ratory Press 中。用于 高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体尤其是技术人员可获得的，见例如Schardl等 的 Gene 61:1-11， 1987。
[0150] 用于转化宿主微生物或细胞以包藏转基因核酸的方法是技术人员所熟悉的。例 如，对于创造转基因植物来说，现行的方法包括：植物原生质体的电穿孔法、脂质体介导的 转化方法、农杆菌介导的转化方法、聚乙二醇介导的转化方法、粒子轰击法、植物细胞显微 注射法以及使用病毒的转化方法。
[0151] 在一个实施方案中，经转化的DNA整合到非人宿主生物体和/或细胞的染色体中， 从而得到了稳定的重组体系。本领域公知的可用于本发明实践的染色体整合方法包括但不 限于重组酶介导的盒式交换（RMCE)、病毒位点特异性染色体插入法、腺病毒法以及核内注 射法。
[0152] 为了实施如上所公开的体外生产香紫苏醇的方法，提供一种制备如本发明任一实 施方案所述具有二萜合酶活性的至少一条融合多肽的方法是非常有利的。因此，本发明提 供了一种生产能催化GGPP至香紫苏醇的转化的至少一条融合多肽的方法，包括：
[0153] (a)培养用本发明的表达载体转化的非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏本发 明的核酸并表达或过表达由所述核酸编码并能催化GGPP至香紫苏醇的转化的多肽；
[0154] (b)将该能催化GGPP至香紫苏醇的转化的多肽从步骤（a)中培养的非人宿主生物 体或细胞中分离。
[0155] 根据一个优选的实施方案，所述方法还包括：在步骤（a)之前，用本发明的至少一 种表达载体来转化非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏至少一种本发明的核酸并表达或 过表达由所述核酸编码的多肽。
[0156] 非人宿主生物体或细胞的转化和培养可以如上所述的用于体内生产香紫苏醇的 方法来进行。步骤（b)可以本领域公知的用于从生物体或细胞中分离特定多肽的任何技术 来进行。
[0157] 在此所指的"多肽变体"意味着这样一种融合多肽，其能催化GGPP至香紫苏醇的 转化，并实质上与前述任一实施方案的多肽同源，但由于一个或多个缺失、插入或取代，其 氨基酸序列与由本发明的任何核酸序列编码的氨基酸序列不同。
[0158] 变体可包括保守取代的序列，这意味着某特定氨基酸残基可被具有相似物化特性 的残基所取代。保守取代的例子包括：用一个脂肪族残基取代另一个，例如用Ile、Val、Leu 或Ala彼此取代；或者用一个极性残基取代另一个，例如Lys和Arg之间，Glu和Asp之间， 或 Gin 和 Asn 之间的取代。见 Zubay，Biochemistry，Addison_Wesley Pub.Co.，（1983)。这 类取代的效果可用Altschul，（J. Mol. Biol. 219:555-65, 1991)中论述的取代打分矩阵如 PAM-120、PAM-200和PAM-250来计算。其他的这类保守取代，例如具有相似疏水特性的整 个区域的取代，也是公知的。
[0159] 天然形成的肽变体也包括在本发明之内。这类变体的例子为由选择性mRNA拼接 产生的蛋白质或由在此描述的多肽的蛋白酶剪切产生。归因于蛋白水解的变体例如包括： 由于从由本发明的序列编码的多肽上一个或多个端末氨基酸的蛋白水解移除而产生的在 不同类型宿主细胞中表达时N末端或C末端的差异。
[0160] 本发明的多肽的变体可用于获得例如所需的提高或降低的酶活性，修饰的区域化 学或立体化学，或改变的底物应用或产物分布，对底物的增强的亲和性，对一种或多种所需 化合物的生产的改善的特异性，酶促反应的提高的速率，在特定环境（PH、温度、溶剂等）中 的更高的活性或稳定性，或者在所需表达体系中提高的表达水平。变体或定位突变可由本 领域公知的任何方法产生。天然多肽的变体和衍生物可通过分离不同或相同植物品系或种 的天然形成的变体或变体的核苷酸序列而得到，或通过编码本发明的融合多肽的核苷酸序 列的人工规划性突变（programming mutation)而得到。对天然氨基酸序列的改变可通过 多种常规方法中的任一种来完成。
