一种海带来源的褐藻功能寡糖的酶解制备方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种海带来源的褐藻功能寡糖的酶解制备方法。

背景技术：

褐藻胶在海藻中含量较高，主要存在于藻体的细胞壁及细胞间质中，从海带、马尾藻、巨藻、泡叶藻等褐藻中均可提取褐藻胶。工业应用的褐藻胶主要来源于海带、巨藻、泡叶藻三个属，欧美国家生产的褐藻胶大部分源自巨藻，中国生产的褐藻胶则更多源自海带。目前商品化的褐藻胶主要以褐藻酸钠等褐藻酸盐的形式存在，因褐藻酸盐具有独特的理化性质包括亲水、凝胶、粘稠等特性，可应用于食品、医药、印染、化工等多领域。

但天然提取的海藻多糖因其黏性大、不易溶解、难消化、分子量大等缺点，难以被动物体吸收利用，限制了其利用。褐藻寡糖是褐藻胶降解后生成的功能性低聚糖，一般是指聚合度（dp）低于20的糖链，其具有多种生物活性，尤其在抗氧化、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力等方面具有重要作用。目前，褐藻胶降解的方法主要分为三类：物理降解法、化学降解法和生物降解法。生物降解法是利用褐藻胶裂解酶作用于底物位点的差异性制备褐藻寡糖，其通过β-消除反应作用糖苷键形成的不饱和寡糖具有比化学降解法获得的饱和寡糖更好的生物活性。同时，生物降解法相较于化学降解法具有特异性高、酶解条件温和、反应过程易控、产物产率高、不污染环境等优势。

本发明采用现代微生物工程技术研发可生物降解褐藻多糖的褐藻胶裂解酶，再通过酶工程技术取代传统的化学降解法制备褐藻寡糖，使得海带中不易被人体吸收利用的高黏度多糖降解成富含生理活性的褐藻寡糖，以及一些小分子活性物质，实现了褐藻资源的高值化利用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种海带来源的褐藻功能寡糖的酶解制备方法，其可使海带中不易被人体吸收利用的高黏度多糖降解成富含生理活性的褐藻寡糖，有利于实现褐藻资源的高值化利用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种海带来源的褐藻功能寡糖的酶解制备方法，其特征在于：以海带为原料，采用碳酸钠碱提获得褐藻胶，再利用褐藻胶裂解酶酶解，并通过凝胶色谱纯化，制得所述褐藻功能寡糖。其具体包括以下步骤：

1）碱提制备褐藻胶：将海带清洗后绞碎，按料液比70g/l加水，于90℃、碳酸钠浓度3%w/v的条件下碱提3h，得褐藻胶；

2）酶解制备褐藻寡糖：在所得褐藻胶中加入磷酸缓冲液，加热溶解，配成浓度为0.2%w/v的底物，然后加入褐藻胶裂解酶0.35u/ml，于45℃、ph7.0条件下酶解3h，然后沸水浴灭酶处理5min，用sevage法反复抽提去除蛋白，12000r/min离心5min，弃沉淀，上清液（50℃）旋蒸至原体积的1/20，无水乙醇沉淀寡糖，经冷冻干燥后备用；

3）酶解寡糖的分离纯化：将所得酶解产物采用bio-gelp-6凝胶柱进行分离纯化，以0.2mol/l碳酸氢铵为洗脱液，流速为0.4ml/min，分别收集各组分并进行浓缩，经冷冻干燥后得纯化干品。

本发明的优点在于：本发明以海带为原料，采用碳酸钠碱提获得褐藻胶后，利用褐藻胶裂解酶降解，并采用bio-gelp-6凝胶柱分离纯化，制得富含生理活性的褐藻寡糖，有利于实现海带资源的高值化利用；同时，本发明使用的褐藻胶裂解酶为本实验室自行研制，其活性高，有助于降低褐藻寡糖的生产成本。

