专利名称：靶向黑色素瘤的可复制性腺病毒穿梭载体及腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种靶向黑色素瘤的可复制性腺病毒载体，还涉及该载体的构建方法及其用途。
背景技术：
用病毒治疗肿瘤的想法由来已久。一百多年前，医学家们就注意到有的肿瘤病人在感染某种病毒后会出现肿瘤暂时性消退的现象，并开始寻找能杀灭肿瘤细胞的病毒。至1970年，人们已发现了38种在动物或人体体内具有抗肿瘤活性的病毒，并开始在晚期肿瘤病人中进行临床试验。
近三十年来，由于病毒学，分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们已完成了多种病毒全部基因测序工作，并对基因的结构及功能进行了较为详细的研究，并能有效地对病毒基因进行结构改造，使改造后的病毒能在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不增殖，用这种病毒感染肿瘤细胞即可在细胞内复制增殖并裂解肿瘤细胞，细胞裂解后释放的病毒颗粒可再次感染其它肿瘤细胞，直到将全部肿瘤细胞杀灭。由于该病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞损害不大，这种病毒被称为肿瘤特异性增殖病毒。与此同时，对各种病毒的纯化及浓集方案也日趋成熟，从而能够大量制备高纯度，高效价的病毒用于肿瘤治疗。目前，已有多种增殖病毒进入临床试验，其中腺病毒介导的癌细胞裂解策略最为有效，法德罗胡里博士在30名患有头颈部癌的病人身上试用了选择性攻击P53缺陷的肿瘤细胞的腺病毒突变体ONYX-015并联合常规化疗，使25名患者的肿瘤缩小，其中8名患者的肿瘤完全消失。
(A controlled trial of intratumoral ONYX-015，a selectively-replicatingadenovirus，in combination with cisplatin and 5-fluorouracil in patients withrecurrent head and neck cancer. Nature Medicine 2000.6(8)879)这是首次在数量较多病人参与的二期临床试验中取得大量的肿瘤消失且不复发的结果。
肿瘤系多基因协同和多阶段发病，发生机制复杂，仅以细胞因子或抑癌基因等针对单一发病因素的基因治疗方案很难奏效，而一些直接杀灭癌细胞的方法则效果显著，如自杀基因疗法等。选择复制性腺病毒也一样，其在扩增的同时也将癌细胞裂解杀灭，并能主动地寻找靶细胞。但腺病毒突变体ONYX-015仍然有其局限性，即它主要针对的是P53缺陷的肿瘤细胞，而在所有的肿瘤类型中，P53功能缺陷的肿瘤只占50％左右，它对另外的50％则无能为力，因此有必要发展其它类型的选择复制性腺病毒。
目前，获得重组腺病毒的方法有两类，一是将带有外源基因的腺病毒表达载体通过酶切，将其直接连接到腺病毒DNA上。首先将外源基因的表达盒(包括启动子，外源基因序列及加尾信号)插入到腺病毒左端基因组(0-1.3mu)的下方，这一区域包括了病毒左端ITR，组装信号，E1A的增强子，然后将目的基因表达序列及腺病毒序列切下，连入腺病毒2.6-100mu序列，转染293细胞，在其中包装获得有感染性的重组病毒。另一组方法为细胞内的同源重组法，即将腺病毒的穿梭载体和复制缺陷型病毒DNA共同转入293细胞中，通过同源重组(要同源序列至少不少于1Kb)然后在293细胞中包装，获得重组腺病毒。
外源基因插入区的载体，即腺病毒穿梭载体，一般都设计成高效蛋白表达载体，插入基因通常同一个强启动子相连，以促使转录。常规构建方法，是在E1区插入一个表达盒，由高效启动子，外源基因，以及mRNA3’端的poly(A)加尾信号构成。表达盒的方向对于表达可能不太重要，但右向的启动子能产生异常的mRNA。