[0161] 由附加肽序列在本发明多肽的氨基末端或羧基末端的融合产生的多肽变体可用 于增强多肽的表达，有助于蛋白纯化或提高多肽在所需环境或表达体系中的酶活性。这类 附加肽序列例如可以是信号肽。因此，本发明还涉及本发明多肽的变体，例如通过与其他寡 肽或多肽融合而得到的那些和/或与信号肽连接的那些。
[0162] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备能催化GGPP至香紫苏醇的转化 的变体融合多肽的方法，包括步骤：
[0163] (a)选择如上所公开的任一实施方案中的核酸；
[0164] (b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；
[0165] (c)用该突变核酸序列来转化宿主细胞或单细胞生物体以表达由该突变核酸序列 编码的多肽；
[0166] (d)对该多肽进行至少一种修饰特性的筛选；并且
[0167] (e)非强制性选择地，如果该多肽不具备想要的变体香紫苏醇合酶活性，则重复步 骤（a)至（d)直至获得具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽；
[0168] (f)非强制性选择地，如果在步骤（d)中鉴别出具有所需变体香紫苏醇合酶活性 的多肽，则分离在步骤（c)中获得的相应突变核酸。
[0169] 步骤（b)中，例如通过随机诱变、位点特异性诱变或DNA改组会产生大量的突变核 酸序列。基因改组的具体步骤见于Stemmer，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci U S A.，1994, 91 (22) : 10747-1075。简言之，DNA改组指的是已知序列在体外随机重组的过程， 涉及至少两种被选定用于重组的核酸。例如，可通过合成含突变序列的寡核苷酸而在特定 位点引入突变，所述突变序列侧生有能连接至天然序列的片段的限制位点。在连接之后，所 得的重构序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。或者，可采用寡核苷酸定位 的位点特异性诱变步骤来提供改变的基因，其中预定的密码子可通过取代、缺失或插入而 被改变。
[0170] 因此，包含SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5以及SEQ ID N0:6的融合多肽可与编码核 酸（例如由除快乐鼠尾草外的其他生物体中分离出的）的其他任何二萜合酶重组。因此，可 获得并分离出突变核酸，其可用于根据例如本实施例中公开的标准程序来转化宿主细胞。
[0171] 在步骤（d)中，对步骤（c)中获得的多肽进行至少一种修饰特性一一例如所需的 经修饰的酶活性一一的筛选。对表达多肽进行筛选的所需酶活性的例子包括由&或乂_ 值量度的提高或降低的酶活性，修饰的区域化学或立体化学以及改变的底物应用或产物分 布。酶活性的筛选可通过技术人员熟知的并在本实施例中公开的那些程序进行。
[0172] 提供步骤（e)用于重复步骤（a)~（d)的过程，优选其可并行操作。因此，通过创 造大量的突变核酸，可用不同的变体核酸同时转化多种宿主细胞，从而允许后续的更多数 量的多肽的筛选。由此，获得所需变体多肽的机会可任由技术人员而增加。
[0173] 本申请中提及的出版物均以参照的方式并入于此，以公开并描述与所引用出版物 有关的方法和/或材料。
【附图说明】
[0174] 图1 :说明书中引用的各种化合物的结构。
[0175] 图2 :由GGPP生物合成香紫苏醇的机理。酶促步骤1和2可由两种不同的蛋白质 (LPP合酶和香紫苏醇合酶）催化，或由单--种双功能酶（融合多肽）催化。
[0176] 图 3 :由 SsLPPs3(SEQ ID N0:4)和 SsLPPs9(SEQ ID N0:5)--两种密切相关的编 码cDNA的二萜合酶，出于本发明的目的而被分离出--推断出的氨基酸序列SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2的比对。相同残基为白色字母，两条序列间的不同残基为黑色字母。
