本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种转化脂肪酸衍生物生产长链二元酸的方法。
背景技术：
长链二元酸是指碳链上含有10个以上碳原子的直链二元酸,是重要的化工原料。长链二元酸制成的尼龙工程塑料具有极强的耐拉、耐磨、耐热性及柔韧性，以此改造的汽车轮胎，使用寿命是普通汽车的5～10倍。长链二元酸制成的润滑油不仅耐高温，而且能耐特低温。长链二元酸制成的高档服装耐水洗、耐干洗，版型挺括。以长链二元酸为原料制造的高级油漆，具有色泽光亮，耐磨，附着力强，柔韧，抗老化等特点，广泛作为轿车、国防帐篷、军用车辆及高级豪华物体表面涂漆等。由于长链二元酸下游产品的优良性能，直接促进了我国精细化工行业飞速发展，下游行业对长链二元酸的需求不断增长。
目前，国内所有生产企业都以石油中分离的长链烷烃为原料生产长链二元酸，但是石油不可再生且我国石油严重依赖进口。而脂肪酸及其衍生物属于可再生原料，且末端已经具有一个α-羧基，只需一步ω-氧化即可合成长链二元酸，作为替代底物具有显著优势，在节能环保和可持续发展方面具有重要的现实意义。脂肪酸衍生物的物理化学性质与长链烷烃类似，可以替代烷烃成为底物生产长链二元酸。因此本发明采用脂肪酸衍生物为底物合成长链二元酸。利用脂肪酸及其衍生物生产长链二元酸是一个较新的领域，发酵技术与工艺尚不成熟。
催化烷烃合成长链二元酸的细胞色素P450单加氧酶需要诱导，现有的长链二元酸发酵工艺多采用3％～10％的重蜡油为诱导剂，但重蜡油会抑制细胞增殖。
另外，本领域存在多种补加葡萄糖提高烷烃转化率的方法，例如，美国专利US6066480公开了在流加烷烃或脂肪酸的同时，流加葡萄糖， 提高了底物转化率。中国专利CN102994402A和CN1570124公开了在长链二元酸发酵过程的24h、48h、72h批次补加1％的葡萄糖，使不同链长烷烃的重量转化率达到了80％～90％之间(折合成烷烃的摩尔转化率约为55％～67％之间)。但是全程流加葡萄糖或批次补加葡萄糖会造成细胞代谢流向改变，转向利用葡萄糖进行细胞繁殖，从而降低了生产长链二元酸的效率。
技术实现要素：
本发明就是为了解决现有技术中诱导剂诱导效果不理想、葡萄糖添加时机不合适、长链二元酸生产效率低的技术问题，提供一种诱导剂诱导效果理想、葡萄糖添加时机合适、脂肪酸衍生物转化率高的转化脂肪酸衍生物生产长链二元酸的方法。
为此，本发明提供一种转化脂肪酸衍生物生产长链二元酸的方法，其采用脂肪酸衍生物为底物，用诱导剂脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯进行诱导，在发酵初期，流加葡萄糖以供应菌体生长，在发酵产酸的时间段采用流速补加葡萄糖。
优选地，长链二元酸为具有10～22个碳原子的直链脂肪族二元酸。
优选地，长链二元酸为十二碳二元酸。
优选地，脂肪酸衍生物为脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸丙酯、以及其他含10～22个碳原子的直链脂肪酸与含1～12个碳原子的直链脂肪醇合成的可溶于水的脂肪酸酯类物质。
优选地，脂肪酸衍生物为月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸甘油酯，以及月桂酸与其他含1～12个碳原子的直链脂肪醇合成的可溶于水的脂肪酸酯类物质。
优选地，诱导剂的体积百分比浓度范围为0.1％～5％之间。
优选地，诱导剂的体积百分比浓度范围0.5％～1％之间。
优选地，在0～14h补加的0.75g/mL葡萄糖的量为150～200ml。
优选地，发酵产酸的时间段为48～96h之间，葡萄糖的流加速度为0.1～1g/L/h。
优选地，诱导的时间为摇瓶种子生长期、罐上细胞生长期或从摇瓶种子到罐上细胞生长期全程。
优选地，诱导的时间为从摇瓶种子到罐上细胞生长期全程。
假丝酵母Candida sp.CGMCC 8927在标准的5-L发酵体系中、按照上面所述的发酵条件，发酵140-150h，可以生产至少145g/kg的十二碳二元酸，且达到80％以上的摩尔转化率。
本发明涉及的假丝酵母Candida sp.CGMCC 8927，分类命名为假丝酵母(Candida sp.)TDTC002；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年3月18日，保藏号编号为：CGMCC No.8927。
具体实施方式
本发明实施例中所用到的试剂均从公开市场上购买。
实施例1
