臂L-delK及R-delK。
[0082] L-delK 引物序列：
[0083] L-delK F, ATAACTAGTGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO. 5)；
[0084]L-delK R, TTTGAATTCGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO. 6)〇
[0085] PCR 程序：95°C，30 秒；61°C，30 秒；72°C，20 秒；25 个循环。
[0086] R-delK 引物序列：
[0087] R-delK F, ATCGTTTAAACGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO. 7)；
[0088] R-delK R, ATCTCTAGAGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO. 8)〇
[0089]PCR 程序：95°C，30 秒；60°C，30 秒；72°C，80 秒；25 个循环。
[0090] L-delK以Spel+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体（Invitrogen)得到 pVax-L-delK ;R-delK以EcoRI+Xbal双酶切后连接至同样酶切的pVax-L_delE3得到敲除 Kana基因的穿梭质粒pVax_delK(L+R)。
[0091] 2. pAd55 AE1 AE3 质粒的构建。
[0092] pVax_delK(L+R)以 Spel+Xbal 线性化，pAd55 AE1 AE3_Kana 以 Pmel 线性化，乙 醇沉淀法回收后共转化BJ5183感受态细胞（Stratagene)，涂至氨节抗性平板，手工提取质 粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞（北京斯百汇生物科技有限公司），手工提取质粒并 进行酶切鉴定。得到去除Kana抗性基因并在E1区引入唯一酶切位点Pmel的基因组质粒 PAd55 A El A E3。穿梭质粒及pAd55 A El A E3质粒的构建示意图及酶切鉴定结果如附图2 所示。
[0093]实施例 3 :Ad55E4 基因的改造及 pAd55 A El A E3 (50rf6)、pAd55 A El A E3 (5E4)质 粒的构建。
[0094]l.Ad55E4基因改造的穿梭质粒构建。
[0095] 1)以Ad55基因组为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到Ad55E4基因。
[0096] R-delE3Mlu, GATCACGCGTGGACTAAGAGACCTGCTACCCATG(SEQ ID NO. 9)；
[0097] L-delK R，TGTAGATCTGTTTAAACCTTTAGCCCCATTACGTCAGTTTAG(SEQ ID NO.10)。
[0098] PCR 程序：95°C，30 秒；61°C，30 秒；72°C，4 分钟；25 个循环。
[0099] PCR产物末端加磷酸化之后，与平末端T载体（TaKaRa)连接，得到p55E4。
[0100] 2)以p55E4质粒为模板，PCR扩增得到末端加入SapI酶切位点且去除Ad55E40rf6 基因的线性化P55E4。
[0101] Sap-p55E4R, TTACGCTCTTCCTAGCCGTGATCCAGACTCCGG(SEQ ID NO. 11)；
[0102] Sap-p55E4orf6F，AGCTGCTCTTCCCATTCTCGTATTTTGTATAGCAAAACG(SEQ ID NO. 12)。
[0103] PCR 程序：95°C，30 秒；63°C，30 秒；72°C，5 分钟；25 个循环。
[0104] 以Ad5基因组为模板，PCR得到末端加入SapI位点的Ad5E40rf6基因。
[0105] Sap-50RF6F, AATAGCTCTTCCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ ID NO. 13)
[0106] Sap-50RF6R，ACTAGCTCTTCCATGACTACGTCCGGCGTTCC(SEQ ID NO. 14)。
[0107] PCR 程序：95°C，30 秒；61.5°C，30 秒；72°C，45 秒；25 个循环。
[0108] 上述线性化p55E4及Ad5E40rf6以SapI酶切后相连接，得到p55E4 (50rf6)。
[0109] 3)类似地，以p55E4质粒为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到末端加入SapI酶 切位点且去除Ad55E40rf (2-6)基因的线性化p55E4。
[0110] Sap-p55E4R, TTACGCTCTTCCTAGCCGTGATCCAGACTCCGG(SEQ ID NO. 11)；
[0111] Sap-p55E4orf2F, ATAGCTCTTCCCATTGTTAGTTTTGAATGAGTCTGCA(SEQ ID NO. 15)；
[0112] PCR 程序：95°C，30 秒；61.5°C，30 秒；72°C，4 分钟；25 个循环。
[0113] 以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到末端加入SapI位点的Ad5E40rf (2-6)。