[0177] 图 4 :来自表达 SsLPPs3 和 SsLPPs9 蛋白质（SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2)的大 肠杆菌细胞的粗可溶蛋白质提取物的SDS-PAGE分析。1泳道和8泳道：分子量标准物；2泳 道和7泳道：由用质粒不经插入而转化的细胞所得到的对照蛋白质；3泳道和4泳道：来自 用pEIDue-SsLPPs3转化的细胞的蛋白质；5泳道和6泳道：来自用pEIDuet-SsLPPs9转化 的细胞的蛋白质。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色。
[0178] 图5 :在大肠杆菌中表达的亲和纯化重组鼠尾草二萜合酶SsLPPs3(SEQ ID N0:1) 的SDS-PAGE分析。M泳道：分子量标准物；1泳道：来自对照细胞的粗可溶蛋白质提取 物；2泳道：来自用pET28-SsLPPs3转化的细胞的粗可溶蛋白质提取物；3泳道：流经部分 (flow-through fractions) ;4~7泳道：冲洗部分；8~10泳道：使用250mM的L-组氨酸 的洗脱部分。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色。
[0179] 图6 :亲和纯化的SsLPPs3 (SEQ ID NO: 1)与GGPP -起培养后获得的产物的GC分 析。（A)直接溶剂提取；(B)用碱性磷酸酶处理后对同一试样进行溶剂提取。
[0180] 图7 :A全长和截短的SsLPPs3重组二萜合酶（SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:36~ 39)的N末端序列。B在大肠杆菌中表达的全长和截短的SsLPPs3二萜合酶的SDS-PAGE 分析。M泳道：分子量标准物；1泳道：来自对照细胞的粗可溶蛋白质提取物；2泳道：来 自用pET28-SsLPPs3转化的细胞的粗可溶蛋白质提取物；3泳道：纯化的用组氨酸标记的 SsLPPs3 ;4泳道和5泳道：各自为1 y L和0. 5 y L的来自用pETDuet-SsLPPs3转化的细胞 的粗可溶蛋白质提取物；5~9泳道：0. 5yL的来自用pETDuet转化的细胞的含有连续四个 缺失的粗可溶蛋白质提取物。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色。
[0181] 图8 :来自II类二萜合酶样片段的氨基酸序列与来自水稻（Oriza sativa)的 stemodene合酶（编号AAZ76733)的序列的比对。
[0182] 图9:用于在大肠杆菌中异源表达的来自1132构造体（SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:74)的氨基酸序列的比对。
[0183] 图10 :不同的1132重组蛋白与LPP-起培养后获得的产物的GC分析。来自表达 重组 SsTpsll32(1132-1-3，SEQ ID N0:3)和 1132-2-5(SEQ ID N0:74)蛋白质的大肠杆菌 的粗蛋白质提取物在最终体积为lmL的50mM M0PS0(pH 7,补充有15mM的MgCl2)中与LPP 一起培养。
[0184] 图11 :用重组1132-2-5蛋白质（SEQ ID N0:74)由LPP产生的产物的GC-MS分析。 (A)LPP与来自大肠杆菌、由pET101-1132-2-5转化的粗蛋白质提取物一起培养所得的产物 的总离子色谱图。（B)保留时间为14. 3时的峰的质谱图。（C)可靠香紫苏醇标准物的质谱 图。
[0185] 图 12 :1132 重组蛋白（SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:74)与 SsLPPs3 重组蛋白（SEQ ID NO: 1) -起在GGPP的存在下共培养之后获得的产物的GC分析。
[0186] 图13 :实施例10和实施例11中用于转化大肠杆菌的质粒的结构。
【具体实施方式】