人们为了特异性地杀伤肿瘤细胞，根据肿瘤细胞的生物学特性，细胞表面的受体分子的分布以及胞内基因表达的特殊性，设计了一些靶向的方法，主要有两种。一是胞外靶向，主要是针对肿瘤细胞表面一些特异的受体或抗原而设计的能与之特异结合的配体或抗体，用以引导各种治疗单元到达靶部位；一是胞内靶向，主要是利用肿瘤特异性调控元件(启动子或增强子)以驱动治疗基因表达于特定的靶细胞，此法已用于多种实体瘤的实验研究，并取得了预期的效果。但各种组织特异性启动子一般是将基因组DNA中基因编码区的上游调控序列经组织特异表达的功能鉴定后，直接将其用于指导基因表达的靶向性。这种天然的基因表达调控序列并不是专为基因治疗而设置，它们的启动子活性普遍较低，因此还不能适应肿瘤基因治疗提出的高度特异性，高表达的要求，故需加以改进。最近，Siders等(Transcriptional targetingof recombinant adenoviruses to human and murine melanoma cells.Cancer Res.565638)用PCR克隆的方法分别获得了人和小鼠的酪氨酸酶启动子和增强子的DNA片段，然后将各片段进行人工重组，并从中筛选出对黑色素瘤特异性强，表达水平高的重组调控序列，其转录活性已与目前最强的CMV启动子不相上下，且其组合方式均为两个串联的增强子加上一个启动子。在黑色素瘤特异的调控序列引导下，可确保构建的工程腺病毒选择性地感染人的黑色素瘤细胞，达到特异性杀灭癌细胞的目的。Park等利用此重组调控序列指导自杀基因PNP的表达，达到了靶向杀灭黑色素瘤细胞的目的(Augmentation ofMelanoma-Specific Expression Using a Tandem Melanocyte-Specific EnhancerResults in Increased Cytotoxicity of the Purine Nucleoside Phosphorylase Gene inMelanoma.Hum Gene Ther.1999，10889)。但是，Siders等构建的腺病毒载体是不可复制的。
发明内容
为了提供一种完整的具有黑色素瘤靶向性的可复制性腺病毒载体和腺病毒，本发明的发明人在现有技术的基础上作了以下改进一是加上针对黑色素细胞的调控元件，以人黑色素瘤为靶标，具有特异靶向性；二是构建可复制性腺病毒载体，利用病毒在瘤细胞内自我复制直接裂解杀伤瘤细胞，具有基因转染的高效率，以达到更有效地治疗恶性肿瘤之目的。
本发明在构建腺病毒的表达载体时，选用左向表达的腺病毒穿梭载体pACSR(-)，以避免产生异常的mRNA。由于腺病毒基因组大，酶切位点复杂，进行直接重组较困难，故选用了同源重组的方法。
本发明的腺病毒载体和腺病毒可通过以下技术方案获得。
首先设计两条引物，从重组质粒pAd5XhoIC中扩增腺病毒增殖必需的腺病毒复制启动基因E1区，然后将其克隆到T载体，酶切鉴定并确定其插入方向，然后将E1区基因亚克隆至腺病毒穿梭载体pACSR(-)，构建重组载体pAC-AdE1。设计引物分别以小鼠黑色素瘤B16细胞基因组DNA和含鼠酪氨酸酶核心增强子质粒phsTyr(0.9)PCAT为模板，扩增鼠酪氨酸酶的启动子和增强子基因，将启动子和增强子分别克隆至T载体，酶切鉴定并进行序列测定。另设计两对增强子引物，分别插入酶切位点，以便产物连接，以质粒pGEM-enh为模板，用新设计的两对引物分别进行PCR扩增，得到两个带有特定酶切位点的增强子片段，然后将两片段体外连接构建增强子二聚体dihtenh，将其克隆至T载体，进行PCR及酶切鉴定并进行测序，然后将其与启动子连接，构建靶向人黑色素瘤的调控序列dihtenh-prom。将AdE1基因区亚克隆至调控序列的下游，连接成dihtenh-prom-AdE1，酶切鉴定并通过PCR插入酶切位点，以便后续的克隆。然后以其整个片段置换出pAC-AdE1中的CMV-AdE1片段，构建目标腺病毒穿梭载体pAdhepE1。将其与腺病毒重组质粒pJM17共转染293细胞，经同源重组，PCR鉴定，获得靶向人黑色素瘤的选择复制性腺病毒AdhepE1，经过PCR鉴定正确。
