-甘露聚 糖酶成熟序列有效连接的合适信号肽的核酸构建体，涉及分离的多核苷酸、核酸构建体、重 组表达载体或者包含这种核酸构建体的工程改造的宿主细胞。在一些实施例中，信号肽和 0 _甘露聚糖酶序列源自不同的微生物。
[0049] 还提供了包含与调控序列有效组合的分离的核酸的表达载体。另外，提供了包含 该表达载体的宿主细胞。在另外的实施例中，提供了组合物，该组合物包含宿主细胞和培养 基。
[0050] 在一些实施例中，宿主细胞为细菌细胞或真菌细胞。
[0051] 在另外的实施例中，BliGh3多肽由宿主细胞异源表达。例如，BliGh3多肽由不是 地衣芽孢杆菌的工程改造的微生物表达。在一些实施例中，BliGh3多肽与一种或多种纤维 素酶基因共表达。在一些实施例中，BliGh3多肽与一种或多种其他半纤维素酶基因共表达。
[0052] 在一些方面，提供包含前面段落的重组BliGh3多肽的组合物和制备这种组合物 的方法。在一些实施例中，该组合物还包含一种或多种纤维素酶，其中该一种或多种纤维素 酶与BliGh3多肽一起由宿主细胞共表达。在其他实施例中，包含BliGh3多肽的组合物可 以是分离的、任选经过纯化的BliGh3多肽与一种或多种纤维素酶和/或其他酶物理共混的 掺混物。例如，该一种或多种纤维素酶可选自无或一种或多种葡糖苷酶、一种或多种纤 维二糖水解酶和/或一种或多种内切葡聚糖酶。在某些具体的实施例中，这种葡糖苷 酶、纤维二糖水解酶和/或内切葡聚糖酶如果存在的话，可与BliGh3多肽一起由单一宿主 细胞共表达。在一些实施例中，该两种或多种纤维素酶中的至少两者可彼此异源或者源自 不同的生物体。例如，该组合物可包含至少一种葡糖苷酶和至少一种纤维二糖水解酶， 其中该葡糖苷酶和该纤维二糖水解酶不来自相同的微生物。在一些实施例中，所述纤 维素酶中的一者或多者是宿主细胞内源的，但以与在宿主细胞中原本的天然表达水平不同 的水平被过量表达或者表达。例如，所述纤维素酶中的一者或多者可以是里氏木霉CBH1和 /或CBH2,它们为里氏木霉宿主细胞天然所有，但CBH1和CBH2任一者或两者在与BliGh3 多肽一起在里氏木霉宿主细胞中共表达时被过量表达或不足表达。
[0053] 在某些实施例中，包含重组BliGh3多肽的组合物还可包含一种或多种其他半纤 维素酶，其中该一种或多种其他半纤维素酶与BliGh3多肽一起由宿主细胞共表达。例如， 该一种或多种其他半纤维素酶可选自一种或多种其他甘露聚糖酶、一种或多种木聚糖 酶、一种或多种木糖苷酶和/或一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在某些实施例中， 这种其他甘露聚糖酶、木聚糖酶、0 _木糖苷酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶如果存在的话，可与 BliGh3多肽一起由单一宿主细胞共表达；或者作为另一种选择，这种其他甘露聚糖酶、木 聚糖酶、0 _木糖苷酶和L-阿拉伯呋喃糖苷酶中的一者或多者或全部如果存在的话，不是 与BliGh3多肽一起在单一宿主细胞中共表达，而是各个酶由其各自的宿主细胞产生后被 物理混合或共混在一起以形成酶组合物。
[0054] 在另外的方面，包含重组BliGh3多肽的组合物还可包含一种或多种纤维素酶和 一种或多种其他半纤维素酶，其中该一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素 酶与BliGh3多肽一起由宿主细胞共表达。例如，BliGh3多肽可与一种或多种葡糖苷 酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种内切-木聚糖酶、 一种或多种0 _木糖苷酶和/或一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及其他非纤维素酶非 半纤维素酶或蛋白质一起在相同的宿主细胞中共表达。作为另一种选择，包含重组BliGh3 多肽并包含一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶的组合物可通过在产生后 将BliGh3多肽与一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶物理混合在一起来制 备，其中BliGh3多肽和该一种或多种纤维素酶和一种或多种其他半纤维素酶从不同的宿 主细胞产生。本组合物和方法的各方面因此包括包含上文描述的除了表达BliGh3多肽以 外还共表达多种酶的宿主细胞及培养基的组合物。