23特异性引物一起进行第二轮PCR。该PCR方法得到了 1271&口的〇0嫩片段$吧0(5￡0 10勵：15))，该片段与？吧3片段（5￡0 10勵:9)有192匕口 完全重叠，并且含有含终止密码子的3'末端和相应cDNA的3'非编码序列。
[0197] 为了扩增cDNA的5'末端，设计了对FN23(SEQ ID N0:9)有特异性的反义寡核 苷酸：FN23-R1 (SEQ ID N0:16)、FN23-R2 (SEQ ID N0:17)、FN23-R3 (SEQ ID N0:18)。根据 Marathon?cDNA扩增试剂盒方案（Clontech, Mountain View, CA)，使用快乐鼠尾草cDNA文 库将这些引物用于5'RACE。热循环条件如下：94°C下1分钟，94°C下30秒和72°C下4分钟 共5个循环，94 °C下30秒和70 °C下4分钟共5个循环，94 °C下30秒和68 °C下4分钟共20个 循环。该5'狀0￡得到了144%?的〇0嫩片段$财0(5￡0 10勵：19)，该片段与？吧3(5￡0 10 勵:9)有227匕口完全重叠。与已知二萜合酶序列的比较显示出^财0片段（5￡〇10勵:19)含 有翻译起始密码子和87bp的非编码区。三条cDNA片段（FN23、FN30和FN40(SEQ ID N0:9、 SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 19)的拼接得到了 2655bp的全长cDNA序列（SaTpsl)，其带有 编码具有785个残基的蛋白质（SEQ ID N0:21)的2355bp(SEQ ID N0:20)的开放阅读框， 所述蛋白质与二萜合酶即与焦磷酸柯巴酯合酶有很强的同源性。参与由质子化引发的环化 反应的DxDD基序存在于氨基酸序列（第372位），而未发现参与由离子化引发的环化反应 的DDxD基序。因此，该蛋白质序列具有专门催化依赖于质子化的GGPP的环化反应的II类 二萜合酶的典型特征。该蛋白质的异源表达以及酶鉴定详见后面的实施例2~4。
[0198] 实施例2
[0199] 怏乐鼠尾草LPP合酶在大肠杆菌中的异源表汰
[0200] 使用为在17启动子的控制下表达而设计的pETDuet-1 (Novagen, Madison, WI)以 在大肠杆菌细胞中表达。为构建表达质粒，使用为在紧邻起始密码子之前引入Ndel位点并 在终止密码子之后引入KpnI位点而设计的正向引物和反向引物SaTps-Nde (SEQ ID N0:22) 和 SaTps-Kpn (SEQ ID NO: 23)，通过 PCR 从 cDNA 文库中扩增出 SaTpsl (SEQ ID NO: 20)的 开放阅读框。由于该阅读框在该阅读框的1614位置处含有Ndel位点，本次扩增通过重叠 延伸PCR(Horton等的Gene 77,61-68, 1989)分两步操作，其中使用引物SaTps-Nde(SEQ ID NO:22)和 SaTps-Kpn(SEQ ID NO:23)连同引物 Satps-mutlf(SEQ ID NO:24)和 Satps-mutlr (SEQ ID NO: 25)，它们设计用来移除Ndel位点而不改变氨基酸序列。所得cDNA 首先用T0P0 TA克隆试剂盒（Invitrogen，Carlsbad, CA)连接到PCR2. 1-Topo质粒中，在将 Ndel-Kpnl片段亚克隆到pETDuet-1载体之前对插入物的序列进行检验。
[0201] 使用SaTpsl特异性引物从cDNA文库扩增所得几条克隆的序列分析显示出在cDNA 序列中几个位置处具有一些变异性。鉴定了七个位置，其中可发现两种不同的氨基酸。所 发现的一个位置为在某些克隆中出现的丝氨酸残基的插入。这些位置列于下表：
[0202]
【主权项】
1. 一种生产香紫苏醇的方法，包括： (a) 将GGPP与至少一条具有LPP合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列； (b) 将步骤（a)中生产的LPP与至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽接触，该多肽包 含与SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列；并且 (c) 非强制性选择地将步骤（b)中生产的香紫苏醇分离。
2. 权利要求1的方法，其中所述具有LPP合酶活性的多肽包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少60%，优选至少70%，优选至少80%，更优选至少90 %同一性的氨基酸序 列，并且其中所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含与SEQ ID N0:3有至少60%，优选至少 70 %，优选至少80 %，更优选至少90 %同一性的氨基酸序列。
3. 权利要求2的方法，其中所述具有LPP合酶活性的多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2,并且其中所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含SEQ ID N0:3。
4. 权利要求3的方法，其中所述具有LPP合酶活性的多肽由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2组成，并且其中所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽由SEQ ID NO:3组成。
5. 前述任一项权利要求的方法，其中通过将GGPP与所述至少一条具有LPP合酶活性的 多肽和所述至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽一起接触来同时进行步骤（a)和步骤 (b) 〇
6. 权利要求1的方法，其中步骤（a)和步骤（b)通过将GGPP与至少一条融合多肽接 触而同时进行，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸 序列。