图1(a)是显示腺病毒复制启动基因区的PCR扩增图。其中1为AdE1 PCR产物(约3000bp)，2为Lamda/HindIII DNA Marker
图1(b)是显示AdE1基因克隆至T载体构建转化重组子pGEM-AdE1的酶切鉴定的图，图中1为Lamda/HindIII DNAMarker，2为pGEM-AdE1/BamHI+SpeI，3为pGEM-AdE1/BamHI+ApaI图1(c)是显示pGEM-AdE1质粒示意图。
图1(d)是显示AdE1区基因亚克隆至腺病毒穿梭载体，构建重组载体pAC-AdE1示意1(e)是显示重组质粒pAC-AdE1的酶切鉴定的图。图中5为Lamda/HindIII DNA Marker，1，2，3，4，6，7，8，9 1-8#克隆质粒/KpnI图2(a)是显示鼠酪氨酸酶启动子增强子的PCR扩增的图。图中1为鼠酪氨酸酶增强子PCR产物，2为鼠酪氨酸酶启动子PCR产物，3为φX174/HincIIDNA Marker。
图2(b)是显示鼠酪氨酸酶启动子的酶切鉴定的图。其中左图1，2，3，4为1，2，3，4克隆BamHI酶切结果，5为Lamda/HindIII DNA Marker，6，7，8，9为1，2，3，4克隆的EcoRI结果。右图1，2，3，4为1，2，3，4克隆的HindIII酶切结果，5为Lamda/HindIII DNA Marker，6，7，8，9为1，2，3，4克隆的XbaI酶切结果。
图2(c)是显示鼠酪氨酸酶启动子的双酶切鉴定的图。图中1为Lamda/HindIII DNA Marker，2为pGEM-prom/EcoRV，3，4，5为1，2，3，4克隆的BamHI+EcoRI酶切结果，6为鼠酪氨酸酶启动子PCR产物。
图2(d)是显示鼠酪氨酸酶增强子的PCR鉴定图。图中1为φX174/HincIIDNA Marker，2，3，4为1，2，3克隆PCR产物。
图3(a)是显示鼠酪氨酸酶增强子的PCR再扩增图。图中1为φX174/HaeIII DNA Marker，2为enhA PCR产物，3为enhB PCR产物，4为enhPCR产物。
图3(b)是显示鼠酪氨酸酶增强子的体外连接图。图中1为enh PCR产物(207bp)，2为enhA，B体外连接产物，3为Neo PCR产物(433bp)。
图3(c)是显示鼠酪氨酸酶增强子二聚体的PCR鉴定图。
图3(d)是显示鼠酪氨酸酶增强子二聚体的PCR结构鉴定图。图中1为enh PCR产物(207bp)，2，3为A4，A8克隆的PCR产物，4为enh+Neo PCR产物。
图3(e)是显示鼠酪氨酸酶增强子二聚体的酶切鉴定图。其中1为enh PCR产物(207bp)，2，3为A4，A8克隆的HindIII酶切结果，4，5为A4，A8克隆的EcoRI酶切结果，6为φX174/HaeIII DNA Marker。
图3(f)是显示靶向人黑色素瘤的转录调控序列dihtenh-prom构建示意图。
图3(g)是显示dihtenh-prom的PCR鉴定图。图中1为dihtenh-prom PCR产物，2为Lamda/EcoT14I DNA Marker图4(a)是显示dihtenh-prom-AdE1构建示意图。
图4(b)是显示dihtenh-prom-AdE1的酶切鉴定图。图中1为pGEM-dhepE1的Sal I酶切结果，2为pGEM-dhepE1的HindIII酶切结果，3为Lamda/EcoT14I DNA Marker。
图4(c)是显示SpeI-T7-dhepE1-SP6的PCR扩增图。图中1为SpeI-T7-dhepE1-SP6LA PCR产物，2为Lamda/HindIII DNA Marker。
图4(d)是显示pAdhepE1构建示意图。
