存(将收集的未老化的玉米秸秆按要求粉碎后再置于低温条件密封保存)。

步骤二、使用1.5％naoh溶液对前处理后的玉米秸秆进行浸泡，然后置于80℃恒温水浴条件下反应1h进行碱式抽提反应。待反应完毕后将碱处理后的样品用纯水水洗至中性ph，再经过烘干处理后用于同步糖化发酵和成分测定。

步骤三、取用酿酒干酵母适量，按od值为2的比例进行溶解，然后将菌液转移至配置好的土豆培养基上进行培养，待其上长满菌后，进行转管纯化，继续培养，待纯化后的酿酒酵母刚好长满斜面试管培养基后，配置酿酒酵母菌液，准备用于同步发酵。

步骤四、将步骤二所得的玉米秸秆样品置于初始底物浓度为1g/100ml的反应体系，纤维素酶用量30fpu/g，β-葡萄糖苷酶用量15fpu/g，加入酿酒酵母使体系中酵母的od值为2，柠檬酸钠调节ph为4.8，然后在36℃的条件下，以每分钟80rmp的速度同步糖化发酵，体系的总反应时间为96h，在一定时间点取样，使用高速离心机以10000r/min的速度离心5min，弃掉玉米秸秆残渣沉淀，得水解液，然后后测定水解液中乙醇的含量。

步骤五、在所得的水解液中按质量比1％添加适量的活性炭，从而实现水解液的脱毒处理。乙醇含量的测定

(1)原理：本试验采用重铬酸钾法测定发酵液中酒精的含量。乙醇在溶入硫酸溶液后可以被重铬酸钾定量氧化成绿色产物(三价铬)。氧化产物的最大吸收波长为600nm，其吸光度与所含有的乙醇浓度成正比例。

(2)5％重铬酸钾溶液的配置：准确称取5.00g重铬酸钾溶于50ml水中，然后加入10ml的浓硫酸，待溶液反应并完全冷却后，加水定容至100ml。

(3)乙醇标准溶液：使用移液枪精确转移无水乙醇0.25ml至100ml容量瓶中并定容。此时溶液中每毫升液体相当于2.0mg乙醇。

(4)标准曲线的绘制：按表2配置标准溶液

表2乙醇标准曲线的制作

每管加体积为2ml的5％重铬酸钾溶液，蒸馏水补加至刻度。沸水浴加热十分钟，然后用流水冷却，以一号管作为参比，于600nm处测定吸光度，以乙醇浓度和对应吸光度值作标准曲线(图2)。

(5)样品分析：取离心后样品1ml于比色管，加入2.0ml5％的重铬酸钾溶液，加水至刻度，空白管仍为一号管，600nm测定吸光度，每个吸光度做三组平行。最后根据吸光度值的平均值查出乙醇的含量(mg)。样品体积为1ml，占总体积的1/10，所以计算乙醇含量时需乘以10。

结果与分析

成分分析如表3所示，结果表明在该条件下纤维素回收率较高，可以达到94.32％，半纤维素部分溶出，回收率为61.91％，木质素大部分能够除去，移除率为56.82％。

表3预处理前后成分测定

0.5cm、1.5cm、2.5cm粒径条件下，同步发酵过程中酒精吸光度变化如图3所示：玉米秸秆在三种前处理的对比条件下，2.5cm粒径大小的玉米秸秆产酒精的量最多。这可能是由于玉米秸秆粉碎至不同粒径大小后，对储存和后续的预处理以及酶水解的过程都产生了很大的影响。热传递受介质大小的影响，故三种不同粒径下的传热速度会有差异，这会使不同条件下的反应速度有所不同，所以如果能采用较为合适的粒径大小进行前处理，有助于提高后续工艺中玉米秸秆预处理的效率以及酶水解后葡萄糖的得率，葡萄糖得率升高之后，转化为乙醇的量也随之增加，进而降低秸秆发酵产酒精的成本。其中的原理是在预处理时，由于热量及质量传递的速度的不均衡，就有可能导致大粒径生物质外表面受热过度，一些副产物随之增加，这会使其内部反应不充分，甚至未反应；而对于小粒径生物质来说，它的半纤维素等物质可能会因为粒径过小，整个反应过程很迅速，反应进行的较为剧烈而过度降解了其中的物质，最终导致其结构破坏严重，无法获得预期的产物。由此可见，系统地分析不同粒径大小所产生的差异对纤维素乙醇工艺过程的发展尤为必要。