作为另一种选择，本组合物和方法的各 方面包括第一组合物和第二组合物并任选包括第三组合物，该第一组合物包含表达BliGh3 多肽并任选还表达一种或多种其他酶/蛋白质的第一宿主细胞，该第二组合物包含表达例 如一种或多种纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶的第二宿主细胞，该第三组合物 包含表达例如与该第一和第二宿主细胞所表达的纤维素酶和/或其他半纤维素酶不同的 一种或多种其他纤维素酶和/或一种或多种其他半纤维素酶的第三宿主细胞。如果适宜的 话，这种由宿主细胞的产酶得到的第一、第二和第三组合物可适当地进行物理共混或者混 合以形成构成本组合物的酶的掺混物。还提供这样的组合物，其包含按照本文的方法在一 种培养基或者多种培养基（视所需而定）的上清液中产生的BliGh3多肽和其他酶。此类 培养基上清液可按原样使用，进行很少或不进行产生后的加工，所述产生后的加工可通常 包括用以移除细胞碎片的过滤、细胞杀死程序和/或用以富集或浓缩其中的酶的超滤或其 他步骤。此类上清液在本文中称为"全发酵液"或"全纤维素酶发酵液"。
[0055] 在另外方面，本发明涉及在适于降解或转化纤维素材料并适于从纤维素材料产生 物质的条件下施加或使用上述组合物的方法。
[0056] 在另一个方面，提供了用于将纤维素材料降解或转化成可发酵糖的方法，该方法 包括：使优选已经经历一个或多个预处理步骤的纤维素材料与前述段落之一的BliGh3多 肽或者包含这种多肽的组合物进行接触以产生可发酵糖。
[0057] 因此，本说明书涉及下列具体方面：
[0058] 在第一方面，一种包含重组多肽和一种或多种纤维素酶的酶组合物，所述重组多 肽包含与SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 3的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列， 其中所述多肽具有甘露聚糖酶活性。
[0059] 在第二方面，第一方面所述的酶组合物，其中当所述重组多肽构成所述酶组合物 的高达20重量％时，所述重组多肽改善所述酶组合物的水解性能，其中所述改善的水解性 能包括：
[0060] (a)在相同的水解条件下从给定木质纤维素生物质底物转化的葡聚糖转化百分数 提高、木聚糖转化百分数提高和/或葡聚糖转化百分数及木聚糖转化百分数提高；或者
[0061] (b)在相同的水解条件下给定木质纤维素生物质底物的粘度减少快至少约5%。
[0062] 在第三方面，第一或者第二方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ IDNO:4的ScoManl的甘露聚糖酶活性相比具有提高的甘露聚糖酶活性。
[0063] 在第四方面，第一或者第二方面所述的酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ IDNO:5的BspManl的甘露聚糖酶活性相比具有提高的甘露聚糖酶活性。
[0064] 在第五方面，第一或者第二方面的所述酶组合物，其中所述重组多肽与包含SEQ IDNO:6的MspMan2的甘露聚糖酶活性相比具有提高的甘露聚糖酶活性。
[0065] 在第六方面，第一至第五方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多 肽当在pH 4至pH 8的pH范围进行温育时保留所述0 -甘露聚糖酶活性的70%以上。
[0066] 在第七方面，第一至第六方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多 肽在约7. 0的pH下具有最佳0 -甘露聚糖酶活性。
[0067] 在第八方面，第一至第七方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多 肽当在50°C至78°C之间的温度下进行温育时，保留所述甘露聚糖酶活性的至少80%或 者更多。
[0068] 在第九方面，第一至第八方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多 肽在约71°C的温度具有最佳甘露聚糖酶活性。
[0069] 在第十方面，第一至第九方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组多 肽在约59°C的温度温育约2小时时保留所述-甘露聚糖酶活性的至少50%。
[0070] 在第十一方面，第一至第十方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重组 多肽在高达60°C的温度温育约2小时时保留所述0 -甘露聚糖酶活性的至少99%。
[0071] 在第十二方面，第一至第十一方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重 组多肽包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序 列。