图4(e)是显示pAdhepE1的酶切鉴定图。图中1，2为正，反向插入克隆单酶切，3为反向插入克隆/BamHI+XhoI，4为正向插入克隆/BamHI+XhoI，5为Lamda/EcoT14I DNA Marker。
图5(a)是显示AdhepE1对肿瘤细胞形态的影响图。
图5(b)是显示AdhepE1对人黑色素瘤的特异杀伤统计图。图中1为SK-Mel-1组(左未感染，右感染)，2为HepG2组(左未感染，右感染)。
图5(c)是显示RT-PCR检测基因的特异表达的图。图中1为HepG2细胞β-actin RT-PCR，2为SK-Mel-1细胞β-actin RT-PCR，3为φX174/HaeIII DNAMarker，4为HepG2细胞E1A RT-PCR，5为SK-Mel-1细胞E1ART-PCR。
具体实施例方式
下面结合说明书附图，用实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一、腺病毒复制启动基因区AdE1的克隆及腺病毒穿检载体pAC-AdE1的构建一.材料1.菌株及质粒JM109宿主菌，本室保存；pAd5XhoIC，含Ad5E1区80～5788bp，荷兰莱登大学，Van der Eb教授惠赠；pACSR(-)重组腺病毒穿梭载体，美国西海岸生物技术公司杨启成博士惠赠；pIRES1.neo真核共表达载体，为clontech公司产品；pAC-GFP质粒，本室构建；pGFP-IRES1.neo，本室构建。
2.病毒及细胞株Ad-LacZ表达β-半乳糖苷酶的复制缺陷型腺病毒，本所一室陈谦博士惠赠；95-D(PLA-801D)人巨细胞肺癌细胞株，本室保存；Hela，人宫颈癌细胞，本室保存；Hela-GFP，稳定表达绿色荧光蛋白的人宫颈癌细胞，本室保存。
二.方法结果1.从Genbank中查出腺病毒基因组E1区的全序列，可见腺病毒基因组E1区是由E1A和E1B两个基因组成。
2.设计腺病毒复制启动基因区的PCR引物在上游引物的5’端，加入BamHI酶切位点，便于以后的亚克隆。
上游引物下游引物5’TCAATCTGTATCTTCATCGC 3’3.腺病毒复制启动基因区的PCR扩增以含Ad5E1区80～5788bp质粒pAd5XhoIC为模板，用Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得到约3000bp的一条扩增带，如图1(a)所示。
4.将腺病毒复制启动基因区的PCR产物克隆至T载体将E1区PCR产物直接与pGEM-T载体连接，转化JM109宿主菌，铺于含X-gal，IPTG，Amp的琼脂平皿中，结果长出许多蓝色和白色菌落，如图1(b)所示。
5.酶切鉴定并确定其插入方向挑蓝色，白色克隆各一个，均扩增2ml，小提质粒，酶切电泳鉴定，结果蓝色克隆质粒大小约为3000bp，为空载体，白色克隆质粒大小约为6000bp，初步确认插入了AdE1片段，然后再用BamHI+SpeI，BamHI+ApaI进行双酶切，结果如图1(c)所示。
因BamHI为E1区头部插入位点，SpeI和ApaI分别为T载体插入片段两端酶切位点，因此可以判定其插入的方向，如图1(d)所示。
6.将E1区基因亚克隆至腺病毒穿梭载体构建图谱如图1(e)。
酶切鉴定，选用KpnI内切酶，因穿梭载体本身含单一KpnI位点，E1片段也有一个KpnI位点，所以一个内切酶即可判断重组体，如图1(f)所示再用SpeI内切酶，因穿梭载体本身在CMV启动子上游有单一SpeI位点，E1片段也在尾部从T载体中带入一个SpeI位点，所以一个内切酶即可判断重组体中插入片段的方向，结果表明插入方向正确，重组载体pAC-AdE1构建成功。
实施例二、鼠酪氨酸酶启动子、增强子基因的克隆一.材料phsTyr(0.9)PCAT，含鼠酪氨酸酶核心增强子，德国海德堡癌症研究中心Günther Schütz教授惠赠；B16细胞，小鼠黑色素瘤，本室保存；其余材料同二.方法结果1.从Genbank中查出鼠酪氨酸酶启动子、增强子的全序列。
