生产香紫苏醇的方法
【专利说明】
[0001] 本发明是2009年02月12日申请的发明名称为"生产香紫苏醇的方法"的第 200980104742. 6号发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明提供了一种生产香紫苏醇的方法，所述方法包括使至少一条多肽与焦磷酸 香叶基香叶酯（GGPP)接触。具体而言，所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇， 这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物。本发明还提供在本发明方法中使用的多 肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸以及含所述核酸的表达载体也是本发明的一部 分。经转化以在生产香紫苏醇的方法中使用的非人宿主生物体或细胞也是本发明的一个目 的。
【背景技术】
[0003] 萜见于大多数生物体（微生物、动物和植物）。这些化合物由称为异戊二烯的五 碳单元构成，并由其结构中存在的这些单元的数目来划分。因此，单萜、倍半萜和二萜分别 为含10、15和20个碳原子的萜。二萜例如可广泛见于植物界，并且已描述了超过2500种 的二?构造（Connolly and Hill, Dictionary of terpenoids, 1991, Chapman&Hall, Lond on)。萜分子由于其风味和香味特性以及其化妆、医药和抗微生物效果，一直是数千年来的兴 趣所在。由例如蒸汽蒸馏或溶剂提取等各种手段获得的植物提取物被用于萜的来源。萜分 子通常原样使用，但在某些情况下利用化学反应来将萜转化为其他高价值分子。
[0004] 萜的生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶。二萜的合成可通过单--种酶或通过 两种或更多种酶来进行。当涉及两种酶时，第一种酶催化二萜焦磷酸酯的合成，随后该酯被 第二种酶转化为最终产物。
[0005]自然界存在两种类型的环化机理，它们与可分为I类二萜合酶和II类二萜合酶的 两种类型的二猫合酶有关（Wendt and Schulz, 1998, Structure. 6 (2): 127-33)。对于某些 二萜来说，其环化机理自GGPP的焦磷酸酯的酯官能的离子化起始，接着是所得碳阳离子与 内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合酶为I类二萜合酶。二萜的生物合成中由II 类二萜合酶催化的第二种环化模式由GGPP的端末双键的质子化起始，并在内部重排和质 子消除之后，产生环状二萜焦磷酸酯中间体。
[0006] 编码来自两类中每类二萜合酶的基因和CDNA已被克隆出，并且重组酶也已鉴定 出来。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级结构提供了信息。某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下来，并且要么与依赖质子化的环化相关，要么与依赖离子化的环化 相关。DDxxD基序（其中x代表任何氨基酸）见于一些I类二萜合酶。所述基序很可能参 与焦磷酸酯部分的连接和离子化。在II类合酶中发现了保守的DxDD基序（其中x代表任 何氨基酸），其中涉及第二天冬氨酸残基作为质子供体。
[0007] 香紫苏醇是天然产生的二萜分子，其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香 分子的起始材料。开发这类合成用于提供龙涎香一一由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物 质一一的代用品。龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识，并且在历史上已被用作加香 成分。由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求，并且特别是由于对鲸类的保护，已经开 发了带有龙涎香特征的龙涎香成分和分子的化学合成。在这些分子中，Ambrox Ki (瑞士 Firmenich SA的注册商标）是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于Ambrox@合 成的最广泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇。
[0008] 通常，植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、油的收率以及地理 来源。此外，天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他地区 条件，使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难，甚至于不可能。因此，提供 极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的。化学合成似乎是制备香紫苏醇 的显然选择。但是，考虑到其高度复杂的结构，制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难 的。由此，能够合成香紫苏醇的生物化学路径将引起极大的兴趣。
[0009] 在植物和其他生物体中进行的萜的生物合成早已有广泛研宄，在此不赘述，但可 参考Dewick，Nat. Prod. R印?，2002, 19, 181-222,其回顾了萜的生物合成路径的现有技术状 况。
[0010] 一些二萜合酶早已被鉴定出。特别是与本发明的序列具有一定百分比的序列同一 性的萜合酶也早已见于序列数据库。尽管如此，已知的二萜合酶与本发明的多肽之间的同 一性百分比非常低。
