一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 腺病毒（Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度约35-40kb。已知人腺病 毒分为7个亚群（A~G)，包括60多个血清型，其中B亚群中的3、4、7、14型腺病毒感染后 可引起急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年来，出现了由11、14型腺病毒重组产生的55 型腺病毒（以下简称Ad55)，已导致一系列社区获得性肺炎疫情甚至死亡病例。但是，尚无 抗Ad55感染的特效药物及疫苗，临床上只能采取支持性治疗。因此，研发抗Ad55的疫苗及 药物，对于控制Ad55在广大人群尤其是入伍新兵、青少年学生等人群中的传播至关重要。
[0003]目前，抗腺病毒感染的疫苗仅在美国军队获得使用。该疫苗为野生型Ad4、Ad7在 人胚肾二倍体成纤维细胞上传代，经冷冻脱水、混和纤维素乳糖等制成的肠溶型胶囊，为口 服活病毒疫苗。该疫苗的使用有效遏制了美军腺病毒感染疫情的爆发。但是，美军使用的 腺病毒疫苗尚存在极大的缺陷，一方面，该疫苗主要预防Ad4、Ad7的感染，而对致病力极强 的Adl4、Ad55等无确切的预防效果；另一方面，该疫苗主要成分为野生型腺病毒，安全性较 差，残余活病毒从肠道排出后极易污染水源，造成病毒的扩散，因而不能应用于普通人群。 因此，研制安全性高并能预防Ad55等强毒株的复制缺陷型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。
[0004] 已有研宄显示，腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因则可以对抗宿主 的免疫系统。敲除El、E3基因后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，具有减毒表型，而其 主要的表面抗原如Hexon、Fibre等则不受影响。因此，采用复制缺陷的腺病毒作为疫苗可 有效提升其安全性，扩大其使用范围。复制缺陷型腺病毒可在互补细胞株，如表达Ad5El基 因的293细胞、PerC6细胞中生产。但是，很多腺病毒尤其是B亚群腺病毒，敲除El、E3基 因后在这些生产细胞株中难以获得有效产量，主要原因是Ad5ElB 55K不能与B亚型腺病毒 E40rf6相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA的出核并提升病毒晚期蛋白的表达。
[0005] 复制缺陷型Ad55还可作为基因载体在基因治疗、疫苗等领域获得广泛应用。腺病 毒载体在这些领域具有一系列优势，如良好的安全性、基因转导的有效性以及方便的大规 模生产能力等。基于这些优势，全球范围内已有数百项临床试验以腺病毒作为基因载体，居 各类载体之首（24.8%)。这些研宄大部分采用Ad5或Ad2作为载体。然而，多数人体内 由于既往腺病毒感染而产生的抗腺病毒免疫反应限制了传统腺病毒载体的应用。研宄表 明非洲、南美及我国等发展中国家和地区的人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率很高，甚至超 过90%。这些中和抗体会抑制腺病毒载体进入机体细胞，使其难以行使免疫或治疗功能。 为克服预存抗腺病毒免疫反应，研宄者已开发一系列技术如：1)采用免疫抑制剂如环孢霉 素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应；2)修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开 预存中和抗体；3)我们此前开发的以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术；等 等。但是这些策略或者具有相当高的毒副作用（如免疫抑制剂），或者仅能使用一次即因产 生针对新载体的免疫反应而不能继续重复使用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述问题，提供一种复制缺 陷型人55型腺病毒载体。
[0007] 本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以解决：
[0008] -种复制缺陷型人55型腺病毒载体，由如下方法制备得到：通过敲除Ad55的E1、 E3基因，再将Ad55基因组中的E4基因开放阅读框6或开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5 基因组的相应阅读框。
[0009] 优选地，所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体，还在Ad55的E1基因区域整合外 源基因表达框。
[0010] 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法，包含如下步骤：
[0011] S1.PCR扩增Ad55El区同源重组臂并反向连接至卡那霉素抗性载体，线性化后与 经部分酶切线性化的pAd55 A E3同源重组，得到基因组质粒pAd55 A El A E3-Kana ;
[0012] S2.PCR扩增Ad55El区同源重组臂并同向连接至卡那霉素抗性载体，线性化后与 线性化的pAd55 A El A E3_Kana同源重组，得到基因组质粒pAd55 A El A E3;
[0013] S3. PCR 扩增 Ad5E40rf2-6、Ad55E4 基因，以 Ad5E40rf2-6 取代 Ad55E4 基因中相 应区域得到P55E4 (5E4)，线性化后与线性化的pAd55 A El A E3同源重组，得到基因组质粒 pAd55 AE1 AE3(5E4)；
[0014]S4. PCR扩增Ad5E40rf6，以其取代步骤S3.所述Ad55E4基因的相应区域得 到p55E4 (50rf6)，线性化后与线性化的pAd55 A El A E3同源重组，得到基因组质粒 pAd55 AE1 AE3(50rf6)。
