β-甘露聚糖酶的组合物及使用方法
【专利说明】(3 -甘露聚糖酶的组合物及使用方法
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月7日提交的国际专利申请PCT/CN2012/086167的优先权， 将该国际专利申请以引用的方式全文并入本文。
技术领域
[0003] 本组合物和方法涉及源自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)的|3 -甘露 聚糖酶、编码甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的生产和使用方法。含有重组甘露 聚糖酶的制剂具有广泛的用途，例如用于水解某些软木类型的木质纤维素材料和/或包含 半乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡甘露聚糖（GM)的木质纤维素生物质底物。
【背景技术】
[0004] 纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种产生 能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶的微生物（例如，细菌、酵母和真菌）降解和 用作能源（Aro等人，（2001)，J. Biol. Chem.(《生物化学杂志》），276:24309-24314)。因为 非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的（Krishna等人， (2001)，Bioresource Tech.(《生物资源技术》），77:193-196)。通过生物过程有效利用 纤维素是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径（Ohmiya等人，（1997)，Biotechnol. Gen. Engineer Rev.(《生物技术和遗传工程评论》），14:365-414)。
[0005] 木质纤维素生物质材料的酶促水解大多集中于纤维素酶，其为水解纤维素（包含 0-1，4-葡聚糖或0D-葡糖苷键）而导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。传统上 将纤维素酶分为三大类：内切葡聚糖酶（EC 3. 2. 1. 4) ( "EG")、外切葡聚糖酶或纤维二糖水 解酶（EC 3. 2. 1. 91) ("CBH"）和0 -葡糖苷酶（[f3 ]-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC 3. 2. 1. 21) ("BG"）（Knowles 等人，（1987)，TIBTECH，5:255-261 ;以及 Schulein，（1988)，Methods Enzymol.(《酶学方法》），160:234-243)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶部分， 而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素（Nevalainen和Penttila，1995年，Mycota(《菌 界》)，303-319)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所 必需的（Suurnakki等人，（2000)，Cellulose (《纤维素》），7:189-209)。0-葡糖苷酶起到 从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡糖苷释放D-葡萄糖单元的作用（Freer，（1993)，J. Biol. Chem.(《生物化学杂志》），268:9337-9342)。
[0006] 但是，为了从木质纤维素生物质材料获得有用的可发酵糖，木质素通常将首先需 要例如通过各种预处理方法进行透化，并且使半纤维素破坏以便纤维素酶接触到纤维素。 半纤维素具有复杂的化学结构，它们的主链由甘露聚糖、木聚糖和半乳聚糖组成。甘露聚糖 类型的多糖存在于多种植物和植物组织中，例如存在于植物的种子、根、鳞茎和块茎中。这 类糖可包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖，并且它们通常含有直链0 -1，4-连接 的甘露糖单元和/或半乳糖单元构成的直链和散布链（interspersed chain)。大多数类型 的甘露聚糖不溶于水中，从而形成某些植物组织（如棕榈仁和象牙椰子）的硬度特性。另 一方面，半乳甘露聚糖往往可溶于水中，并且存在于豆科植物的种子胚乳中且据信有助于 保持这些种子中的水。