[0011] 与本发明的LPP合酶最接近的合酶是两种焦磷酸柯巴酯合酶（一种来自番茄 (Solanum lycopersicum) (BAA84918)，另一种来自舆瓜（Cucurbita maxima) (AAD04293 和 AAD04292))--一种来自野甘草（Scoparia dulcis) (BAD91286)的推定的焦磷酸柯巴醋合 酶以及一种来自葡萄（Vitis vinifera)的假定蛋白质。这些蛋白质的序列与本发明的LPP 合酶仅有41%的同一性，并且没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 也未描述它们具有LPP合酶活性。
[0012] 与本发明的香紫苏醇合酶最接近的合酶为与本发明的多肽具有36%同一性的 不确定功能的类萜环化酶（编号从^14八598912)，与本发明的多肽具有32%同一性的黄 瓜（Cucumis sativus)的对映体贝壳杉烯合酶（编号BAB19275)，与本发明的多肽具有 32 %同一性的来自水稻（Oryza sativa)的对映体咖萨二稀（ent-cassadiene)合酶（编 号 ABH10734，公布于Xu, Wilderman，Morrone，Xu, Roy, Margis-Pinheiro, Upadhyaya，Coat es and Peters, Functional characterization of the rice kaurene synthase-like gene family, Phytochemistry,68(3)，2007, 312-326)以及与本发明所提供的香紫苏 醇合酶具有32 %同一性的来自水稻（Oryza sativa)的对映体贝壳杉稀合酶（编号 AAQ72559，公布于Margis-Pinheiro, Zhou, Zhu, Dennis and Upadhyaya, Isolation and characterization of a DS-tagged rice(Oryza sativa L.)GA-responsive dwarf mutant defective in an early step of the gibberellins biosynthesis pathway, Plant Cell R印.，23(12)，2005, 819-833)。此外，没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的 生产，特别是没有记载它们能催化由LPP至香紫苏醇的转化。
[0013] 除序列本身之间的区别外，还需要指出的是，由上述酶合成的产物的结构和性质 与香紫苏醇和LPP极为不同。焦磷酸柯巴酯的性质与焦磷酸赖百当烯二醇酯（LPP)极为不 同。具体而言，与LPP不同，焦磷酸柯巴酯不能在香紫苏醇的生物合成中作为中间产物使 用。对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯与香紫苏醇也极为不同。对映体贝壳杉烯是一种三 环二萜，其不含任何醇官能团，这与香紫苏醇不同，后者为双环二醇。此外，对映体贝壳杉烯 为用于调节生长的植物激素的前体，其在香料和调味料领域中没有任何用途，而如上所述， 香紫苏醇在这些技术领域中备受关注。
[0014] 现有技术的一篇文献与香紫苏醇合酶特别相关（Banthorpe, Brown and Morris,Partial purification of farnesyl pyrophosphate:Drimenol cyclase and geranylgeranyl pyrophosphate:Sclareol cyclase, using cell culture as a source of material，Phytochemistry 31，1992, 3391-3395)。在该文献中，一种来自粘毛烟草 (Nicotiana glutinosa)的部分纯化的蛋白质被鉴定为香紫苏醇合酶，但是对于该蛋白质 的氨基酸序列、编码它的核酸的核苷酸序列以及该蛋白质在香紫苏醇的体外或体内生物合 成的方法中的用途没有给出任何启示。此外，该文献既没有教导也没有暗示两种蛋白质（I 类和II类二萜合酶）参与对由GGPP至香紫苏醇的转化的催化。相反，其教导了一种单一 的部分纯化蛋白质负责香紫苏醇的合成。
[0015] W02008/007031公开了一种具有焦磷酸顺式柯巴基-8-醇酯合酶的蛋白质，编码 所述蛋白质的核苷酸序列，以及包含所述核酸的载体和转基因非人生物体。然而，这种焦磷 酸顺式柯巴基-8-醇酯合酶与本发明的多肽极为不同，这是因为所公开的蛋白质与本发明 融合多肽中的本发明方法中使用的LPP合酶仅有44%的氨基酸序列同一性。
[0016] 本发明的一个目的是提供如上所述以经济的方式制造香紫苏醇的方法。因此，本 发明的目的是生产香紫苏醇同时具有很少的浪费，这是一种更加节能并且节约资源的方 法，同时降低对化石燃料的依赖。本发明的另一目的是提供一种能合成用作香料和/或芳 香成分的香紫苏醇的酶。
[0017] 现有技术文献均未公开由非环状二萜前体GGPP来生物合成生产香紫苏醇的方 法。
[0018] 伸用的缩写
[0019] bp 碱基对
[0020] kb 千碱基
[0021] BSA 牛血清白蛋白
[0022] DMAPP 焦磷酸二甲基烯丙酯
[0023] DNA 脱氧核糖核酸
[0024] cDNA 互补 DNA
[0025] dT 脱氧胸腺嘧啶
[0026] dNTP 脱氧核苷酸三磷酸
[0027] DTT 二硫苏糖醇
[0028] FPP 焦磷酸法呢酯
[0029] GC 气相色谱
[0030] GGPP 焦磷酸香叶基香叶酯
[0031] idi 焦磷酸异戊烯酯异构酶
[0032]IPP 焦磷酸异戊烯酯
[0033] IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖苷
[0034] LB 溶菌肉汤
[0035] LPP 焦磷酸赖百当烯二醇酯
[0036] M0PS0 3- (N-吗啉代）-2-羟基丙磺酸
[0037] MS 质谱