(1)YPD固体平板培养基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨、2％的琼脂。
(2)液体种子培养基：磷酸二氢钾7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米浆40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自来水配制，月桂酸甲酯5％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20min，接种前加入并混匀。
(3)液体发酵培养基：磷酸二氢钾8～10g，酵母膏2～3g，玉米浆40～50g，葡萄糖15～20g，尿素1.2～2g，硝酸钾6～8g，吐温602～4g，泡敌2～4mL定容至1L，自然pH，121℃灭菌30min。其中葡萄糖和尿素单独110℃灭菌20min，灭好菌后再合并混匀。
(4)平板培养：在无菌条件下，按照无菌操作从-80℃冰箱保存的冻存管中挑取假丝酵母(Candida sp.)TDTC002于YPD固体平板培养基上划线，置于30℃恒温培养箱中培养48h。从YPD固体平板培养基上挑取生长理想的菌落再次划线YPD固体培养基进行二次活化。
(5)摇床培养：将二次活化YPD平板上的菌落刮入30ml不含诱导剂的种子培养基中，混匀后分别取1ml接入不含诱导剂、含5％(v/v)月桂酸甲酯的50mL种子培养基中，29.5℃，220r/min摇床中培养，OD620达到10左右时，取3mL种子液接入30mL发酵培养基中，置于29.5℃，220r/min恒温摇床中培养，培养16-20h，当OD620达到15.0以上时，调节pH至7.0～8.0之间，加入500μL月桂酸甲酯，之后间隔12h补加500μL月桂酸甲酯，并用2.5mol/L的NaOH将pH调至7.0～8.0之间，发酵过程共加入月桂酸甲酯3ml。96h调pH至9.0，测定十二碳二元酸产量。每组6个重复。
(6)摇瓶中十二碳二元酸总产量的测定：培养96h时，将各摇瓶pH调至9.0，11000r/min离心10min，取上清用稀硫酸调pH至3.0～3.5，抽滤得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀至pH为中性。用无水乙醇溶解沉淀，并用0.1mol/L的NaOH进行滴定，记录达到滴定终点时消耗的NaOH的体积V。
DC12(g/L)＝0.05*V*230.3/30
实验结果如表1
实施例2
(1)YPD固体平板培养基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨，2％的琼脂。
(2)液体种子培养基：磷酸二氢钾7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米浆40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自来水配制，月桂酸甲酯1％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20min，接种前加入并混匀。
(3)液体发酵培养基：磷酸二氢钾8～10g，酵母膏2～3g，玉米浆40～50g，葡萄糖100～120g，尿素1.2～2g，硝酸钾6～8g，吐温602～4g，泡敌2～4mL定容至1L，自然pH，121℃灭菌30min。其中尿素单独110℃灭菌20min，灭好菌后再合并混匀。葡萄糖配制成0.75g/ml葡萄糖溶液，105℃灭菌20min，发酵0-14h进行流加。
(4)平板培养：在无菌条件下，严格按照无菌操作从-80℃冰箱保存的冻存管中挑取假丝酵母(Candida sp.)TDTC002于YPD固体平板培养基上划线，置于30℃恒温培养箱中培养48h。从YPD固体平板培养基上挑取生长理想的菌落再次划线YPD固体培养基进行二次活化。
(5)摇床培养：将二次活化YPD平板上的菌落刮入30ml不含诱导剂的种子培养基中，混匀后分别取1ml接入含0％、1％、3％、5％月桂酸甲酯的液体种子培养基中进行培养，置于29.5℃，220r/min恒温摇床中培养12-16h，镜检：无杂菌污染，OD620：1.80以上。再次分别转入含0％、1％、3％、5％月桂酸甲酯的液体种子培养基中进行二次培养，培养10-14h，镜检：无杂菌污染，OD620：10.00以上。
