载体pBMRJPl质粒，再利用显微 注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒一 起导入到家蚕受精卵内，依靠PiggyBac转座子的转座特性，使红色荧光蛋白基因和蜂王浆 主蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕 后部丝腺细胞特异性合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕，自交使蜂王浆主蛋白1基因 纯合，育成能分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕，然后利用该种转基因家蚕合成分泌蜂王 浆主蛋白1。
[0019] 本发明具有的有益效果是：
[0020] 本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕后部丝腺 细胞特异地合成分泌蜂王浆主蛋白1，蜂王浆主蛋白1制品具有生物活性，开发了一种新型 的蜂王浆主蛋白1生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，为大量生产蜂王浆主蛋白1奠 定了基础。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明pBMRJPl质粒结构图。
[0022] 图2是能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒结构图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0024] 本发明的实施例如下：
[0025] 实施例1 :
[0026] pBMRJPl质粒构建方法和步骤如下：
[0027] 设计蜂王衆主蛋白1 (Major royal jelly protein 1，MRJP1)的上游引物 MRJP1-F :5' -gatgatgataagagcagcattcttcgaggagaa-3'，下游引物 MRJP1-R :5' -ttacagatg tattgaaattttgaaagg-3'，采用PCR技术扩增MRJP1基因。MRJP1 PCR反应体系如表1所示， MRJP1 PCR反应条件如表2所示。
[0028] 表1 MRJP1 PCR反应体系
[0029]
【主权项】
1. 一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于该方法的步 骤如下： (1) 采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒PBMRJP1，质粒 pBMRJPl包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达框； (2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJPl质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅 助质粒PHA3PIG质粒按浓度比1 :1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用 piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内； (3) 蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代成为Gl代，在Gl代蚕 卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因 家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代； (4) G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的 家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代； (5) G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成 G4代； (6) 从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的方式 再连续3代进行选择和交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞能够 合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕； (7)通过该转基因家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蜂王浆主蛋白1随家 蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
2. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法， 其特征在于：所述的质粒pBMRJPl是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质 粒pBMRJPl包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个 功能表达框；一个功能表达框是3XP3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3XP3 Promoter -DsRed-SV40,另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝 素蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、 蜂王浆主蛋白1基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-MRJPI- Fibroin L chain PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用 于去除六个组氨酸标签。
3. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其 特征在于：所述的辅助质粒PHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座 臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase- SV40 PolyA0
4. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其 特征在于：所述的蜂王浆主蛋白1基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻 链信号肽的作用下分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺、前部丝腺直到蚕茧。
【专利摘要】本发明公开了一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法。先构建家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的载体pBMRJP1质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和蜂王浆主蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，自交使蜂王浆蛋白1基因纯合，育成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕后部丝腺细胞特异地合成分泌蜂王浆主蛋白1，蜂王浆主蛋白1制品具有生物活性，开发了一种新型的蜂王浆主蛋白1生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，为大量生产蜂王浆主蛋白1奠定了基础。
【IPC分类】C12N15-85, A01K67-04, C12N15-12, C12N15-65
【公开号】CN104846011
【申请号】CN201510119160
【发明人】钟伯雄, 钱秋杰, 叶露鹏, 尤征英, 车家倩, 王少华, 宋佳, 张玉玉
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年3月18日