[0072] 在第十三方面，第一至第十二方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重 组多肽包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序 列。
[0073] 在第十四方面，第一至第十三方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述重 组多肽包含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序 列。
[0074] 在第十五方面，第一至第十四方面中的任一个方面所述的酶组合物，其中所述一 种或多种纤维素酶选自一种或多种0 _葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶和一种或多 种内切葡聚糖酶。
[0075] 在第十六方面，第一至第十五方面中的任一个方面所述的酶组合物，还包含一种 或多种其他半纤维素酶。
[0076] 在第十七方面，第十六方面所述的酶组合物，其中所述一种或多种其他半纤维素 酶选自一种或多种其他0-甘露聚糖酶、一种或多种木聚糖酶、一种或多种0-木糖苷酶和 一种或多种L-阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0077] 在第十八方面，一种编码包含与SEQIDNO:2或者与成熟多肽SEQIDNO:3具有 至少80%同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸，其中所述重组多肽具有甘露聚糖酶 活性。
[0078] 在第十九方面，第十八方面所述的核酸，其中所述重组多肽还包含信号肽序列。
[0079] 在第二十方面，第十九方面所述的核酸，其中所述信号肽选自SEQIDNO: 15-43中 的任何一者。
[0080] 在第二十一方面，一种表达载体，所述表达载体包含与调控序列有效组合的第 十八至第二十方面中的任何一个方面所述的核酸。
[0081] 在第二十二方面，一种包含第二^^一方面所述的表达载体的宿主细胞。
[0082] 第二十三方面，第二十二方面所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或 者真菌细胞。
[0083] 在第二十四方面，一种包含第二十二方面或者第二十三方面所述的宿主细胞及培 养基的组合物。
[0084] 第二十五方面，一种产生甘露聚糖酶的方法，包括：在培养基中，在适合产生 所述甘露聚糖酶的条件下，培养第二十二或者第二十三方面所述的宿主细胞。
[0085] 在第二十六方面，一种包含根据第二十五方面所述的方法在所述培养基的上清液 中产生的0-甘露聚糖酶的组合物。
[0086] 第二十七方面，一种用于水解木质纤维素生物质底物的方法，包括：使所述木质纤 维素生物质底物与第一至第十七和第二十六方面中任何一个方面所述的酶组合物进行接 触，以产生葡萄糖和其他糖类。
[0087] 第二十八方面，第二十七方面所述的方法，其中所述木质纤维素生物质底物包含 高达约20重量％、高达约15 %或者高达约10重量％的半乳葡甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。
[0088] 第二十九方面，一种包含第一至第十七方面中的任何一个方面所述的酶组合物及 木质纤维素生物质底物的组合物。
[0089] 第三十方面，第二十九方面所述的组合物，其中所述木质纤维素生物质底物包含 高达约20重量％或者高达约15重量％或者高达约10重量％的半乳葡甘露聚糖和/或葡 甘露聚糖。
【附图说明】
[0090]图 1 示出了 pZQ153(aprE-BliGH3)载体的图谱。
[0091] 图2示出了 pTrex3gM构建体的图谱。
[0092] 图3示出了 BliGh3的pH曲线。pH对BliGh3的0-甘露聚糖酶活性的影响是使 用1 %刺槐豆胶作为底物在50mM柠檬酸钠和50mM磷酸钠缓冲液中在50°C保持10分钟而 测量的，该缓冲液被调节至在pH 2-9之间的各个pH值。将BliGh3多肽在其最佳pH下的 甘露聚糖酶活性归一化到100%，并将该多肽在其他pH值下的甘露聚糖酶活性作为最佳pH 下的活性的相对活性示出。
[0093] 图4示出了BliGh3的温度曲线。温度变化对BliGh3的甘露聚糖酶活性的影 响是使用1%刺槐豆胶作为底物在pH 6. 0的50mM柠檬酸钠缓冲液中在30°C至78°C之间的 各温度值下保持10分钟测量的。将BliGh3多肽在其最佳温度下的甘露聚糖酶活性归一化 到100%，并将该多肽在其他温度值下的甘露聚糖酶活