存储时间为3个月，6个月，12个月的条件下，同步发酵过程中酒精吸光度变化如图4所示：在三种不同存储时间下，存储时间为3个月的玉米秸秆酒精产率优于其它两组，存储时间为6个月的玉米秸秆酒精产率也比12个月的得率稍高，可以看出随时间的延长，玉米秸秆发酵酒精的产率随之降低。这可能是由于随着存储时间的延长，玉米秸秆内部产生了其它对发酵工艺有抑制作用的产物，这些物质对后续工艺有阻碍作用，所以不利于玉米秸秆的进一步反应。也可能是由于随着时间的延长，玉米秸秆的含水量发生变化，内部纤维结构发生变化，最终影响发酵产酒精的得率。还有可能是由于秸秆在干燥过程中一直处于阳光暴晒的过程，在长时间高温的条件下产生了副产物，不利于后续反应。

存储方式为不粉碎湿储存，不粉碎干储存，粉碎湿储存，粉碎干储存条件下，秸秆同步发酵过程中酒精吸光度变化如图5所示：湿法青储处理的玉米秸秆产率要比直接干储存的效果好，主要原因可能是由于湿存储的玉米秸秆保持了本身的柔性纤维结构，这种结构更佳利于水解和发酵的进行。而且不粉碎的秸秆堆积松散，利于气体流通，给微生物生长提供了条件。适宜条件下微生物可以通过降解代谢对秸秆内部结构产生影响。所以湿法保存优于干法保存，不粉碎处理优于粉碎处理。

为清楚展示同步发酵液经脱毒处理前后对其产生的影响，随机选取几组玉米秸秆发酵液进行脱毒前后对比，再将结果取平均值。如图6所示，图中的曲线清晰的展现了的同步糖化发酵液脱毒前后对其产生的影响，可见同步糖化发酵液经脱毒处理后，对其后续反应的进行有很大的帮助作用，同时也利于酒精产率的提升。

根据定期采样所测得的吸光度值，带入曲线公式计算得出1ml秸秆发酵液中乙醇的量，所取发酵液的1ml占测定量的1/10，实际上将样液稀释了10倍，故将结果乘以10得出最终乙醇的产量mg/ml，再将其转化为g/l，就能计算出1g秸秆的酒精产量和酒精的得率。

本试验中的同步糖化发酵最大转化率为0.1804g/g(干秸秆)。

下表为1g玉米秸秆同步糖化发酵72h后，糖化发酵液的酒精产量和得率。

表4不同前处理条件下酒精的最优产率与最优得率

综上所述，同步糖化发酵液中乙醇的含量虽随着时间的增加而增加，但是在72小时时基本达到峰值，再继续发酵乙醇的含量也没有明显的上升趋势，固判断同步发酵反应72小时较为合适。对不同粒径大小的玉米秸秆，2.5cm粒径的乙醇得率最高，为0.1804g/g，0.5cm和1.5cm粒径的乙醇得率分别为0.1428g/g和0.1562g/g：对于不同存储时间，存储时间为3个月的玉米秸秆乙醇得率最高，为0.1750g/g，而存储时间为6个月和12个月的乙醇得率都为0.1616g/g；对于不同的存储方式，不粉碎湿存储时乙醇的得率最佳，可达0.1589g/g，不粉碎干存储稍低，为0.1428g/g，粉碎湿存储和粉碎干存储分别为0.1267g/g和0.1321g/g。也就是说在条件为存储方式为不粉碎湿存储、存储时间为3个月、粒径大小为2.5cm的前处理条件下玉米秸秆同步糖化发酵的乙醇得率最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。