(6)发酵罐培养：将活化好的种子液按5％～10％接种量接入含1.5L发酵培养基的5L罐，温度29.5℃，通风量2L/min，培养时间为140h-150h，在发酵第0-14h之间流加150mL 0.75g/mL的葡萄糖溶液。发酵过程通过5mol/L的NaOH逐级调控pH，控制体系pH值在4.5～6.5之间以生长菌体；进入产酸期，控制体系pH值在7.2～8.2之间。搅拌转速为300～600r/min，发酵过程中使溶氧保持在15～％25％。通过分批次补加的方式使发酵液中的底物浓度维持在3％～5％(v/v)之间。
(7)十二碳二元酸产量的测定：取适量混合均匀的发酵液，精密称 定(X)，稀释4～5倍，充分搅拌、酸沉至pH 3.0，抽滤收集沉淀，70℃干燥后，称重(Xs)，研成粉末。精密称定粉末100mg±2mg(W1g)和十二碳二元酸标品100mg±2mg(Ws)，分别用甲醇定容至10mL，并超声处理10min。离心，取上清液进行HPLC检测。HPLC检测条件如下：Luna 5μmC8(2)柱，进样量20μL，流速1mL/min；水-乙腈梯度洗脱，起始乙腈体积比为30％，20min时达到100％；DAD检测器，检测波长210nm。分别记录所测样品的二元酸峰(10.6min-10.8min)的峰面积S和标准样品的峰面积Ss。根据以下公式计算发酵液中二元酸的浓度(g/g)。
月桂酸甲酯的转化率和十二碳二元酸的产量如表2
实施例3
(1)YPD固体平板培养基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨，2％的琼脂。
(2)液体种子培养基：磷酸二氢钾7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米浆40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自来水配制，月桂酸甲酯1％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20min，接种前加入并混匀。
(3)液体发酵培养基：磷酸二氢钾8～10g，酵母膏2～3g，玉米浆40～50g，葡萄糖100～120g，尿素1.2～2g，硝酸钾6～8g，吐 温602～4g，泡敌2～4mL定容至1L，自然pH，121℃灭菌30min。其中尿素单独110℃灭菌20min，灭好菌后再合并混匀。葡萄糖配制成0.75g/mL的葡萄糖溶液，105℃灭菌20min，发酵0-14h进行流加。
(4)平板培养：在无菌条件下，严格按照无菌操作从-80℃冰箱保存的冻存管中挑取假丝酵母(Candida sp.)TDTC002于YPD固体平板培养基上划线，置于30℃恒温培养箱中培养48h。从YPD固体平板培养基上挑取生长理想的菌落再次划线YPD固体培养基进行二次活化。
(5)摇床培养：将二次活化YPD平板上的菌落刮入30ml不含诱导剂的种子培养基中，混匀后，a)取1ml接入不含月桂酸甲酯的液体种子培养基中进行培养，作为从发酵罐细胞生长期开始诱导组的一级种子；b)分别取1ml接入含1％的月桂酸甲酯的液体种子培养基中进行培养，作为仅种子诱导组和从种子开始诱导组的一级种子。置于29.5℃，220r/min恒温摇床中培养12-16h，镜检：无杂菌污染，OD620：1.80以上。再次分别对应实验组的液体种子培养基中进行二次培养，培养10-14h，镜检：无杂菌污染，OD620：10.00以上。
(6)发酵罐培养：将活化好的种子液按5％～10％接种量接入含1.5L发酵培养基的5L罐，分别向从发酵罐细胞生长期开始诱导组和从种子开始诱导组中加入1％的月桂酸甲酯进行诱导。温度29.5℃，通风量2L/min，培养时间为140h-150h，在发酵第0-14h之间流加150mL0.75g/mL的葡萄糖溶液。发酵过程通过5mol/L的NaOH逐级调控pH，控制体系pH值在4.5～6.5之间以生长菌体；进入产酸期，控制体系pH值在7.2～8.2之间。搅拌转速为300～600r/min，发酵过程中使溶氧保持在15％～25％。通过分批次补加的方式使发酵液中的底物浓度维持在3％～5％(v/v)之间。
(7)十二碳二元酸产量的测定：取适量混合均匀的发酵液，精密称定(X)，稀释4～5倍，充分搅拌、酸沉至pH 3.0，抽滤收集沉淀，70℃干燥后，称重(Xs)，研成粉末。精密称定粉末100mg±2mg(W1g)和十二碳二元酸标品100mg±2mg(Ws)，分别用甲醇定容至10mL，并超声处理10min。离心，取上清液进行HPLC检测。HPLC检测条件如下： Luna 5μmC8(2)柱，进样量20μL，流速1mL/min；水-乙腈梯度洗脱，起始乙腈体积比为30％，20min时达到100％；DAD检测器，检测波长210nm。分别记录所测样品的二元酸峰(10.6min-10.8min)的峰面积S和标准样品的峰面积Ss。根据以下公式计算发酵液中二元酸的浓度(g/g)。