[0114] Sap-50RF6F, AATAGCTCTTCCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ ID NO. 13)
[0115] Sap-50RF2R, ATATGCTCTTCCATGCAGAAACCCGCAGACATG(SEQ ID NO. 16)
[0116] PCR 程序：95°C，30 秒；61°C，30 秒；72°C，2 分钟；25 个循环。
[0117] 上述线性化p55E4及Ad5E40rf (2-6)片段以SapI酶切后相连接，得到 p55E4(5E4)。
[0118] 2. pAd55 AE1 AE3(50rf6)、pAd55 AE1 AE3(5E4)质粒的构建。
[0119] p55E4(50rf6)、p55E4(5E4)以 Mlul+Pmel 线性化，pAd55 AE1 AE3 以 Psil 线性化， 共转化BJ5183感受态细胞，重组得到缺失El、E3基因，且E4基因经过改造的基因组质粒 pAd55 A El A E3 (50rf6)、pAd55 A El A E3 (5E4)。具体构建过程及鉴定结果参见附图3。
[0120] 实施例4 :携带外源基因的穿梭质粒及pAd55AEl AE3(50rf6)-EGFP等复制缺陷 型Ad55基因组质粒的构建。
[0121] 1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒PGK551-EGFP。
[0122] 1)以Ad55基因组为模板PCR扩增得到E1区同源重组臂SE1L及SE1R :
[0123] SE1L引物序列：
[0124] SE1L F, AATGGTACCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO. 17)；
[0125] SE1L R，ATCGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO. 18)。
[0126] PCR 程序：95°C，30 秒；61°C，30 秒；72°C，30 秒；25 个循环。
[0127]SE1R引物序列：
[0128] SE1R F，AACACTAGTGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO. 19);
[0129] SE1R R，TTAACGCGTGTATACGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO. 20)。
[0130] PCR 程序：95°C，30 秒；60°C，30 秒；72°C，1 分钟 30 秒；25 个循环。
[0131] 2)构建携带重组臂的穿梭质粒pSElLR。
[0132] pSE3LR以KpnI+EcoRV切，SE1L同样酶切，连接得到pSElL ;pSElL以Spel+Mlul 切，SE1R同样切，连接得到pSElLR。
[0133] 3)构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK551-EGFP等。
[0134] 以pGAl-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。
[0135] CMV, AGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG(SEQID NO.21)；
[0136] BGH，GCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG(SEQID NO.22)。
[0137]PCR 程序：95°C，30 秒；66°C，30 秒；72°C，1分钟45 秒；25个循环。
[0138] pSElLR以Spel+EcoRV切，CMV-EGFP-BGH以Spel切，连接得到目标穿梭质粒 pGK551-EGFP〇
[0139] 2?构建基因组质粒 pAd55 AE1 AE3(50rf6)-EGFP 等。
[0140]pGK551-EGFP 质粒以 BstZ17I+SgrAI 切，乙醇沉淀回收；pAd55 AE1 AE3(50rf6)、 pAd55 AE1 AE3 (5E4)以Pmel线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183,同源重组得到携带外 源基因表达框的 pAd55 AE1 AE3(50rf6)-EGFP、pAd55 AE1 AE3(5E4)-EGFP 质粒。具体构建 过程及鉴定结果参见附图4。
[0141] 实施例5 :复制缺陷型Ad55载体的拯救与生产
[0142] 按照常规方法，pAd55 A El A E3 (50rf6) -EGFP、pAd55 A El A E3 (5E4) -EGFP 分别以 AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫 升含5%胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上 清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天 后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染6-10个15厘米皿； 2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清加至氯化铯密度梯度离心管； 4°C，35000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以0D260吸光度测定病毒粒子滴度， 计算公式为：病毒浓度=0D260X稀释倍