[0038] mvaKl 甲羟戊酸激酶
[0039] mvaK2 甲羟戊酸焦磷酸激酶
[0040] PCR 聚合酶链式反应
[0041] 3' _/5' -RACE 3' 和 5' cDNA 末端快速扩增
[0042] RMCE 重组酶介导的盒式交换
[0043] RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应
[0044] RNA 核糖核酸
[0045] mRNA 信使核糖核酸
[0046] RuBisCO 核酮糖-1，5-焦磷酸羧化酶
[0047] SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0048] SsLPPs 快乐鼠尾草焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶
【发明内容】
[0049] 本发明提供一种以经济、可靠并且可再现的方式通过生物合成来生产香紫苏醇的 方法。
[0050] 在本发明中，香紫苏醇、GGPP、LPP以及本申请中引用的其他所有化合物均由图1 所示的它们的结构式定义。
[0051] 对于本申请的目的而言，"二萜合酶"或"具有二萜合酶活性的多肽"指的是能催化 由非环状萜前体GGPP起始或由二萜焦磷酸酯如LPP起始的萜分子合成的多肽，或是能催化 由非环状二萜前体GGPP起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽。
[0052] 对于"LPP合酶"或"具有LPP合酶活性的多肽"，这里我们指的是能催化由GGPP起 始的LPP合成的多肽。
[0053] 对于"香紫苏醇合酶"或"具有香紫苏醇合酶活性的多肽"，这里我们指的是能催化 由LPP起始的香紫苏醇合成的多肽。
[0054] 对于"能催化由GGPP至香紫苏醇的转化的多肽"，这里我们指的是能催化所述转 化的任何多肽，特别是催化两步机理--其中LPP作为中间产物而被合成--的多肽。
[0055] 多肽催化特定二萜（例如香紫苏醇）和/或特定二萜焦磷酸酯（例如LPP)的合 成的能力可通过进行实施例3中详述的酶活性测定而容易地确认。
[0056] 根据本发明，多肽还表示包括截短的多肽，条件是它们要保持如上任意实施方案 中所定义的二萜合酶活性，并且与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的相应片段，或者与SEQ ID N0:3的相应片段有至少所定义百分比的同一性。特别有用的截短的多肽是那些N末端缺失 了质体定位信号的多肽。
[0057] 两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时， 在两条序列中相同的氨基酸或核酸残基的数目的函数。相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基。这里所用的序列同一性的百分比是由最优比对，通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以100而计算得到的。最优比对 是这样一种比对，其中同一性百分比可能为最高。在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对。在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残 基来考虑。
[0058] 以确定氨基酸或核酸序列同一性为目的的比对可使用计算机程序（例如为 万维网上可得的公用计算机程序）以各种方式来实现。优选可使用来自National Center for Biotechnology Information(NCBI)的地址为 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/bl2seq/wblast2. cgi 的 BLAST 程序（Tatiana 等的 FEMS Microbiol Lett.，1999, 174:247-250, 1999)，其参数设为默认，以获得肽序列或核苷酸序列的最优比 对，并计算序列同一性的百分比。
[0059] 因此，本发明的一个目的是一种生产香紫苏醇的方法，包括：
[0060] (a)将GGPP与至少一条具有LPP合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO: 1 或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列；
[0061] (b)将步骤（a)中生产的中间产物与至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽接 触，该多肽包含与SEQ ID N0:3有至少50%同一性的氨基酸序列；并且
[0062] (c)非强制性选择地将步骤（b)中生产的香紫苏醇分离。
[0063] 根据一个优选的实施方案，通过将GGPP与所述至少一条具有LPP合酶活性的多 肽和所述至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽一起接触，该生产香紫苏醇的方法的步骤 (a)和（b)同时进行。
[0064] 对于本申请的目的而言，在说步骤（a)和（b)同时进行时，我们指的是，仅有一个 动作对于想进行本发明而获得两步骤结果的人来说是必需的，即将GGPP与至少两条多肽 接触，或与至少一条下面所描述的融合多肽接触。然而，香紫苏醇的生产仍然以两步机理进 行，如图2所示。首先，通过LPP合酶或通过具有LPP合酶序列的融合多肽的一部分，在香 紫苏醇合酶的存在下，由GGPP原位合成出LPP。所生产的LPP直接与香紫苏醇合酶直接接 触，或与具有香紫苏醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接触，该前体一产生，所述酶就催 化该前体至香紫苏醇的转化。
[0065] 根据一个优选的实施方案，生产香紫苏醇的方法的步骤（a)和