一种细菌及其在生产十六碳二元酸中的应用的制作方法

本发明涉及高效生产DC₁₆的细菌，同时涉及其制备DC₁₆的方法，具体涉及利用培养法从石油污染土壤中，对能代谢正十六烷烃生成DC₁₆的细菌进行富集、筛选、分离和鉴定，并对其代谢生产的DC₁₆进行分离、纯化和测定。

背景技术：

DC₁₆是一种重要合成原料，可以用来合成麝香酮，代替天然麝香，用于配制多种中成药。DC₁₆在自然界中不存在，并且化工方法也很难合成，因此，生物代谢法成为生产DC₁₆最有效的方法。到目前为止，生物法生产DC₁₆均是利用热带假丝酵母菌(Candida cloacae)来完成，还没有发现利用细菌生产DC₁₆的报道。用热带假丝酵母菌(Candida cloacae)发酵法制备DC₁₆的报道最早出现在70年代， 如日本内尾等人用阴沟假丝酵母(Candida cloacae)MR-12 生产DC₁₆。后来，陈元童利用热带假丝酵母(Candida cloacae)突变株UH-3-9生产DC₁₆，通过向反应体系中添加丙烯酸，来抑制二羧酸的β-氧化，降低了热带假丝酵母(Candida cloacae)对已生成DC₁₆的分解，提高了DC₁₆的产率，发酵3天时DC₁₆的产量达到了54 g/L，均高于高忠祥（1990）和植村（1987）报道的40 g/L左右的产量。曹务波（2011）等公开了利用热带假丝酵母(Candida cloacae)突变株ly-6发酵正十六烷生产DC₁₆的发明专利，在补加正十六烷发酵165小时后, DC₁₆的产率为170.5 g/L，转化率为88.1%。热带假丝酵母菌(Candida cloacae) ，即热带念珠菌，属隐球酵母目、隐球酵母科，是一种真菌,可引起急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病,并可导致皮肤、粘膜、内脏受到损害等。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种生产DC₁₆的细菌，并提供了其具体的制备方法。本发明不但分离到一株能高效代谢生产DC₁₆的新种菌，丰富了微生物资源库，而且DC₁₆的发酵产率高于之前的研究，同时避免了使用热带假丝酵母菌发酵的危害。

本发明所提供的细菌编号为STKD-1，属于不动杆菌 Acinetobacter sp.属，其菌株保藏号为CGMCCNo.11839，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址在北京市朝阳区北辰西路一号院3号，保藏日期为2015年12月9日。

具体的本发明提供的细菌在制备十六碳二元酸中的制备步骤如下：

（1）制备培养基

发酵培养基II：

正十六烷 1.5g/L，蛋白胨4.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.15g/L ，KH₂PO₄ 0.8g/L，NaCl 0.1g/L，去离子水1000mL，调pH 为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；

液体筛选培养基：

K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄ ·7H₂O 0.5g/L, NH₄NO₃ 1.5g/L, FeCl₃ 0.025g/L, 无水CaCl₂0.01g/L，正十六烷1.5 g/L，用2M的NaOH 调节pH 至 7.0，121 ℃ 20 min灭菌，待用；

（2）发酵

正十六烷发酵细菌的预培养过程：将菌株接种到液体筛选培养基中，28 ℃，150 rpm/min条件振荡培养3 d，得到预培养液；

发酵过程：取预培养液20mL接种到3L发酵培养基II中，28 ℃，150 rpm/min振荡培养，每隔24 h用6 mol/L NaOH溶液调整发酵液pH至7.2，培养时间为20 d，发酵结束后取发酵液进行十六碳二元酸的提取及测定；

（3）十六碳二元酸的提取

将发酵液加热到85 ℃，边搅拌边用NaOH调整pH为11.0，趁热进行膜抽滤，所用滤膜为硝酸纤维素膜，孔径为0.22µm，收集抽滤液；将抽滤液在4 ℃条件下静置12 h，取抽滤液上部液体加入稀硫酸，调整pH为2.0，4 ℃条件下静置12 h，收集底部沉淀；取抽滤液下部沉淀加入去离子水溶解，用稀硫酸调整溶液pH至2.0，4 ℃条件下静置12 h，收集底部沉淀；合并两部分沉淀，低温真空干燥，即得总十六碳二元酸；