2.设计出鼠酪氨酸酶启动子、增强子的PCR引物。
鼠酪氨酸酶启动子引物上游引物 下游引物 在其上游引物中插入EcoRI位点，便于随后插入增强子序列，下游引物中插入BamHI位点，以利于和E1区的头部相连。
鼠酪氨酸酶增强子引物上游引物 5’CAAGGTCATAGTTCCTGCC 3’下游引物 5’TATTGTGGTTTGCCAGGACC 3’3.鼠酪氨酸酶启动子、增强子的PCR扩增以小鼠黑色素瘤B16细胞基因组DNA为模板，用所设计的引物进行PCR扩增，电泳观察，如图2(a)所示。可见约780bp和207bp的扩增条带，且为主要产物，与预期的结果一致。
4.将小鼠酪氨酸酶启动子、增强子的PCR产物克隆至T载体从琼脂糖凝胶中切下所需片段，玻璃奶回收纯化，与T载体相连，转化JM109宿主菌，铺于含X-gal，IPTG，Amp的琼脂平皿中，结果长出许多蓝色和白色菌落。
5.酶切鉴定鼠酪氨酸酶启动子挑白色克隆数个，均扩增2ml，小提质粒，用BamHI、EcoRI、HindIII和XbaI酶切电泳鉴定启动子，结果如图2(b)所示。4个克隆中有3个为阳性，然后再用BamHI+EcoRI进行双酶切，做进一步分析，结果如图2-3所示以上结果表明，所克隆的鼠酪氨酸酶启动子的酶切位点及大小正确，可送公司测序，以作最后鉴定。
6.PCR鉴定鼠酪氨酸酶增强子以德国海德堡癌症研究中心Günther Schütz教授惠赠的含鼠酪氨酸酶核心增强子质粒phsTyr(0.9)PCAT为模板，进行PCR扩增，直接与T载体连接，转化，挑克隆，再用PCR鉴定，结果如图2(d)所示。可见三个克隆大小均一，应为所需的增强子片段。
7.测序鉴定将初步鉴定的启动子和增强子克隆送上海生工生物技术公司测序，结果增强子全序列和启动子已测部分与文献报道一致(Lowings，P.，Yavuzer，U.，and Gading，C.R.Positive and negative elements gegulate a melanocyte-specificpromoter.Mol.Cell.Biol.1992，12(8)3653-3662；Nylarder，K.Bourdon，J.C.Bray，J.E.，et al.Transcriptional activator of tyrosinase and TRP-1 by p53 linksUV irradiation to the protective tanning response.J.Pathol.2000，190(1)，39-46)，将二质粒命名为pGEM-mTyr-prom，pGEM-mTYr-enh，简写为pGEM-prom，pGEM-enh。
实施例三、构建靶向人黑色素瘤的转录调控序列一.材料pGEM-mTyr-prom，本室构建；pGEM-mTyr-enh，本室构建；pGEM-Teasy(Promega公司)；限制性内切酶EcoRI、HindIII等(宝生物公司)；T4 DNA连接酶(华美公司、Promega公司)；Taq DNA聚合酶(上海生工生物工程公司)；Pfu高保真DNA聚合酶(赛百盛公司)；ΦX174/HaeIII(宝生物公司)；λ/EcoT14I DNA marker(宝生物公司)；傻瓜-PCR试剂盒(赛百盛公司)MILLIPORE Ultrafree-DA回收管(MILLIPORE公司)；其余同实施例一。
二.方法结果1.设计两对鼠酪氨酸酶增强子的PCR引物根据pGEM-enh的测序结果，再设计两对引物enhA和enhB。在增强子序列中，以转录因子结合的一端为头，另一端则为尾，在enhA的上游引物中，保留了pGEM-enh中增强子头部的SpeI位点，再加上一个SphI位点，以便于随后将头尾相接的增强子二聚体克隆至pGEM-prom中启动子的上游；在enhA的下游引物中，则插入了HindIII位点。在enhB的上游引物中，插入一个HindIII位点，以便与enhA的下游相连接；在enhB的下游引物中，则插入了EcoRI位点，以便与启动子的上游相连。