[0007] 复杂的木质纤维素结构和相当顽拗的植物细胞壁的酶促水解涉及许多不同的内 切酶和外切酶（例如纤维素酶和半纤维素酶）的协同和/或相续的作用。木聚糖酶和 0-甘露聚糖酶是内切酶，而甘露糖苷酶、葡糖苷酶和a-半乳糖苷酶是外切酶。 为破坏半纤维素，可将木聚糖酶与其他辅助蛋白（其非限制性例子包括L-a _阿拉伯呋喃 糖苷酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡萄糖醛酸酶和木糖苷酶）一起应用。
[0008] 内切-1,4-0-D-甘露聚糖酶（E.C. 3. 2. 1.78)催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘 露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链中的0-1，4-甘露糖苷键的随机水解，释放出短链和长链 寡甘露糖苷。短链寡甘露糖苷可包括甘露二糖和甘露三糖，不过有时候也可包括一些甘露 糖。这些短链寡甘露糖苷可被0 _甘露糖苷酶（E. C. 3. 2. 1. 25)进一步水解。另外，杂多糖 的侧链糖可例如通过a-半乳糖苷酶、葡糖苷酶和/或通过乙酰甘露聚糖酯酶进一步 水解至完全。Puls J.，（1997)，Macromol.Symp.(《大分子评论集》）120:183-196。
[0009] 已从细菌、真菌、植物和动物分离了 甘露聚糖酶。参见Araujo A.等人， (1990)，J.App.Bacteriol.(《应用细菌学杂志》）68:253-261 ;Dutta S.等人，（1997)， Plant Physiol.(《植物生理学》）113:155-161 ;Puchar V.等人，（2004)Biochim.Biophys. Acta(《生物化学与生物物理学学报》）1674:239-250。还已克隆了来自多种生物体的编码 这些酶的基因并进行了测序，基于它们的序列，它们中许多（如果不是全部的话）也已被归 类为糖基水解酶（GH)家族5或者26的成员。参见例如Bewley D. J.，（1997)，Planta (《植 物》)203:454-459 ;Halstead J.R.等人，（2000)，FEMS Microl. Lett.(《欧洲微生物学会联 合会微生物学快报》）192:197-203 ;Xu B.等人，（2002)，Eur.J.Biochem.(《欧洲生物化学杂 志》）269:1753-1760 ;Henrissat，B.，（1991)，Biochem.J.(《生物化学杂志》）280:309-316〇 尽管大多数甘露聚糖酶由其来源生物分泌，但有一些已知与细胞结合。从一给定的生 物体，可能有不止一种源自不同的基因或者相同基因的不同产物、具有不同的等电点的甘 露聚糖酶，这个事实据信是这些酶的重要性的指示。
[0010] e -甘露聚糖酶已在商业应用中使用，例如在诸如纸张和纸浆行业、食品和饲料行 业、医药行业和能源行业之类的行业中使用。Lee J.T.等人，（2003)，Poult. Sci.(《禽类 科学》）82:1925-1931 ;McCutchen M.C.等人，（1996)，Biotechnol. Bioeng.(《生物技术与 生物工程》）52:332_339;311111'仙1^1八.等人，（1997)，八(1￥.13;[0(3116111.￡叩.13;[0七6(3111101.(《生 物化学工程与生物技术进展》），57:261-287。但是，取决于甘露聚糖酶的来源微生物，不同 的0-甘露聚糖酶可具有不同的性质和活性谱（activity profile)，这些不同的性质和活 性谱可能使它们更适合于一种或多种工业应用而不适合于其他工业应用。木质纤维素生物 质底物（尤其是来自植物来源的那些木质纤维素生物质底物）的水解众所周知是困难的， 因此，已被发现可用于其他工业应用的甘露聚糖酶中很少（如果有的话）已被用来水解木 质纤维素材料。
[0011] 因此，对于鉴定这样的甘露聚糖酶和/或包含这种酶的组合物存在着需求，所述 甘露聚糖酶和/或组合物与市售的、新鉴定的或者工程改造的纤维素酶和其他半纤维素酶 联合，可有效地并能够将多种基于植物的和/或其他的纤维素或者半纤维素材料转化成可 发酵糖，同时具有足够的或者改善的效力、改善的可发酵糖产率和/或改善的作用于多种 多样的纤维素原料的能力。使用工程改造的微生物产生新的甘露聚糖酶也是重要的和合乎 期望的，因为这些是可能高成本效益地制备酶的手段。
【发明内容】