（4）气质联用方法测定十六碳二元酸含量。

本发明提供了一种能代谢产生DC₁₆的新细菌，避免了现有技术中使用热带念珠菌生产DC₁₆菌株的危害，同时，本发明提供的新细菌发酵生产DC₁₆的产率大于现有技术中其他生物法的产率。

附图说明

图1为气质联用（GC-MS）测定D₁₆结果；

图2为高效发酵生产DC₁₆菌株STDK-1的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1、细菌的富集

取青岛黄岛区中石化加油站附近的被石油污染的土壤10 g放入到烧杯中，再向其中加入90 mL的去离子水浸泡并搅拌，静置30 min，取浸出液5 mL加入到100mL液体富集培养基中，28 ℃条件下振荡培养（150 rpm/min）5 d，得到富集培养液；富集培养基组成（/L）：牛肉膏3.0g， 蛋白胨10.0g， NaCl 5.0g，用NaOH调pH为7.6，121 ℃ 20 min灭菌待用；

2、正十六烷发酵细菌的筛选与纯化

筛选培养基组成（/L）：K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5g, NH₄NO₃ 1.5g， FeCl₃0.025g, 无水CaCl₂ 0.01g，正十六烷1.5g，琼脂20g，用2M的NaOH 调节pH 至 7.0，121 ℃ 20 min灭菌，趁热倒平板，冷却后即得固体平板培养基，半固体筛选培养基加入琼脂4g/L,其他成分及含量不变，液体筛选培养基不加琼脂；分离过程：取上述富集培养液20 µL滴加到固体平板培养基上，然后涂抹均匀，28 ℃条件下静置培养3 d，挑取生长快的5个单菌落再分别进行划线平板培养，所用平板培养基以及培养条件均同前，共得到5组平板。分别观察5组平板菌落特征，如菌落特征不一致，则继续重复划线培养，直至菌落特征一致，此时平板菌落为单一菌（纯菌）。通过上述多次划线培养，共分离出5株纯菌，记作STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5，分别将这5株纯菌4 ℃条件下保存在半固体筛选培养基中，待用；

3、细菌的发酵产生DC₁₆所用培养基组成

（1）发酵培养基I组成（/L）：正十六烷2g，NaCl 0.5g, (NH₄)₂SO₄ 0.15g， MgSO₄·7H₂O 0.03g，NaNO₃ 0.1 g，NaH₂PO₄ 0.5g，FeCl₃ 0.04 g，去离子水配制，用NaOH调pH为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；

（2）发酵培养基II组成（/L）：正十六烷 1.5g，蛋白胨4.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.15g ，KH₂PO₄0.8g，NaCl 0.1g，去离子水1000mL，调pH 为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；

（3）发酵培养基III组成（/L）：正十六烷 2.5 g， KH₂PO₄ 1.5g， K₂HPO₄ 2.0g，NH₄ NO₃0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，无水CaCl₂ 0.01g，FeSO₄ 0.002g，去离子水1000mL，调pH 为7.2，分装到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 灭菌待用；

4、具体发酵过程：

（1）正十六烷发酵细菌的预培养过程：将菌株STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5分别接种到液体筛选培养基中，28 ℃条件振荡（150 rpm/min）培养3 d，得到预培养液；

（2）发酵过程：分别取STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5的预培养液20mL分别接种到3L发酵培养基I、发酵培养基II和发酵培养基III中，28 ℃振荡（150 rpm/min）培养，每隔24 h用6 mol/L NaOH溶液调整发酵液pH至7.2，培养时间为20 d，发酵结束后取发酵液进行DC₁₆的提取及测定；

5、DC₁₆的提取过程

将上述发酵液加热到85 ℃，边搅拌边用NaOH调整pH为11.0，趁热进行膜抽滤，所用滤膜为硝酸纤维素膜，孔径为0.22µm，收集抽滤液，此时滤液中为可溶性十六碳二元酸钠（温度为85 ℃条件下，十六碳二元酸钠为溶解态）。然后将抽滤液在4 ℃条件下静置12 h，十六碳二元酸钠低温下溶解度降低而沉淀在底部，分别对上部液体以及底部沉淀进一步处理，上部液体暂记作液（I），底部沉淀暂记作沉淀（I）；

