气道上皮靶向定时剔除整合素β4动物模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及气道上皮靶向定时剔除整合素0 4动物模型 的构建方法。
【背景技术】
[0002] 哮喘患者的气道上皮存在着典型的组织结构破坏和功能损伤：气道上皮细胞松 动、脱落，对外界刺激的高敏感性和不正常的损伤修复及上皮结构重构。已知上皮细通过表 达不同类型的粘附分子实现"粘附"和"锚定"是上皮细胞结构完整的先决条件，粘附分子 的平衡表达对于维持气道上皮功能稳态有重要意义。
[0003] 整合素0 4在维持气道上皮的结构功能稳态中发挥重要作用，其表达缺陷可能参 与哮喘易感性构成。但是，要确认整合素0 4表达缺陷与哮喘易感性的直接因果关系证据， 需要在整体动物水平干扰整合素0 4在气道上皮的表达，复制出哮喘或气道高反应动物模 型。现有技术主要是全基因组整合素0 4敲除方法。全基因组整合素0 4敲除方法存在许 多缺陷，不能有效地观察整合素0 4在特定组织的的生理功能特性及其表达缺陷与哮喘发 病易感性的关系。具体而言，主要的缺点包括：1)致死效应：很多基因完全剔除会导致小鼠 胚胎早期死亡，无法对突变小鼠胚胎进行分析研宄；2)所产生的表型不知道是由哪一类细 胞引起的；3)不可控性：由于阳性筛选标记基因存在强的转录调控元件，筛选标记基因的 保留会导致干扰相邻基因的表达。总之，由于完全的基因剔除使小鼠从受精卵细胞开始就 实现所有细胞的基因缺失或突变，这样很多对于发育相当重要的基因剔除时会引起胚胎早 期死亡或严重的发育缺陷使突变无法传代，不能实现在小鼠的各个发育阶段进行基因的 功能分析。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种气道上皮靶向定时剔除整合素M动 物模型的构建方法，其特征在于实现一个基因在局部靶向器官的可调性性基因剔除。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0006] 所述气道上皮靶向定时剔除整合素e 4动物模型的构建方法包括如下步骤：
[0007] (1)构建出以整合素0 4为目的基因的整合素Mfloxed小鼠：选择小鼠基因打 靶 PGEM5 载体（GenBank:DQ778470. 1)，以小鼠整合素 0 4 基因（Gene ID:3691)第 5、6 外 显子作为条件性敲除的目的片段，在PGEM5载体两侧插入LoxP位点；以FVB品系小鼠Es细 胞基因组DNA为模板分步扩增包括整合素0 4第5、6外显子和上游同源臂在内的3. lkb基 因片段，以及下游同源臂4. 9kb基因片段；将扩增所得基因片段酶切后与pGEM5载体连接， 获得小鼠整合素0 4条件基因打靶载体；将小鼠整合素0 4条件基因打靶载体转染小鼠ES 细胞，用PCR扩增法，特异性探针杂交法及多酶切图谱法筛选ES细胞中的杂合子，将ES杂 合子（+/_)注入到宿主囊胚中，将获得的阳性胚胎注入到假孕鼠子宫中，通过DNA印迹杂 交及RNA印迹杂交筛选带有小鼠整合素0 4条件基因打靶载体基因的子代小鼠；再通过特 异性探针杂交法，DNA印迹杂交，RNA印记杂交筛选鉴定杂交获得的整合素fMfloxed小鼠； 其中所述的PCR扩增法、特异性探针杂交法、多酶切图谱法、DNA印迹杂交法、RNA印迹杂交 法均为本领域常规方法；
[0008] (2)构建 CCSP-rtTAline 和（otet)-Cre line 两种工具小鼠；
[0009] (3)将 CCSP-rtTAline 和（otet)-Cre line 两种小鼠杂交，建立 Cre-CCSP-(otet) 双转基因小鼠品系；
[0010] (4)用Cre-CCSP-(otet)小鼠与整合素0 4floxed小鼠杂交，建立 Cre-CCSP-(otet)-整合素0 4floxed三重杂交小鼠；
[0011] (5)将Cre-CCSP-(otet)-整合素0 4floxed三重杂交小鼠用多西环素进行诱导， 腹腔注射多西环素，所述多西环素的用量为〇. lmg/g，其中mg是多西环素的重量单位，g是 小鼠体重的单位，注射多西环素15天后得到气道上皮靶向定时剔除整合素0 4动物模型。
[0012] 以上步骤中，CCSP-rtTAline和（otet)-Cre line两种工具小鼠的构建方法，属于 业界常用方法。小鼠杂交及多西环素诱导，也属于比较常用的手段。