二引物序列如下enhA上游引物 SphISpeI下游引物 HindIIIenhB上游引物 HindIII下游引物 EcoRI另外根据pGEM-T载体多克隆位点两侧的T7，SP6启动子序列，设计一对引物，以便扩增其内部克隆片段，序列如下上游引物 5′GACTCACTATAGGGCGAA 3’下游引物 5′GGTGACACTATAGAATAC 3’2.鼠酪氨酸酶增强子的PCR再扩增以质粒pGEM-enh为模板，用新设计的两对引物enhA，enhB分别进行PCR扩增，得到两个带有特定酶切位点的增强子片段，如图3(a)所示。
3.体外连接将enhA，enhB PCR产物乙醇沉淀回收，均用HindIII限制性内切酶进行酶切，再纯化回收，进行体外连接，用Modified TAE电泳缓冲液电泳，结果如图3(b)所示。
4.将小鼠酪氨酸酶增强子二聚体克隆至pGEM-T easy载体将400多bp的增强子二聚体连接产物从琼脂糖凝胶中切下，MilliporeUltrafree-DA管回收，Taq DNA聚合酶添加A尾，再与pGEM-T-easy载体连接，转化JM109宿主菌，铺于含X-gal，IPTG，Amp的琼脂平皿中，结果长出38个菌落，大多数为白色。
5.PCR鉴定挑白色克隆32个，各扩增2ml，分为A、B、C、D四组，热裂解制PCR模板，选用pGEM-T-easy载体多克隆位点两侧的T7，SP6引物，用傻瓜-PCR试剂盒快速鉴定，其中一组的结果如图3(c)所示。
其中A4，A8，B1，B3，D3克隆的大小符合要求，因此选择A4，A8做进一步结构分析，选用enh的一对引物，进行傻瓜-PCR扩增，结果如图3(d)所示。因扩出了头尾串联二聚体特有的两条带，A4，A8确实为增强子头尾相接的二聚体。
6.酶切鉴定为了确认所插入的酶切位点，以及便于后续克隆的需要，选用A4，A8克隆，扩增，小提质粒，用HindIII和EcoRI进行酶切，结果如图3(e)所示。说明二聚体中确实插入了HindIII位点，二聚体两端各有一个EcoRI位点。
7.测序鉴定在PCR和酶切鉴定的基础上，将含重组质粒pGEM-T-easy-dihtenh的宿主菌送六合通公司测序，测序结果与文献报道一致(Lowings，P.，Yavuzer，U.，andGading，C.R.Positive and negative elements gegulate a melanocyte-specificpromoter.Mol.Cell.Biol.1992，12(8)3653-3662；Nylarder，K.Bourdon，J.C.Bray，J.E.，et al.Transcriptional activator of tyrosinase and TRP-1 by p53 linksUV irradiation to the protective tanning response.J.Pathol.2000，190(1)，39-46)。
8.构建靶向人黑色素瘤的转录调控序列dihtenh-prom以质粒pGEM-T-easy-dihtenh为模板，T7，SP6为引物，用Pfu高保真DNA聚合酶，PCR扩出T7-dihtenh-SP6片段，乙醇沉淀回收，EcoRI酶切后，与经EcoRI酶切，CIAP去磷酸的线性化载体pGEM-prom相连，构建靶向人黑色素瘤的转录调控序列dihtenh-prom，如图3(f)所示。
连接产物转化JM109感受态宿主菌，结果长出6个菌落，挑选克隆，扩增，热裂解制PCR模板，以T7和启动子下游引物配对，用傻瓜-PCR试剂盒快速鉴定，结果有5个克隆为阳性，其PCR产物大小约1200bp，如图3(g)所示。
实施例四、腺病毒穿梭载体pAdhepE1的构建一.材料1.菌株及质粒pGEM-dihtenh-prom，本室构建；pAC-AdE1，本室构建；pJM17，腺病毒重组质粒，美国西海岸生物技术公司杨启成博士惠赠；2.细胞293细胞，本院二所吴祖泽院士惠赠；SK-Mel-1细胞，人黑色素瘤细胞，购自协和医科大学基础医学院细胞库。