7. 权利要求6的方法，其中所述融合多肽包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2有至少 60 %，优选至少70 %，优选至少80 %，更优选至少90 %同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO: 3有至少60%，优选至少70%，优选至少80%，更优选至少90%同一性的氨基酸序列。
8. 权利要求7的方法，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3〇
9. 权利要求8的方法，其中所述融合多肽由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2以及SEQ ID NO:3组成。
10. 权利要求1~4中任一项的方法，其中步骤（a)和步骤（b)同时进行，并包括在有 助于香紫苏醇生产的条件下培养非人宿主生物体或细胞，该非人宿主生物体或细胞能生产 GGPP，并且经转化以表达前述任一项权利要求所定义的至少一条具有LPP合酶活性的多肽 以及前述任一项权利要求所定义的至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽。
11. 权利要求10的方法，还包括：在步骤（a)和步骤（b)之前，用编码所述具有LPP合 酶活性的多肽的至少一种核酸以及编码所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽的至少一种核 酸来转化能生产GGPP的非人宿主生物体或细胞，从而所述生物体表达所述多肽。
12. 权利要求11的方法，其中该编码具有LPP合酶活性的多肽的核酸包含与SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或它们的补体有至少60%，优选至少70%，优选至少80%，更优选至少 90%同一性的核苷酸序列，并且/或者其中该编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸包 含与SEQ ID NO: 6或其补体有至少60%，优选至少70%，优选至少80%，更优选至少90% 同一,性的核苷酸序列。
13. 权利要求12的方法，其中所述编码具有LPP合酶活性的多肽的核酸包含SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它们的补体，并且/或者其中所述编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽 的核酸包含SEQ ID N0:6或其补体。
14. 权利要求13的方法，其中所述编码具有LPP合酶活性的多肽的核酸由SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它们的补体组成，并且/或者其中所述编码具有香紫苏醇合酶活性的 多肽的核酸由SEQ ID NO:6或其补体组成。
15. 权利要求10或11的方法，其中所述非人宿主生物体或细胞用至少一种编码融合多 肽的核酸转化，从而所述生物体表达所述多肽，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转 化，并包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列。
16. 权利要求15的方法，其中用于转化非人宿主生物体或细胞的核酸包含与SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或它们的补体有至少60%，优选至少70%，优选至少80%，更优选至少 90%同一性的核苷酸序列以及与SEQ ID NO: 6或其补体有至少60%，优选至少70%，优选 至少80%，更优选至少90%同一,性的核苷酸序列。
17. 权利要求16的方法，其中所述核酸包含SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它们的补体 以及SEQ ID NO:6或其补体。
18. 权利要求17的方法，其中所述核酸由SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它们的补体以 及SEQ ID NO:6或其补体组成。
19. 权利要求10~18中任一项的方法，其中所述非人宿主生物体是植物、原核生物或 真菌。
20. 权利要求10~18中任一项的方法，其中所述非人宿主生物体是微生物。
21. 权利要求20的方法，其中所述微生物是细菌或酵母。
22. 权利要求21的方法，其中所述细菌是大肠杆菌（E. coli)，所述酵母是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)〇
23. 权利要求10~18中任一项的方法，其中所述非人宿主细胞是植物细胞。
24. -种融合多肽，其能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2有至少50%同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序 列。
25. 权利要求24的融合多肽，其包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2有至少60%，优 选至少70%，优选至少80%，更优选至少90%同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO: 3 有至少60 %，优选至少70 %，优选至少80 %，更优选至少90 %同一性的氨基酸序列。
26. 权利要求25的融合多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3。
27. 权利要求26的融合多肽，其由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3组 成。
