一种利用玉米秸秆为原料发酵生产微生物油脂及酯化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，特别涉及一种利用玉米种植业副产物的玉米秸杆为原 料，深黄被孢霉为菌株，发酵生产微生物油脂及醋化的方法。
【背景技术】
[0002] 随着能源危机、粮食短缺、环境污染等问题越来越严重，如何使农业废弃物无害 化、资源化利用已成为亟待解决的关键问题关。玉米秸杆是一种丰富的农业废弃物，是可再 生资源，是生物质资源中应用潜力最大储量、最为丰富的资源之一。陈洪章等在文献《China Basic Science，2009, 5:32-37》的"面向新一代生物及化工产业的生物质原料炼制关键过 程"，报道了玉米秸杆是新一代生物及化工产业最具价值的工业通用原料。而李飞跃，汪建 飞等在《农业工程学报，2013，（14): 1-7》的"中国粮食作物秸杆焚烧排碳量及转化生物 炭固碳量的估算"，报道了全世界种植的各种农作物每年可产生近20亿吨的秸杆，中国每年 产生的秸杆量约为7亿吨，玉米秸杆的年产量高达23010万吨，其中约有42. 2%的玉米秸杆 被闲置浪费或者就地焚烧，造成了严重的资源浪费和环境污染。虽然玉米秸杆的产量大，但 是其经济系数低，资源化利用率低。
[0003] 玉米秸杆组成中的纤维素、半纤维和木质素是天然的生物质能源材料。生物质能 作为唯一的可再生碳源，是太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量，其以生物质为载 体的能量，其直接或间接地来源于绿色植物的光合作用，可转化为常规的固态、液态和气态 燃料。目前玉米秸杆的利用没有科学的深化，从玉米综合利用的延伸及发展的角度看，这是 对生物质资源的浪费。
[0004] 微生物油脂又称单细胞油脂，是由藻类、真菌类等微生物，利用碳水化合物、碳 氢化合物和普通油脂为碳源，在菌体内转化为油脂储存。Economou，Ch.N.，d a乂在 《Bioresource Technology, 2011， 102: 9737-9742》的"Single cell oil production from rice hulls hydrolysate"报道了稻壳水解液发酵产单细胞油脂，其油脂可占菌体干 重的20%微生物油脂经酯化为脂肪酸酯为制备生物柴油原料。
[0005] 发展玉米秸杆资源产业，带动相关行业发展，促进国民经济的增长。保证农民长久 增收，促进农业发展。开拓新的微生物油脂资源是降低生物柴油价格和保障生物柴油产业 持续发展的关键。
【发明内容】
[0006] 针对微生物油脂及酯化的现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种利用玉米 秸杆为原料发酵生产微生物油脂及酯化的方法。
[0007] 本发明以玉米秸杆为原料，经酸预处理和酶水解法制备玉米秸杆水解液，其水解 液处理并浓缩，添加氮源，以深黄被孢霉I ia知为出发菌株发酵产微生物油脂，通过 酯化获得脂肪酸酯。
[0008] 本方法使用玉米秸杆价格低廉，可降低微生物油脂生产成本，实现玉米秸杆资源 高值化利用。同时，减少玉米种植业废弃物对环境的污染，为玉米秸杆综合利用提供新的途 径，所得微生物油脂经酯化可作为生物柴油，具有良好的工业化应用前景。
[0009] 本发明提供的一种利用玉米秸杆为原料发酵生产微生物油脂及酯化的方法，其步 骤和条件如下： (1) 玉米秸杆酸处理 在反应釜中加入碎粉至40-200目玉米秸杆，按照干燥的玉米秸杆的质量g与水的体积 mL的配比为1:8-14加入水，再加入该溶液总体积的0. 5-1. 25%的硫酸，于100-160°C恒温 60-150min，采用过滤或离心的方法得到玉米秸杆酸处理的上清液和玉米秸杆酸处理的滤 渣； (2) 玉米秸杆滤渣酶水解 在反应釜中加入步骤（1)玉米秸杆酸处理的滤渣，按该滤渣干重g与水的体积mL的配 比为1: 6-12加入水，并按该滤渣干重再加入25FPU/g的纤维素混合酶，该混合酶的活性 为80-160IU/mL，于40-60°C保温50-80h，采用过滤或离心的方法得到玉米秸杆酶解的上清 液； (3) 玉米秸杆水解液的中和 将步骤（1)和（2)得到的上清液混合，再将其浓缩至所含的还原糖质量浓度为60-80 g /L，用Ca (0H) 2调pH值为6. 0-7. 5,40-70°C恒温20-30min，离心除去沉淀，得到玉米秸杆水 解液； (4) 油脂微生物发酵培养 a. 