3.试剂与试剂盒多聚-L-赖氨酸(Sigma公司)；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(Invitragen公司)；LAPCR试剂盒(宝生物公司)；PureFection转染级质粒纯化试剂盒(Promega公司)二.方法结果将AdE1基因区亚克隆至dihtenh-prom下游，连接成dihtenh-prom-AdE1，构建策略如图4(a)。酶切鉴定正确，如图4(b)所示。
因dihtenh，prom，AdE1片段中各有一个HindIII位点，因此单用HindIII即可切出三条带，与预期一致。得到重组质粒pGEM-dihtenh-prom-AdE1，简称为pGEM-dhepE1。
再设计一条引物，与SP6引物配对，扩出整个dihtenh-prom-AdE1片段，并插入SpeI位点，便于后续克隆。
上游引物 SpeIT7经LAPCR得到片段SpeI-T7-dhepE1-SP6，结果如图4(c)所示再以其整个置换出pAC-AdE1中的CMV-AdE1片段，构建成目标腺病毒穿梭载体pAdhepE1。构建策略如图4(d)。酶切鉴定正确，如图4(e)所示。
实施例五、靶向人黑色素瘤重组腺病毒的制备将腺病毒穿梭载体pAdhepE1与pJM17共转染293细胞，经同源重组，PCR鉴定，获得靶向人黑色素瘤的选择复制性腺病毒AdhepE1。
一、材料pJM17，腺病毒重组质粒，美国西海岸生物技术公司杨启成博士惠赠；293细胞，本院二所吴祖泽院士惠赠；SK-Mel-1细胞，人黑色素瘤细胞，购自协和医科大学基础医学院细胞库；多聚-L-赖氨酸(Sigma公司)；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(Invitragen公司)；PureFection转染级质粒纯化试剂盒(Promega公司)。其它材料同前面实施例。
二、方法结果1.细胞培养293细胞在含10％胎牛血清、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的高糖DMEM培养液(pH 7.2)中，于37℃、5％CO2条件下培养。细胞为贴壁生长，2～3天长满后用0.25％胰蛋白酶消化传代。
SK-Mel-1细胞在含10％胎牛血清、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素的MEM培养液(pH 7.2)中，于37℃、5％CO2条件下培养。细胞为悬浮生长，3～5天长满后分瓶传代。
2.多聚赖氨酸包被6孔板用三蒸水配制0.1mg/ml的多聚赖氨酸母液(-20℃冻存)；每孔加0.5ml，室温放置过夜；吸去液体，用三蒸水洗一次，超净台中吹干，随后用于293细胞铺板。
3.Lipofectamine2000介导共转染293细胞。
将质粒pAdhepE1和pJM17大量扩增，用PureFection试剂盒纯化质粒，用Lipofectamine2000介导共转染293细胞，以pAC-GFP与pJM17共转染指示转染效率，操作按照试剂盒说明进行。通过绿色荧光蛋白在293细胞中的表达观察，可以见到转染效率较高，约30～50％左右。
4.快速CPE法测病毒滴度将293细胞接种于6孔培养板，2×105细胞/孔，培养24小时后，细胞长至90％汇合状态，将各孔中的培养液吸出，分别加入102～106倍比稀释的病毒液，吸附1～2小时，将病毒液从各孔中吸出，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，培养48小时后观察CPE，选出发生100％CPE的稀释倍数，用下列公式计算病毒滴度 5.转染后第7天，可见细胞出现病变，之后病变区域逐渐扩大，直至完全病变。将细胞回收，冻融三次，释放病毒，再接种于SK-Mel-1细胞中，2天后细胞出现完全病变，将细胞回收，冻融三次，释放病毒，离心取上清，提取重组腺病毒基因组DNA作为模板，以鼠酪氨酸酶启动子引物进行PCR鉴定。鼠酪氨酸酶启动子片段为鼠所特有，与人和腺病毒基因组DNA没有任何同源性，因此可以断定所获得的重组腺病毒为AdhepE1。快速CPE法测定重组腺病毒AdhepE1滴度约为2×106pfu/ml。