[0012] 本组合物和方法的一个方面是应用或者使用从地衣芽孢杆菌菌株这个细菌物种 分离的高活性0-甘露聚糖酶来水解木质纤维素生物质底物。本文所述的SEQ ID NO:2 的序列最初作为对DSM菌株地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580测序的结果而得到描述，并且 它被指明为糖基水解酶。参见例如Rey等人，（2004)Gen〇me Biol.(《基因组生物学》）， 5(10) :R77。至少一篇后续的文章将该特定序列描述为内切葡聚糖酶。参见例如Math R.K.等人，载于2009年8月给NCBI的提交文件中，GenBank登录号为ACY72383. 1。迄今， 尚未将该基因与0 _甘露聚糖酶活性相关联，也没有在非地衣芽孢杆菌的工程微生物体中 异源表达或产生该酶的例子。此外，在酶混合物中包含这种多肽或其变体加上一种或多种 纤维素酶、一种或多种半纤维素酶或者一种或多种纤维素酶和一种或多种半纤维素的组合 的组合物尚未制备或用于与纤维素生物质水解相关的工业应用。
[0013] 因此本发明的一个方面是这样的发现，即与SEQ ID NO:2或者与成熟序列SEQ ID NO: 3 (其为SEQ ID NO: 2的残基32-395)具有至少80% (例如至少80%、至少85%、至少 90%、至少91%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或者更高）同一性的多肽具有甘露聚糖酶活性。本发明的另 一个方面是这样的发现，当这种多肽与一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维 素酶组合时可赋予该组合物或混合物改善的水解木质纤维素生物质底物的能力。这种改善 包括例如选自以下的性质中的一者或多者：葡聚糖转化提高、从给定的生物质底物得到葡 萄糖的产率提高、木聚糖转化提高、木糖产率提高、从给定的生物质底物得到总可溶性糖的 产率提高、在某一固形物水平下的给定生物质底物的液化更加快速以及在某一固形物水平 下的生物质底物的粘度降低更加快速。改善还可包括这样的出乎意料的发现，即这种多肽 当与任选还包含一种或多种其他半纤维素酶的纤维素酶混合物或者组合物进行组合时，可 用于增强纤维素生物质的转化和水解。所得的包含BliGh3多肽的混合物与具有相同浓度 /比例/量的所有其他酶但不具有BliGh3的对等混合物相比，具有改善的水解性能。在一 些实施例中，BliGh3多肽可替代例如高达约20重量％ (例如高达约20重量％、高达约18 重量％、高达约16重量％、高达约14重量％、高达约12重量％、高达约10重量％、高达约8 重量％、高达约5重量％等）的纤维素酶混合物或者组合物，并且该替代的组合物当用于水 解给定的木质纤维素生物质底物时将保留其能力和水解性能，或者甚至与未被替代的但具 有相同酶组成和相同总蛋白的对等纤维素混合物或者组合物相比具有改善的水解（例如 较高的葡聚糖和/或木聚糖转化率、较高的总糖产量、较快的液化和/或改善的粘度降低）。
[0014] 本组合物和方法的一个方面涉及源自地衣芽孢杆菌的糖基水解酶家族5的0 -甘 露聚糖酶多肽及其具有甘露聚糖酶活性的合适变体（在本文中称为"BliGh3"或者 "BliGh3多肽")、编码所述酶的核酸、包含所述酶的组合物以及制备所述甘露聚糖酶多 肽及包含其的组合物并将它们应用于水解或者转化木质纤维素生物质为可溶性可发酵糖 的方法。特别合适的木质纤维素生物质材料是那些含有半乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡 甘露聚糖（GM)的木质纤维素生物质材料然后可将此类可发酵糖转化成纤维素乙醇、燃料 以及其他生物化学物质和可用产物。在某些实施例中，甘露聚糖酶多肽当与包含至少 一种纤维素酶或至少一种其他半纤维素酶的酶混合物或者与包含至少一种纤维素酶和至 少一种其他半纤维素酶的酶混合物进行组合时，所得到的酶混合物与例如来自各种微生物 的、具有类似的最佳pH和/或类似的最佳温度的其他0 -甘露聚糖酶相比，能够具有提高 的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力。
[0015] 这种提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力例如反映在以下方面： 不仅由经某种方式预处理的给定木质纤维素生物质底物的酶促水解所产生的总可溶性糖 的产量极大地提高，而且出乎意料的是葡萄糖的产量也提高（反映较高的葡聚糖转化率） 和/或木聚糖的产量也提高（反映较高的木聚糖转化率）。
[0016] 该提高的或者增强的水解木质纤维素生物质材料的能力，也可反映在这种酶组合 物改善或者加速经预处理的生物质材料的液化和/或降低其粘度的合乎期望的能力。如果 使用高固形物水平的生物质材料作为底物的话，这种粘度/液化有益效果是最显著的。当 使用该酶组合物/混合物来分解或者水解往往具有高度纤维性