利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用家蚕合成蛋白的方法，尤其是涉及转基因技术的一种利用家蚕 后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法。
【背景技术】
[0002] 蜂王浆是工蜂哺育蜂咽下腺分泌的用来饲喂蜂王幼虫和1-3龄工蜂幼虫的食物， 也是决定蜜蜂极型分化的关键物质。蜂王和工蜂具有相同的遗传背景，但是蜂王一直饲喂 蜂王浆，寿命可以达到数年之久，而且产卵高峰期的产卵量可以达到2000多粒卵/日，工蜂 寿命一般只有一个月左右。通过蜂王浆饲喂果蝇也发现，新鲜蜂王浆能延长寿命，并且促进 雌性卵巢发育，提高繁殖力。同时蜂王浆也具有延缓衰老、抗氧化、提高免疫活性、促进细胞 增殖和预防癌症等生物学活性。蜂王浆由蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、无机盐和水等多 种物质组成，其中蛋白质包括非可溶性蛋白和可溶性蛋白，可溶性蛋白占总蛋白含量的一 半以上，称为蜂王衆主蛋白（Major royal jolly proteins，MRJPs)。目前已经发现的MRJPs 主要有10种，研宄的比较清楚的是MRJP1-MRJP5，而王浆主蛋白中含量最高的是MRJP1，达 到可溶蛋白含量的48%。
[0003] 研宄发现蜂王衆主蛋白1 (Major royal jolly protein 1，MRJP1)是决定蜜蜂级 型分化的关键因子，而且MRJP1具有缩短果蝇发育时间、提高雌性繁殖力和延长寿命的作 用，进一步的研宄表明，MRJP1是通过参与表皮生长因子受体（Epidermal growth factor rec印tor)代谢通路来实现以上功能的。通过对比新鲜蜂王浆和40°C存放7日已经降解 的蜂王浆的生物学特性，发现MRJP1具有促进原代培养的鼠肝细胞分裂的作用，具有促 进肝脏细胞形成和保护的作用。MRJP1和胰蛋白酶消化后的MRJP1也具有刺激巨噬细胞 释放肿瘤坏死因子a，起到抗肿瘤的作用。来源于MRJP1的肽段能够抑制血管紧张素酶 (angiotensin I-converting enzyme，ACE)活性，起到治疗高血压疾病的功能。
[0004] 中华蜜蜂蜂王浆主蛋白l(AccMRJPl)基因已经测序成功，该基因全长1462bp，编 码区序列全长1302bp，可编码长433个氨基酸的糖基化蛋白，其中包含一段20个氨基酸的 信号肽序列。序列分析发现，中华蜜蜂和西方蜜蜂的cDNA之间同源性达到93. 78 %，氨基酸 序列之间同源性为90. 5%。
[0005] 家蚕生物反应器具有对外源蛋白进行糖基化修饰的功能，利用家蚕后部丝腺生物 反应器大量生产蜂王浆主蛋1，为蜂王浆主蛋白1生物学功能研宄提供支持。
【发明内容】
[0006] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种利用家蚕后部丝 腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，利用转基因家蚕技术将蜂王浆主蛋白1基因导入家蚕 基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌蜂王浆主蛋白1的家蚕， 通过家蚕后部丝腺细胞分泌的蜂王浆主蛋白1可以在茧层中用磷酸盐缓冲液直接提取，为 提高蜂王浆主蛋白1的生产效率、降低生产成本奠定基础。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0008] (1)采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒pBMRJPl， 质粒pBMRJPl包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达 框；
[0009] (2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJPl质粒及能够提供piggyBac转座酶的 辅助质粒PHA3PIG质粒按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用 piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内；
[0010] ⑶蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在 G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的 转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
[0011] (4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基 因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
[0012] (5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配， 制成G4代；
[0013] (6)从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经 连续3代同样方法的选择、交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞 能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕；
[0014] (7)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，并随该转基因家蚕吐丝结 茧行为进入蚕茧。
[0015] 所述的质粒pBMRJPl是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因以用于 质粒的扩增和筛选，质粒pBMRJPl包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以用于 目的片段转座，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3XP3启动子 启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3XP3 Promoter-DsRed-SV40,以用作转基因阳性家 蚕的筛选标记；另一个功能表达框是包含蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因 信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、蜂王浆主蛋白1基 因（MRJP1编码基因）和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-MRJP1-Fibroin L chain SV40 PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序 列用于去除六个组氨酸标签。
[0016] 所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座 臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase_SV40 PolyA 〇
[0017] 所述的蜂王浆主蛋白1基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链 信号肽的作用下，分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺和前部丝腺，直到蚕茧。
[0018] 本发明是先构建家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的