实施例六、靶向黑色素瘤可复制性腺病毒对肿瘤的特异杀伤作用同源重组出基因工程腺病毒AdhepE1后，即可进行体外检测，看其是否能对人黑色素瘤进行特异杀伤。
一.材料AdhepE1，本室构建的靶向人黑色素瘤的基因工程腺病毒；HepG2，人肝细胞癌，本室保存；其余材料同前面实施例二.方法结果1.PCR引物
β-Actin引物上游引物 5’GTGGG GCGCC CCAGG CACCA 3’下游引物 5’CTTCC TTAAT GTCAC GCACG ATTTC 3’E1A引物上游引物 下游引物 5’TTATG GCCTG GGGCG TTTAC 3’2.AdhepE1对人黑色素瘤的特异杀伤将5×104人黑色素瘤细胞系SK-Mel-1和人肝细胞癌细胞系HepG2铺于六孔板，以1×104pfu低剂量AdhepE1分别攻击，结果，6天后SK-Mel-1细胞大部死亡，而HepG2细胞则未受影响，生长正常，结果见图5(a)。经活细胞计数，统计分析表明，二者存在显著差别，见图5(b)。
3.RT-PCR检测E1A的差异表达以1×106pfu AdhepE1分别感染SK-Mel-1和HepG2，3小时后，收集细胞，提取细胞总RNA。用RT-PCR检测E1A的表达，结果AdhepE1在SK-Mel-1中表达了E1A，而在HepG2中没有表达，见图5(c)。提示AdhepE1对人黑色素瘤的特异杀伤是由于该病毒在人黑色素瘤细胞中选择性复制引起的。
权利要求
1.一种靶向人黑色素瘤的可复制性腺病毒穿梭载体pAdhepE1，其特征在于它包含腺病毒AdE1基因和靶向黑色素瘤的转录调控序列，AdE1基因序列位于靶向黑色素瘤转录调控序列的下游。
2.按照权利要求1的可复制性腺病毒穿梭载体pAdhepE1，其特征在于所说的靶向黑色素瘤的转录调控序列包含两个鼠酪氨酸酶基因的增强子和启动子的基因序列，并且两个鼠酪氨酸酶增强子首尾连接成二聚体，下游连接鼠酪氨酸酶启动子基因。
3.按照权利要求1的可复制性腺病毒穿梭载体pAdhepE1，其特征在于所说的靶向黑色素瘤的转录调控序列如图3(F)所示，该转录调控序列的PCR产物大小约1200bp。
4.权利要求1所述靶向人黑色素瘤的可复制性腺病毒穿梭载体pAdhepE1的构建方法，包括以下步骤(a)腺病毒复制启动基因区AdE1的克隆及腺病毒穿梭载体pAC-AdE1的构建；(b)鼠酪氨酸酶启动子、增强子基因的克隆；(c)靶向人黑色素瘤的转录调控序列的构建；(d)腺病毒穿梭载体pAdhepE1的构建。
5.可复制性重组腺病毒AdhepE1，其特征在于它含有权利要求1、2或3所述的可复制性腺病毒穿梭载体。
6.可复制性重组腺病毒AdhepE1，保藏号为CGMCC No.0794。
7.权利要求5或6的腺病毒在医药领域中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种可复制性的腺病毒穿梭载体及含有该载体的腺病毒。该靶向人黑色素瘤的可复制性腺病毒可以选择性地感染人的黑色素瘤细胞，在细胞内自主复制，达到特异性杀灭癌细胞的目的，在肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景。
文档编号A61K39/235GK1480534SQ0212936
公开日2004年3月10日 申请日期2002年9月6日 优先权日2002年9月6日
发明者陆应麟, 谢庆军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 中国人民解放军军事医学科学院基础医