本发明涉及高分子聚合物制备领域，尤其是一种制备不同分子量聚苹果酸的提取方法。
背景技术：
聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，特殊的立体结构使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。聚苹果酸作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性和可化学衍生性。聚苹果酸的这些独特的性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。
聚苹果酸的生产方式主要有化学法和微生物合成法两种，相比于化学合成法，生物法合成聚苹果酸具有成本低、反应条件温和和分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸越来越吸引人们的注意。由于出芽短梗霉进行聚苹果酸发酵时，同时产生的色素和胞外多聚糖等副产物对聚苹果酸的提取造成一定的影响。因此，提取工艺的建立以及优化是聚苹果酸实现工业化生产急需解决的问题，所以对聚苹果酸提取工艺的研究有重要的意义和研究前景。
近年来，国内外对聚苹果酸的研究越来越多，主要集中在聚苹果酸的发酵菌株、发酵工艺等方面进行深入研究，并获得了高产量的菌株以及生产工艺，但对生物发酵生产聚苹果酸的提取工艺的研究很少，大多数专利和论文着重介绍的都是聚苹果酸菌株筛选以及发酵培养等方法以及简单的提取方法，例如申请号为201310746941.5的发明专利采用添加维生素的方法提高聚苹果酸的合成量，使产量达到45g/L；申请号为201410830995.4的发明专利采用补料发酵的方法提高聚苹果酸的产量，产量提高了11%~20%；宋存江2007年申请的专利中主要是采用有机溶剂醇沉获得聚苹果酸；2009年万印华发表的专利中主要是采用膜过滤、离子交换树脂等方法将发酵液中的其他物质去除来得到聚苹果酸产品；南京工业大学王浩等人采用离子交换法从发酵液中提取聚苹果酸；提取方法大多集中于有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)或离子交换提取聚苹果酸，不仅成本高，而且可能造成有机溶剂的残留，存在安全隐患。
技术实现要素：
为了克服上述技术问题，本发明提供一种制备不同分子量聚苹果酸的提取方法，工序少，降低了提取过程中聚苹果酸的损失率，提高了提取效率；工艺简单，易实现工业化提取工艺。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种制备不同分子量聚苹果酸的提取方法，包括以下步骤：
（1）发酵培养；
将出芽短梗霉斜面进行活化，采用洗菌的方法将孢子悬液接种到种子培养基中，在28℃，200r/min条件下培养40h；培养好的种子液按10%(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在25℃，200r/min条件下培养144h，即可获得聚苹果酸的发酵液；
（2）分离纯化；
一是板框过滤除菌脱色：发酵获得发酵液，加入等体积的蒸馏水进行稀释；添加0.8%~1.2%(m/v)的活性炭，搅拌均匀后，搅拌器搅拌条件下反应30min；然后添加1.0%~1.4%(m/v)的硅藻土作为助滤剂，实验室采用的硅藻土粒度统一为200目，搅拌均匀，使用800-1200目滤布经板框过滤机进行过滤，除去菌体和活性炭，滤液添加相同量的硅藻土进行二次板框处理去除残留的活性炭，达到脱色并除菌的效果；
二是分级超滤：除菌后的滤液分别经过截留分子量为10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纤维滤膜进行超滤，其中截留分子量为10KDa的滤膜主要是截留分子量较大的多糖等物质，截留分子量为1000Da的滤膜主要是去除小分子杂质，获得不同分子量区间的滤液；
三是成品制备：经过超滤获得的不同分子区间的滤液，经过旋蒸浓缩、冷冻干燥制备聚苹果酸的成品；真空干燥参数为真空度0.09MPa，温度-50℃；
四是聚苹果酸纯度的测定：称取一定量待测的聚苹果酸成品，配成浓度为2g/L的溶液，采用水解的方法将聚苹果酸水解成苹果酸单体，通过反向高效液相色谱的方法测定水解液中苹果酸的含量，进一步折算成聚苹果酸的含量，即可得出产品的纯度；
五是聚苹果酸分子量的测定：将聚苹果酸样品用流动相稀释到适当的浓度，用0.45μm的水膜过滤后，置于进样瓶中备用；然后用流动相分别精确配置2g/L 不同分子量的标准葡聚糖溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，利用液相色谱检测，得出色谱图，绘制标准曲线；将样品的液相检测图谱与标样的标准曲线对比即可得出聚苹果酸的分子量。
本发明所用菌种来源：天津北洋百川生物技术有限公司申请的专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法，申请号是200910071171.2。该专利中公开了本发明所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3337。