[0013] 优选地，步骤（1)详细过程如下：选择小鼠基因打靶pGEM5载体，以小鼠整合素 0 4基因第5、6外显子作为条件性敲除的目的片段，在pGEM5载体两侧重组插入LoxP片 段，剔除5、6号外显子后整合素04基因没有编码蛋白的起始位点，翻译不能完成。运 用LA-PCR技术，以FVB品系小鼠ES细胞（embryonic stem cell，胚胎干细胞）基因 组DNA为模板分步扩增包括整合素0 4的两端携带Lox位点第5、6外显子（引物序列： 5，-GCCTCTATGGACACCAGG-3,〈SEQIDN0.1〉和 5，-GACGCTGACTTTGTCCACAAACTTTCC-3' 〈SEQ ID NO. 2>);将扩增所得基因片段酶切后与pGEM5载体连接，获得小鼠整合素0 4条件 基因打靶载体。
[0014] 体外分离培养小鼠ES细胞。将小鼠整合素0 4条件基因打靶载体通过电穿孔法转 染小鼠 ES 细胞。用 PCR 扩增法（引物序列 5' -CTCACTGTATTAAGCGGAC-3'〈SEQ ID NO. 3> 和5' -AAGGGCTGCGGCTCAACCHy〈SEQ IDN0. 4>)，特异性探针杂交法及多酶切图谱法筛选 ES细胞中的杂合子，将ES杂合子（+/-)注入到宿主囊胚中。将10-20个胚胎注入到假孕 鼠子宫中，通过DNA印迹杂交及RNA印迹杂交筛选带有小鼠整合素0 4条件基因打靶载体 基因的子代小鼠。通过特异性探针杂交法，DNA印迹杂交，RNA印记杂交筛选鉴定杂交整合 素 |3 4floxed 小鼠。
[0015] 下面结合原理对本发明作进一步说明：
[0016] 基本的技术思路：Cre LoxP与基因打靶技术系统能克服传统基因打靶的局限性。 该系统包括Cre重组酶和loxP位点两部分。Cre重组酶是由Sternberg等于1981年从P1 噬菌体中发现的，是一种编码38KDa蛋白质产物的位点特异性重组酶，它能够识别34bp 的LoxP序列并介导2个LoxP位点之间的高精确的特异重组，不需要其他因素辅助Cre重 组酶可识别LoxP位点，切除或置换两个LoxP位点间的DNA片段。利用Cre重组酶介导的 LoxP位点特异性重组技术，对基因修饰的时空范围上设置一个可调控的"按钮"，从而对基 因修饰的范围和时间处于实现可控状态。通过给Cre重组酶基因选择适当的组织特异性 启动子，控制Cre重组酶基因在特定组织细胞中表达，可以实现Cre酶-loxP基因打靶系 统的组织特异性。由CCSP启动子在气道上皮细胞激活的一种新型Cre系统。在多西环素 诱导后，成功实现在气道上皮所有细胞中敲除integrine 4,该小鼠模型为进一步确切研宄 integrin |3 4基因在气道上皮中功能提供了理想工具，它将进一步阐明integrin |3 4在哮 喘发生发展中的作用和机制，为研宄表观遗传学提供了新的线索，为研宄哮喘靶向治疗提 供了新的工具。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018] 第一，首次在动物整体水平实现整合素0 4的表达剔除。这对推进相关领域的研 宄，具有非常重要的实用价值。
[0019] 第二，该方法的实验小鼠存活率高。本专利并非直接针对实验小鼠进行基因敲除， 而是通过多代杂交，最终杂交出的小鼠具有理想的特性。这时，小鼠在实验环境中可以得到 很好的存活。
[0020] 第三，该方法对整合素e 4的表达剔除是可诱导可逆转的，可控性好。通过多西四 环素诱导后，可实现表达剔除；一旦停止诱导，数日后，整合素0 4的表达又可以恢复。这种 灵活性，使得我们在动物整体发育的各个阶段，均可观察整合素0 4与气道上皮功能稳态、 哮喘易感性等之间的关系。
[0021] 总之，本发明在整体动物水平干扰整合素|3 4 (integrin beta 4, ITGB4)在气道上 皮的表达，得到调控性好的哮喘或气道高反应动物模型。其主要功能是实现在气道上皮细 胞中敲除整合素0 4,该小鼠模型为进一步确切研宄整合素0 4基因在气道上皮中功能提 供了理想工具，为研宄哮喘靶向治疗提供了新的动物模型。
[0022] 说明书附图
[0023] 图1A :原代分离气道上皮细胞，RT-PCR检测整合素4m