种子培养：在无菌条件下将已长满深黄被孢霉（ifor(i<9r<^/7a 分生孢 子的试管斜面加入2-3mL无菌水，轻轻振荡使之悬浮于无菌水中，吸取孢子悬浮液加入已 灭菌的马铃薯葡萄糖培养基中，摇瓶培养温度28-30°C，摇瓶转速80-100r/min，培养时间 20-24h，得到种子液； 所述的马铃薯葡萄糖培养基的组成为：质量/体积浓度为20%的土豆汁1000mL，葡萄 糖 20g，KH2P04 3g，MgS04. 7H 20 1. 5g，pH 6. 0 ; 所述的所述的马铃薯葡萄糖培养基在121°C条件下灭菌15min ; b. 发酵培养：在步骤（3)得到的玉米秸杆水解液中，添加玉米秸杆水解液体积的 0. 8-1. 4g/L硫酸铵，在玉米秸杆水解液中接入步骤（4)的a得到种子液，接入的种子液是 玉米秸杆水解液体积的6-10%，在全自动发酵装置中进行培养，发酵温度28-30°C，通气量 0. 5-0. 8vvm，搅拌转速120-200r/min，发酵周期72-120h，过滤或离心获得油脂微生物菌 体；所述的玉米秸杆水解液在121°C条件下灭菌15min; (5) 微生物油脂制备 将步骤（4)的b得到的油脂微生物菌体干燥，采用超临界二氧化碳萃取干燥的油 脂微生物菌体细胞内油脂，条件为：二氧化碳流量20-25kg/h、萃取时间l-3h、萃取压力 20-35MPa、萃取温度30-45°C、分离I温度50°C、分离I压力8Mpa、分离II温度38°C、分离 II压力4. 8Mpa，得到微生物油脂； (6) 微生物油脂酯化 在反应釜中加入步骤（5)得到的微生物油脂，按照微生物油脂与甲醇的摩尔比 1 : 8-14加入甲醇，再加入微生物油脂质量0. 5-1. 4wt%的KOH，搅拌，搅拌速度400r/min， 反应温度55-70°C，反应l_3h后，停止搅拌，静置，水洗涤分离，干燥，获得脂肪酸酯。
[0010] 有益效果:本发明提供的一种利用玉米秸杆为原料发酵生产微生物油脂及酯化的 方法，使用价格低廉的玉米秸杆，可降低微生物油脂生产成本，所得微生物油脂经酯化可作 为生物柴油，符合工业化生产的要求。同时，玉米秸杆是一种丰富的农业废弃物因其具有充 足的供应和低廉的价格，若利用生物转化技术将其转化为平台化合物，实现玉米种植业副 产物资源高值化利用，具有较大的社会效益和经济效益。本发明的方法得到经预处理玉米 秸杆中纤维素水解率为90-96 %、玉米秸杆转化率63-70%、菌体生物量13. 22-15. 18g/L、 油脂含量41. 23-48. 00%和油脂产量7. 34-8. 23g/L、微生物油脂酯化率91. 12- 93. 39 %。 [0011] 利用本发明的方法处理后的玉米秸杆，除生产较高含量及产量的微生物油脂外， 其剩余组分及提油后菌柏仍可满足作为饲料的需要。而且，水解后获得的可发酵糖可作为 微生物发酵的培养液用于生产各种生物发酵产品。这是对玉米综合利用的延伸及发展，是 对生物质资源的充分利用，符合循环经济的科学发展趋势。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 一种利用玉米秸杆皮渣为原料发酵生产微生物油脂及酯化的方法如下： (1) 玉米秸杆预处理 在反应釜中加入粉碎至40目的干燥的玉米秸杆，按照干燥的玉米秸杆与水的质量g与 体积mL比为1: 9加入水，再加入该溶液总体积的1. 2%的硫酸，于100°C恒温120min，采用 过滤或离心的方法得到玉米秸杆酸处理的上清液和玉米秸杆酸处理的滤渣； (2) 玉米秸杆滤渣酶水解 在反应釜中加入步骤（1)玉米秸杆酸处理的滤渣，按该滤渣干重g与水的体积mL的配 比为1:11加入水，并按该滤渣干重再加入25FPU/g的纤维素混合酶，于50°C保温78h，采用 过滤或离心的方法得到玉米秸杆酶解的上清液； (3) 玉米秸杆水解液的中和 将步骤（1)和（2)得到的上清液混合，再将其浓缩至所含的还原糖质量浓度为60g /L， 用0&(011)2调pH值为7. 0,60°C恒温30min，离心除去沉淀，得到玉米秸杆水解液； (4) 油脂微生物发酵培养 a.种子培养 加入2mL无菌水，轻轻振荡使之悬浮于无菌水中，吸取孢子悬浮液加入已灭菌的马铃 薯葡萄糖培养基中，摇瓶培养温度28°C，摇瓶转速lOOr/min，培养时间24h，得到发酵种子 液。
[0013] 所述的马铃薯葡萄糖培养基的组成为：质量/体积浓度为20%的土豆汁1000mL， 葡萄糖20g，KH 2P04 3g，MgSOj 7H20 1. 5g，pH 6.