附图说明

图1为碱提时间的变化对褐藻胶得率的影响。

图2为碱提温度的变化对褐藻胶得率的影响。

图3为料液比的变化对褐藻胶得率的影响。

图4为碱浓度的变化对褐藻胶得率的影响。

图5为加酶量的变化对褐藻胶水解度的影响。

图6为酶解时间的变化对褐藻胶水解度的影响。

图7为酶解温度的变化对褐藻胶水解度的影响。

图8为ph的变化对褐藻胶水解度的影响。

图9为底物浓度的变化对褐藻胶水解度的影响。

图10为温度和ph对褐藻胶水解度影响的响应曲面图及等高线图。

图11为温度和加酶量对褐藻胶水解度影响的响应曲面图及等高线图。

图12为ph和加酶量对褐藻胶水解度影响的响应曲面图及等高线图。

图13为不同褐藻产物对羟自由基清除能力的对比图。

图14为不同褐藻产物对abts自由基清除能力的对比图。

图15为不同褐藻产物对dpph自由基清除能力的对比图。

图16为不同褐藻产物对超氧阴离子自由基清除能力的对比图。

图17为不同浓度褐藻酶解产物对酪氨酸酶双酚酶活力的抑制作用情况图。

图18为褐藻酶解产物的薄层色谱图，其中，m为褐藻寡糖标品；1为酶解产物。

图19为酶解产物采用凝胶柱分离纯化的情况图。

图20为各分离纯化产物的薄层色谱图，其中，m为褐藻寡糖标品；1为组分1；2为组分2；3为组分3。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

所用褐藻胶裂解酶按文献（韩伟，林娟，谢勇，等.“褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质”，《微生物学通报》，2017,44（5）：1074-1080）进行制备。

所用海带由福建亿达食品有限公司提供；所用bio-gelp-6凝胶、abts、dpph、酪氨酸酶均购自sigma公司；所用薄层用硅胶粉购自德国merck公司；所用褐藻寡糖标品购自青岛博智汇力公司；所用羧甲基纤维素钠(cmc)购自阿拉丁公司；所用无水乙醇、苯酚、硫酸、盐酸等常规药品均为国产分析纯试剂。

实施例1碱提海带制备褐藻胶的工艺优化

褐藻胶得率的计算方法为：褐藻胶得率（%）=褐藻胶干重/海带干重×100%。

1.在液料比50:1，温度70℃，碳酸钠浓度1%的条件下，考察碱提时间的变化对褐藻胶得率的影响，结果见图1。由图1可见，最适碱提时间为3h。

2.在液料比50:1，提取时间3h，碳酸钠浓度1%的条件下，考察温度的变化对褐藻胶得率的影响，结果见图2。由图2可见，最适碱提温度为80℃。

3.在碱提温度80℃，提取时间3h，碳酸钠浓度1%的条件下，考察料液比的变化对褐藻胶得率的影响，结果见图3。由图3可见，最适液料比为60:1。

4.在碱提温度80℃，提取时间3h，液料比60:1的条件下，考察碱液浓度的变化对褐藻胶得率的影响，结果见图4。由图4可见，最适碱浓度为2%。

5.在单因素实验的基础上，采用正交试验，按l9（3⁴）正交表对碱提褐藻胶中的时间（2h，3h，4h）、温度（70℃，80℃，90℃）、碱浓度（1%，2%，3%）、液料比（50:1，60:1，70:1）进行正交优化试验，各因素水平表如表1所示，正交试验设计及实验结果如表2所示，方差分析结果见表3。

表1因素水平表

表2正交试验设计及实验结果

表3方差分析表

方差分析可知，只有因素a（时间）对褐藻胶得率具有显著性影响，因素作用的主次顺序为a（时间）>d（液料比）>b（温度）>c（碱浓度），通过表2可知a、b、c、d的最优水平分别为a2b3c3d1，即从海带中碱提褐藻胶的最佳工艺条件为：时间为3h，温度90℃，碱浓度3%，液料比70:1，此时褐藻胶的最高得率为62%。

实施例2褐藻寡糖的酶解制备工艺优化

褐藻胶水解度的计算方法：

，

式中：n：苯酚-硫酸法测得糖含量，g；

m：苯酚-硫酸法测得总糖含量，g。

1.在酶解时间2h，温度50℃，底物浓度0.5%，ph值7.0的条件下，考察加酶量的变化对褐藻胶水解度的影响，结果见图5。由图5可见，当加酶量为0.3u/ml时水解度最大。

2.在酶解温度50℃，底物浓度0.5%，ph值7.0，加酶量0.3u/ml的条件下，考察酶解时间的变化对褐藻胶水解度的影响，结果见图6。由图6可见，当酶解时间为3h时水解度最大。

3.在酶解时间3h，底物浓度0.5%，ph7.0，加酶量0.3u/ml的条件下，考察酶解温度的变化对褐藻胶水解度的影响，结果见图7。由图7可见，当酶解温度为45℃时水解度最大。

4.在酶解时间3h，温度45℃，底物浓度0.5%，加酶量0.3u/ml的条件下，考察ph变化对褐藻胶水解度的影响，结果见图8。由图8可见，当ph为7.5时水解度最大。