[0015] 优选地，步骤S1.的具体方法为：
[0016] 以Ad55基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-delEl及R-delEl，酶 切后连接至pVax载体得到pVax-delEl (L+R)，线性化后，与经部分酶切线性化的pAd55 A E3 同源重组，经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E1、E3基因并引入唯一酶切位点 Pmel 的基因组质粒 pAd55 A El A E3_Kana〇
[0017] 最优选地，在其中一个实施例中，步骤SI.的具体方法为：
[0018] 以Ad55基因组为模板，PCR得到E1基因上下游重组臂L-delEl及R-delEl， L-delEl以Spel+EcoRI双酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delEl ;R-delEl 以EcoRI+Xbal双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delEl得到敲除El基因的穿梭质粒 pVax-delEl(L+R)；
[0019] pVax-delEl (L+R)以EcoRI线性化，pAd55 AE3以PacI部分酶切线性化，两者同源 重组并经双抗性筛选得到基因组质粒pAd55 A El A E3_Kana。
[0020] 优选地，步骤S2.的具体方法为：
[0021] 以Ad55基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-delK (E1)及 R-delK (E1)，酶切后连接至pVax载体得到pVax-delK (E1)，线性化后与线性化的 pAd55 AE1 AE3-Kana同源重组，得到去除El、E3、卡那霉素基因并引入唯一酶切位点Pmel 的基因组质粒pAd55 A El A E3。
[0022] 最优选地，在其中一个实施例中，步骤S2.的具体方法为：
[0023] 以Ad55基因组为模板，PCR得到E1基因上下游重组臂L-delK及R-delK，L-delK 以Spel+EcoRI双酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delK(El) ;R-delK以 EcoRI+Xbal双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delK(El)得到敲除卡那霉素抗性基因的 穿梭质粒 pVax-delK(El);
[0024] pVax-delK(El)以 Spel+Xbal 双酶切线性化，pAd55 AE1 AE3_Kana 以 Pmel 线性 化，两者同源重组得到去除卡那霉素抗性基因并在原El区引入唯一酶切位点Pmel的基因 组质粒 pAd55AEl AE3。
[0025] 优选地，步骤S3.的具体方法为：
[0026] 分别以Ad5、Ad55基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E40rf2-6以及Ad55E4,将 Ad55E4连接至T载体得到p55E4,进一步以p55E4为模板PCR去除Ad55E40rf2-6,然后与 Ad5E40rf2-6连接得到p55E4 (5E4)，线性化后与线性化的pAd55 A El A E3同源重组，得到 pAd55 AE1 AE3(5E4) 〇
[0027] 最优选地，在其中一个实施例中，步骤S3.的具体方法为：
[0028] 以Ad5、Ad55基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E40rf2-6、Ad55E4基因，分别连接至 T载体得到p50rf2-6、p55E4 ;以p55E4为模板，PCR去除Ad55的E40rf2-6并引入SapI位 点，两者经SapI酶切、连接得到p55E4(5E4);
[0029] p55E4(5E4)以 Pmel+Mlul 双酶切，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 酶切，重组得到已将 Ad55E40rf2-6 置换为 Ad5E40rf2-6 的基因组质粒 pAd55 A El A E3 (5E4)。
[0030] 优选地，步骤S4.的具体方法为：
[0031] 以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E40rf6,将p55E4经PCR去除Ad55E40rf6， 两者连接得到P55E4 (50rf6)，线性化后与线性化pAd55 A El A E3同源重组，得到 pAd55 AE1 AE3(50rf6)。
[0032] 最优选地，在其中一个实施例中，步骤S4.的具体方法为：
[0033]以 p50rf2-6、p55E4 为模板，PCR得到 Ad5E40rf6 并引入 SapI 位点，并在 p55E4 中 去除Ad55E40rf6,两者经SapI酶切连接得到p55E4(50rf6);
[0034] p55E4(50rf6)以 Pmel+Mlul 双酶切，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 双酶切，重组得到已 将 Ad55E40rf6 置换为 Ad5E40rf6 的基因组质粒 pAd55 A El A E3 (50rf6)。
[0035] 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法，还包含如下步骤：
[0036] S5.以Ad55基因组为模板PCR得到E1区同源重组臂SE1L、SE1R，酶切 并连接至pVax载体得到pSElLR ;以pGAl-EGFP为模板PCR得到外源基因表达框 CMV-EGFP-BGH，与pSElLR经酶切、连接得