本发明的有益效果是，本发明针对出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的提取过程中存在杂质多、工序繁琐、损失率高等缺陷，进行了大量实验，将除菌操作与脱色环节合并，在减少工序环节节约能源的同时，降低了聚苹果酸的损失率；经过分级超滤获得不同分子区间的聚苹果酸，不仅能截留大分子杂质除小分子物质，还能获得不同分子量的聚苹果酸；最后经过浓缩、干燥即可获得成品；本发明的提取工艺具有操作简单、工序少、绿色环保、损失率低等优点，易实现大规模提取过程，实现工业化生产；通过实验，效果明显，分别获得分子区间为1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚苹果酸成品。
具体实施方式
实施例1
（1）发酵培养；
将出芽短梗霉斜面进行活化，采用洗菌的方法将孢子悬液接种到种子培养基中，28℃，200r/min条件下培养40h；培养好的种子液按10%(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，25℃，200r/min条件下培养144h，即可获得聚苹果酸的发酵液；
（2）分离纯化；
一是板框过滤除菌脱色：发酵获得发酵液，加入等体积的蒸馏水进行稀释。添加0.8% (m/v)的活性炭，搅拌均匀后，搅拌器搅拌条件下反应30min；然后添加1.0% (m/v)的硅藻土作为助滤剂，实验室采用的硅藻土粒度统一为200目，搅拌均匀，使用800目滤布经板框过滤机进行过滤，除去菌体和活性炭，滤液添加相同量的硅藻土进行二次板框处理去除残留的活性炭，达到脱色并除菌的效果；
二是分级超滤：除菌后的滤液分别经过截留分子量为10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纤维滤膜进行超滤，其中截留分子量为10KDa的滤膜主要是截留分子量较大的多糖等物质，截留分子量为1000Da的滤膜主要是去除小分子杂质，获得不同分子量区间的滤液；
三是成品制备：经过超滤获得的不同分子区间的滤液，经过旋蒸浓缩、冷冻干燥制备聚苹果酸的成品；真空干燥参数为真空度0.09MPa，温度-50℃；
经上述提取方法，得到不同的分子区间的聚苹果酸，分子区间在1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚苹果酸成品纯度分别为81%、74.6%、80.9%。
实施例2
（1）发酵培养；
将出芽短梗霉斜面进行活化，采用洗菌的方法将孢子悬液接种到种子培养基中，28℃，200r/min条件下培养40h；培养好的种子液按10%(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，25℃，200r/min条件下培养144h，即可获得聚苹果酸的发酵液；
（2）分离纯化；
一是板框过滤除菌脱色：发酵获得发酵液，加入等体积的蒸馏水进行稀释。添加1.0% (m/v)的活性炭，搅拌均匀后，搅拌器搅拌条件下反应30min；然后添加1.2% (m/v)的硅藻土作为助滤剂，实验室采用的硅藻土粒度统一为200目，搅拌均匀，使用1000目滤布经板框过滤机进行过滤，除去菌体和活性炭，滤液添加相同量的硅藻土进行二次板框处理去除残留的活性炭，达到脱色并除菌的效果；
二是分级超滤：除菌后的滤液分别经过截留分子量为10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纤维滤膜进行超滤，其中截留分子量为10KDa的滤膜主要是截留分子量较大的多糖等物质，截留分子量为1000Da的滤膜主要是去除小分子杂质，获得不同分子量区间的滤液；
三是成品制备：经过超滤获得的不同分子区间的滤液，经过旋蒸浓缩、冷冻干燥制备聚苹果酸的成品。真空干燥参数为真空度0.09MPa，温度-50℃；
经上述提取方法，得到不同的分子区间的聚苹果酸。分子区间在1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚苹果酸成品纯度分别为88.2%、84.7%、90.1%。
实施例3
（1）发酵培养；
将出芽短梗霉斜面进行活化，采用洗菌的方法将孢子悬液接种到种子培养基中，28℃，200r/min条件下培养40h；培养好的种子液按10%(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，25℃，200r/min条件下培养144h，即可获得聚苹果酸的发酵液；
（2）分离纯化；
一是板框过滤除菌脱色：发酵获得发酵液，加入等体积的蒸馏水进行稀释。添加1.2% (m/v)的活性炭，搅拌均匀后，搅拌器搅拌条件下反应30min；然后添加1.4% (m/v)的硅藻土作为助滤剂，实验室采用的硅藻土粒度统一为200目，搅拌均匀，使用1200目滤布经板框过滤机进行过滤，除去菌体和活性炭，滤液添加相同量的硅藻土进行二次板框处理去除残留的活性炭，达到脱色并除菌的效果；
二是分级超滤：除菌后的滤液分别经过截留分子量为10KDa、5000Da、3000Da、1000Da的中空纤维滤膜进行超滤，其中截留分子量为10KDa的滤膜主要是截留分子量较大的多糖等物质，截留分子量为1000Da的滤膜主要是去除小分子杂质，获得不同分子量区间的滤液；
三是成品制备：经过超滤获得的不同分子区间的滤液，经过旋蒸浓缩、冷冻干燥制备聚苹果酸的成品；真空干燥参数为真空度0.09MPa，温度-50℃；
经上述提取方法，得到不同的分子区间的聚苹果酸；分子区间在1000~3000Da、3000~5000Da、5000~10KDa的聚苹果酸成品纯度分别
为85.2%、84.7%、88.9%。