注：液（I）中残留有少量十六碳二元酸钠；沉淀（I）为十六碳二元酸钠液（I）处理过程：向液（I）中加入稀硫酸，调整pH为2.0，此时残余在液（I）中的十六碳二元酸钠在酸性条件下形成DC₁₆，4 ℃条件下静置12 h，DC₁₆低温条件下溶解度降低，以晶体形式沉淀到容器底部，收集沉淀，记作沉淀（II）；

沉淀（I）处理过程：向沉淀（I）中加入去离子水溶解，然后用稀硫酸调整溶液的pH至2.0，4 ℃条件下静置12 h，DC₁₆低温条件下结晶在瓶底，记作沉淀（III）；

合并沉淀（II）和沉淀（III），低温真空干燥，即得到总DC₁₆，因为本发明中利用分离纯化到的5种菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）分别对三种发酵培养基（I，II和III）进行正十六烷烃的发酵生产DC₁₆，所以共得到15组总DC₁₆；

6、气质联用（GC-MS）方法测定DC₁₆

（1）气质联用（GC-MS）测定DC₁₆的运行参数

GC-MS参数设定：柱箱内平衡时间为0.25 min，设定最高温度为325 ℃，柱温升温程序为0 min达150℃，然后6 ℃/min升温到300 ℃，总运行时间为35 min；进样量为1 µL，样品清洗抽吸速度为300µL/min；

（2）气质联用（GC-MS）测定DC₁₆的结果

5菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）以上述三种发酵培养基（I、II和III）分别进行发酵产生DC₁₆，将发酵液通过结晶、低温干燥处理得到15组发酵晶体，用甲醇溶解15组晶体，溶解液用作进样，利用GC-MS 测定结晶体的物质组成,运行参数见6(1)。测定结果表明，15组结晶体出峰时间一致，利用数据库比对，判定15组结晶体在7.5min处出现的峰为DC₁₆，如图1；

7、DC₁₆产率的计算及最佳运行条件的确定

DC₁₆的发酵产率根据重量来计算。对STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5 5菌株分别在3L的液体培养基中发酵20 d，通过结晶和低温干燥，将获得的DC₁₆进行称重，根据发酵液体积，分别计算DC₁₆的发酵产率（表1）。由表1可以看出，在三种不同的发酵培养基（I、II和III）中，菌株STKD-1对正十六烷烃发酵生产DC₁₆的产率均为最大，分别为145.3g/L、176.2 g/L 和114.7 g/L。而比较三种不同的发酵培养基（I、II和III）对DC₁₆的发酵产率来看，发酵培养基II对5菌株的DC₁₆的发酵产率为最大，所以发酵生产DC₁₆的最佳组合为发酵培养基II和菌株STKD-1。据上述结果,在后续实验中选取菌株STKD-1为代表做进一步分析；

表1 5菌株在不同发酵培养基（I，II和III）中发酵20 d时的D₁₆发酵产率（单位：g/L）

8、STKD-1的分类学鉴定

5菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）发酵生产DC₁₆的结果表明，菌株STKD-1对正十六烷烃的发酵产率最大，因此，选取菌株STKD-1,对其系统分类学位置进行解析；

(1)菌株STKD-1DNA提取

菌株STKD-1 DNA的提取采用试剂盒-DP303来完成，提取步骤参照试剂盒中说明书；

(2) PCR对菌株STKD-1 DNA进行扩增

利用正向引物PF 5´-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3´和反向引物PR 5´-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3´对菌株STKD-1 16S rDNA进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）包括：1μL Taq DNA聚合酶，0.5μL模板DNA，5μL 10×PCR缓冲液，3.5μL MgCl₂，0.5μL PF和PR，2μL dNTP，37μL超纯水。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性45S，55℃退火45S，72℃延伸90S，32个循环，再72℃延伸10 min；

(3) DNA测序

将PCR产物用DNA测序仪（型号：Applied Biosystems 3730XL）进行测序，将测得的序列发送到DDBJ (DNA Data Bank of Japan）,获得菌株STKD-1的登录号为LC094963。