[0187] 通过如下的实施例对本发明进行进一步详细描述。
[0188] 实施例1
[0189] 通讨PCR方法分离编码来自怏乐鼠尾草的cDNA的LPP合酶
[0190] A.植物材料和RNA提取
[0191] 从瑞士 Bassins的野外收集生长了花蕾（1. 5~2cm长，1~2日龄）的快 乐鼠尾草，并直接在液氮中冷冻。用来自Invitrogen(Carlsbad, CA)的Concert? 植物RNA试剂提取总RNA，根据制造商手册，用FastTrack" 2. OmRNA分离试剂盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)通过oligodT-纤维素亲和层析法纯化mRNA。用Marathon?cDNA 扩增试剂盒（Clontech, Mountain View, CA)构建 cDNA 文库。
[0192] B.用于扩增二萜合酶cDNA的聚合酶链式反应
[0193] 对来自不同植物的I类和II类二萜合酶的氨基酸序列进行比对，并选择保守基 序。从这些保守氨基酸基序中推断出简并的寡核苷酸序列。使用基序DxDDTAM(x为任何 氨基酸）一一其发现于二萜合酶氨基酸序列的中间部分，并假定参与与II类二萜合酶中的 GGPP的焦磷酸酯部分的相互作用--来设计正向引物DT3F(5'_(SEQ ID N0:7))。使用发 现于某些二萜合酶的另一基序DVW(I/L)GK(T/S)来设计反向引物DT4R(SEQ ID N0:8))。
[0194] 使用这些引物以所有可能的反向和正向引物的组合来进行PCR。PCR混合物含 有0? 4 y M的各引物、300 y M的各dNTP、5 y L的10XHotStartTaq" DNA聚合酶缓冲液 (Qiagen)、2 y L 的 100 倍稀释的 cDNA、0. 5 y L 的HotStartTaquDNA 聚合酶，总体积为 50 y L。循环条件为：94°C下45秒、50°C下45秒和72°C下2分钟共35个循环，以及72°C 下10分钟。在1%的琼脂糖凝胶上评价PCR产物的大小。将相应于预期大小的条带从凝 胶上切除，用QIAquickK.凝胶提取试剂盒（Qiagen)纯化，并使用T0P0 TA克隆试剂盒 (Invitrogen，Carlsbad，CA)在pCRu:2.1-T0P0 载体中克隆。随后，对所插入的 cDNA 片 段进行 DNA 测序，接着使用 BLASTX 算法（Altschul 等的 J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990) 将序列与GenBank非冗余蛋白质数据库（NCBI)比较。从所进行的不同PCR中，只有引物 DT3F(SEQ ID N0:7)和DT4R(SEQ ID N0:8)的组合获得了具有预期大小并与二萜合酶具有 序列同源性的DNA片段。来自本次扩增的所有片段都具有完全相同的序列。将该354bp的 序列命名为 FN23(SEQ ID N0:9)。
[0195] C.通过cDNA末端快速扩增（RACE)进行全长cDNA分离
[0196] 设计对FN23序列（SEQ ID N0:9)具有特异性的寡核苷酸：FN23-F1'（SEQ ID N0:10)、FN23-F2(SEQ ID N0:11)和 FN23-F3(SEQ ID N0:12)。这些引物与用接头序列 (5￡〇10勵：13)延长的〇118〇(11'引物一起用于町-?0?。町-?0?反应混合物的组成如下 ： 10 y 1 的 5X Qiagen OneSt印 RT-PCR 缓冲液、400 y M 的各 dNTP、400nM 的各引物、2 y 1 的Qiagen OneStep RT-PCR酶混合物、1 y 1的RNasin?核糖核酸酶抑制剂（Promega Co.，Madisson，WI)以及1250ng的总RNA，最终体积为50ml。热循环仪条件为：50°C下30分 钟（反转录）；95°C下15分钟（DNA聚合酶活化）；94°C下45秒、50°C下45秒和72°C下90 秒共35个循环；以及72°C下10分钟。使用RT-PCR产物作为模板与adapterP引物（SEQ ID N0:14)连同相同引物或巢式FN