月桂酸甲酯的转化率和十二碳二元酸的产量如表3
实施例4
(1)YPD固体平板培养基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨，2％的琼脂。
(2)液体种子培养基：磷酸二氢钾7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米浆40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自来水配制，月桂酸甲酯0.8％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分开单独110℃灭菌20min，接种前加入并混匀。
(3)液体发酵培养基：磷酸二氢钾8～10g，酵母膏2～3g，玉米浆40～50g，葡萄糖100～120g，尿素1.2～2g，硝酸盐6～8g，吐温602～4g，泡敌2～4mL定容至1L，自然pH，121℃灭菌30min。其中尿素单独110℃灭菌20min，灭好菌后再合并混匀。葡萄糖配制成0.75g/ml的葡萄糖溶液，105℃灭菌20min，发酵0-14h进行流加。另配 制0.5g/ml的葡萄糖溶液，105℃灭菌20min，发酵产酸过程的特定时段以不同的方式进行补加。
(3)平板培养：在无菌条件下，严格按照无菌操作从-80℃冰箱保存的冻存管中挑取假丝酵母(Candida sp.)TDTC002YPD于固体平板培养基上划线，置于30℃恒温培养箱中培养48h。从YPD固体平板培养基上挑取生长理想的菌落再次划线YPD固体培养基进行二次活化。
(4)摇床培养：从二次活化YPD平板上挑取生长理想的菌落接入液体种子培养基中进行培养，置于29.5℃，220r/min恒温摇床中培养12-16h，镜检：无杂菌污染，OD620：1.80以上。再次转入种子液中进行二次培养，培养10-14h，镜检：无杂菌污染，OD620：10.00以上。
(5)发酵罐培养：将活化好的二级种子液按5％～10％接种量接入含1.5L发酵培养基的5L罐，加入0.8％的月桂酸甲酯，温度29.5℃，通风量2L/min，培养时间为140h-150h，在发酵第0-14h之间流加200mL 0.75g/mL的葡萄糖溶液。发酵过程通过5mol/L的NaOH逐级调控pH，控制体系pH值在4.5～6.5之间以生长菌体；进入产酸期，控制体系pH值在7.2～8.2之间。搅拌转速为300～600r/min，发酵过程中使溶氧保持在15％～25％。通过分批次补加的方式使发酵液中的底物浓度维持在3％～5％(v/v)之间。并在产酸期分别按以下策略补加葡萄糖：a)以0.1～2g/L/h的流速全程流加；b)在24h、48h或72h中任选一个时间点一次性补加葡萄糖30g；c)以1g/L/h速度在以下时间段中任选一个时间段进行流加：24～48h、24～72h、48～72h、48～96h、60～84h、60～108h。
(6)十二碳二元酸产量的测定：取适量混合均匀的发酵液，精密称定(X)，稀释4～5倍，充分搅拌、酸沉至pH 3.0，抽滤收集沉淀，70℃干燥后，称重(Xs)，研成粉末。精密称定粉末100mg±2mg(W1g)和十二碳二元酸标品100mg±2mg(Ws)，分别用甲醇定容至10mL，并超声处理10min。离心，取上清液进行HPLC检测。HPLC检测条件如下：Luna 5μmC8(2)柱，进样量20μL，流速1mL/min；水-乙腈梯度洗脱，起始乙腈体积比为30％，20min时达到100％；DAD检测器，检测波长210nm。分别记录所测样品的二元酸峰(10.6min-10.8min)的峰面积S和 标准样品的峰面积Ss。根据以下公式计算发酵液中二元酸的浓度(g/g)。
月桂酸甲酯的转化率和十二碳二元酸的产量如下表4、表5、表6所示：
实施例5转化月桂酸乙酯生产十二碳二元酸
按照实施案例4的方法，底物采用月桂酸乙酯，用0.5％的月桂酸乙酯进行诱导，在发酵0-14h流加150mL 0.75g/mL的葡萄糖供应菌体生长。当发酵液中葡萄糖耗尽时，加入100ml月桂酸乙酯进入产酸阶段。发酵过程中保持月桂酸乙酯的浓度为3％～5％(v/v),用5M的NaOH自动流加控制pH。在发酵第48-72h间，以0.5g/L/h的速度流加0.5g/mL的葡萄糖溶液。发酵时间为144h。月桂酸乙酯的摩尔转化率达到83.39％，十二碳二元酸的浓度为151g/kg。