具体序列如下：

aacacatgca agtcgagcgg agagaggtag cttgctaccg atcttagcgg cggacgggtg

agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg gggacaacat ttcgaaagga atgctaatac

cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga tcttcggacc ttgcgctaat agatgagcct

aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc

tgagaggatg atccgccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc

agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa

ggccttatgg ttgtaaagca ctttaagcga ggaggaggct actttagtta atacctagag

atagtggacg ttactcgcag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat

acagagggtg caagcgttaa tcggatttac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggctaatt

aagtcaaatg tgaaatcccc gagcttaact tgggaattgc attcgatact ggttagctag

agtgtgggag aggatggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg

aataccgatg gcgaaggcag ccatctggcc taacactgac gctgaggtgc gaaagcatgg

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgtct actagccgtt

ggggcctttg aggctttagt gccgcattta acgcgataag tagaccgcct ggggagtacg

gtcgcaagac taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg

tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catagtaaga actttccaga

gatggattgg tgccttcggg aacttacata caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttttccttat ttgccagcga

gtaatgtcgg gaactttaag gatactgcca gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg

tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag

ggttgctacc tagcgatagg atgctaatct caaaaagccg atcgtagtcc ggattggagt

ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga

agtagctagc ctaactgcaa agagggcggt （SEQ ID NO:1）；

(4) 系统树的创建

利用近邻法对菌株STDK-1其同源性较高菌株的16S rDNA序列进行系统发育树创建，所用软件为CustalX2.1和Mega5。从系统树（图2）可以看出，菌株STDK-1属于Acinetobacter属，且与Acinetobacter calcoaceticus (X81661)的16S rDNA序列相似度为最高，为98%，是一种新种菌，命名为Acinetobactersp.STDK-1(LC094963)。

本发明从土壤中分离出能代谢产生DC₁₆的新细菌，然后在不同组成的培养基中加入正十六烷烃作为细菌的唯一碳源，对其摇床发酵培养，得到发酵液，对发酵液中DC₁₆进行分离纯化，并测定在3L发酵罐中经过20 d发酵后DC₁₆的产率。另外，对能代谢产生DC₁₆的细菌的DNA进行提取、测序和系统进化位置也进行了分析。结果表明，在分离纯化的5个菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）中，菌株STKD-1在发酵培养基II中发酵时，DC₁₆的产率最大，为176.2 g/L，比之前报道的利用热带假丝酵母菌代谢产生DC₁₆的产率都高。通过系统进化树分析，菌株STKD-1与Acinetobacter calcoaceticus (X81661)的16S rDNA序列相似度为最高(98%)，是一种新种菌，命名为Acinetobactersp.STDK-1，该菌株登录序号为LC094963。

<120>一种细菌及其在生产十六碳二元酸中的应用

<160>1

<210>1

<211>1410

<212>DNA

<213>来源于不动杆菌（Acinetobacter）

<222>(1)..(1410)

<400>1

aacacatgca agtcgagcgg agagaggtag cttgctaccg atcttagcgg cggacgggtg 60

agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg gggacaacat ttcgaaagga atgctaatac 120

cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga tcttcggacc ttgcgctaat agatgagcct 180

aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc 240

tgagaggatg atccgccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300

agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360

ggccttatgg ttgtaaagca ctttaagcga ggaggaggct actttagtta atacctagag 420

atagtggacg ttactcgcag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat 480

acagagggtg caagcgttaa tcggatttac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggctaatt 540

aagtcaaatg tgaaatcccc gagcttaact tgggaattgc attcgatact ggttagctag 600

agtgtgggag aggatggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg 660

aataccgatg gcgaaggcag ccatctggcc taacactgac gctgaggtgc gaaagcatgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgtct actagccgtt 780

ggggcctttg aggctttagt gccgcattta acgcgataag tagaccgcct ggggagtacg 840

gtcgcaagac taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900

tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catagtaaga actttccaga 960

gatggattgg tgccttcggg aacttacata caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttttccttat ttgccagcga 1080

gtaatgtcgg gaactttaag gatactgcca gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg 1140

tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag 1200

ggttgctacc tagcgatagg atgctaatct caaaaagccg atcgtagtcc ggattggagt 1260

ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga 1380

agtagctagc ctaactgcaa agagggcggt 1410