5.在酶解时间3h，温度45℃，ph7.5，加酶量0.3u/ml的条件下，考察底物浓度的变化对褐藻胶水解度的影响，结果见图9。由图9可见，当底物浓度为0.2%时水解度最大。

6.在单因素实验的基础上，利用box-behnken中心组合实验进行实验设计，确定最优酶解工艺。因素水平编码表如表4所示，响应面实验方案及结果见表5。

表4响应曲面实验设计因素水平编码表

表5响应面实验方案及结果

二阶模型的建立与分析

利用design-expert8.0.5b软件对表5的实验结果进行回归分析，得到回归方程：y=67.86+1.42·x1-5.99·x2-15.04·x3+4.54·x1·x2-6.56·x2x3-9.98·x1²-12.62·x2²。

表6方差分析表

对模型进行方差分析，结果见表6。由表6可见，模型的f=74.00，p<0.0001<0.01，表明模型效应显著；失拟p=0.3251>0.05，表明方程对实验的拟合程度较好。x2、x3、x1x2、x2x3、x1²、x2²对褐藻胶水解度的影响极显著，表明酶解温度（x2）、ph（x3）、加酶量和酶解温度的交互作用（x1x2）、酶解温度和ph的交互作用（x2x3）、加酶量的平方（x1²）、酶解温度的平方（x2²）在所取水平范围内对褐藻胶水解度有显著影响。加酶量（x1）对回归方程的影响不显著。由各项的f值可知，各因素对褐藻胶水解度的影响程度依次为：x3（ph）>x2（酶解温度）>x1（加酶量）。

根据分析结果，得到最终优化条件为：最佳酶解工艺条件为ph7.0、温度45.15℃、加酶量0.35u/ml、酶解时间3h、底物浓度0.2%，水解度预测值为80.35%，水解度实验测定值为71.22%，说明该模型可以较好地反映实际酶解过程。

实施例3酶解产物的生物活性研究

褐藻寡糖酸解产物的制备：配制1.5%褐藻胶底物100ml，用盐酸调节ph至4.0，120℃烘箱中反应4h；反应后调ph至7.0，离心弃沉淀，上清液50℃旋蒸至原体积的1/20；无水乙醇沉淀寡糖，样品干燥后得酸解褐藻寡糖，备用。

1.羟自由基清除能力实验

由图13可见，在相同浓度下，褐藻酶解产物对羟自由基的清除能力（ic50为0.182mg/ml）明显高于酸解产物（ic50为0.448mg/ml）和褐藻胶多糖（ic50为0.554mg/ml）。

2.abts自由基清除能力实验

由图14可见，在相同浓度下，褐藻酶解产物清除abts自由基的能力（ic50为0.0798mg/ml）明显高于酸解产物（ic50为0.125mg/ml），而褐藻胶多糖对abts自由基基本没有清除能力。

3.dpph自由基清除能力实验

由图15可见，在相同浓度下，褐藻酶解产物清除dpph自由基的能力（ic50为0.11mg/ml）明显高于酸解产物（ic50大于0.4mg/ml），而褐藻胶多糖对dpph自由基基本没有清除能力。

4.超氧阴离子自由基清除能力实验

由图16可见，在相同浓度下，褐藻酶解产物具有清除超氧阴离子自由基的能力（ic50为0.26mg/ml），而褐藻胶多糖和酸解产物对超氧阴离子自由基的清除效果不明显。

5.对酪氨酸酶双酚酶活力的抑制作用

由图17可见，褐藻酶解产物对酪氨酸酶双酚酶催化l-多巴具有抑制作用，其ic50为1.8mg/ml，与酸解产物接近（ic50为1.62mg/ml），而褐藻胶多糖没有明显的抑制作用。

实施例4酶解产物的成分分析

将酶解得到的产物进行薄层色谱分析，所用展开剂为v正丁醇/v甲酸/v水=4：6：1。由图18可见，所得酶解产物主要含3种聚合度的褐藻寡糖，分别为dp1、dp2、dp3，其中dp2和dp3为主要产物，dp1为少量存在。

实施例5酶解产物的分离纯化

将酶解产物用bio-gelp-6凝胶柱进行分离，以0.2mol/l碳酸氢铵为洗脱液，流速为0.4ml/min，每2.5min收集一管，235nm下检测吸光值。由图19结果表明，各组分分离效果较好，得到3个主要成分，组分1（峰范围为430-467.5min）、组分2（峰范围为392.5-420min）、组分3（峰范围为362.5-377.5min）。收集各组分浓缩后进行薄层色谱分析，结果如图20。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。