28. -种核酸，其编码权利要求24~27中任一项的融合多肽。
29. 权利要求28的核酸，其包含与SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它们的补体有至少 50 %，优选至少60 %，优选至少70 %，优选至少80 %，更优选至少90 %同一性的核苷酸序 列，并包含与SEQ ID NO: 6或其补体有至少50 %，优选至少60 %，优选至少70 %，优选至少 80%，更优选至少90%同一,性的核苷酸序列。
30. 权利要求29的核酸，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体和/或SEQ ID N0:6或其补体。
31. 权利要求30的核酸，其由SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或它们的补体以及SEQ ID NO:6或其补体组成。
32. -种表达载体，其包含权利要求28~31中任一项的核酸。
33. 权利要求32的表达载体，其形式为病毒载体、噬菌体或质粒。
34. 权利要求32或33的表达载体，其包括本发明的核酸，该核酸可操作地连接至至 少一条控制转录、翻译、起始或终止的调控序列，例如转录启动子、操作子或增强子，或mRNA 核糖体结合位点，并非强制性选择地包括至少一个选择标记。
35. -种非人宿主生物体或细胞，其经转化以包藏至少一种编码具有LPP合酶活性并 包含与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸以及至 少一种编码具有香紫苏醇合酶活性并包含与SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列 的多肽的核酸，从而异源表达或过表达所述多肽。
36. 权利要求35的非人宿主生物体或细胞，其经转化以包藏至少一种编码融合多肽的 核酸，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2 有至少50%同一性并具有LPP合酶活性的多肽的氨基酸序列以及与SEQ ID NO: 3有至少 50%同一性并具有香紫苏醇合酶活性的多肽的氨基酸序列。
37. 权利要求35或36的非人宿主生物体，其中所述非人宿主生物体是植物、原核生物 或真菌。
38. 权利要求35或36的非人宿主生物体，其中所述非人宿主生物体是微生物。
39. 权利要求38的非人宿主生物体，其中所述微生物是细菌或酵母。
40. 权利要求39的非人宿主生物体，其中所述细菌是大肠杆菌，所述酵母是酿酒酵母。
41. 权利要求35或36的高等真核细胞，其中所述高等真核细胞是植物细胞。
42. -种生产能催化GGPP至香紫苏醇的转化的至少一条融合多肽的方法，包括： (a) 培养用权利要求32~34中任一项的表达载体转化的非人宿主生物体或细胞，从而 使其包藏权利要求28~31中任一项的核酸并表达或过表达由所述核酸编码并能催化GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽； (b) 将该能催化GGPP至香紫苏醇的转化的多肽从步骤（a)中培养的非人宿主生物体或 细胞中分离。
43. 权利要求42的方法，还包括：在步骤（a)之前，用权利要求32~34中任一项的表 达载体来转化非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏权利要求28~31中任一项的核酸并 表达或过表达由所述核酸编码的多肽。
44. 一种制备能催化GGPP至香紫苏醇的转化的变体融合多肽的方法，包括步骤： (a) 选择权利要求28~31中任一项的核酸； (b) 修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸； (c) 用该突变核酸序列来转化宿主细胞或单细胞生物体以表达由该突变核酸序列编码 的多肽； (d) 对该多肽进行至少一种修饰特性的筛选；并且 (e) 非强制性选择地，如果该多肽不具备想要的变体活性，则重复步骤（a)至（d)直至 获得具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽； (f) 非强制性选择地，如果在步骤（d)中鉴别出具有所需变体活性的多肽，则分离在步 骤（c)中获得的相应突变核酸。
【专利摘要】本发明提供了一种生产香紫苏醇的方法，所述方法包括(a)使一条具有LPP合酶活性的特定多肽与GGPP接触，以及(b)使一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽与步骤(a)中生产的焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)接触。具体而言，所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇，这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物。本发明还提供在该方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快乐鼠尾草并编码本发明多肽的核酸，含所述核酸的表达载体，以及经转化以包藏所述核酸的非人宿主生物体或细胞也是本发明的一部分。
【IPC分类】C12N9-88, C12N9-16, C12P7-02, C12N15-62
【公开号】CN104846020
【申请号】CN201510132253
【发明人】M·沙尔克
【申请人】弗门尼舍有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2009年2月12日
【公告号】CN101939430A, CN101939430B, EP2245161A1, EP2245161B1, US8586328, US20110041218, WO2009101126A1, WO2009101126A9