性作为最佳温度下的活性的相对活 性示出。
[0094] 图5示出了 BliGh3的热稳定性曲线。BliGh3的热稳定性是通过在pH6.0的50mM 柠檬酸钠缓冲液中在40°C至65°C范围内的设定温度下温育2小时测定的。在温育后，测量 每个温育温度下的剩余甘露聚糖酶活性。使用从保持在冰上同样2小时的BliGh3多肽对 照样品测量的活性作为100%活性，以归一化残余活性测量值。
[0095] 图6A-6C示出了如下的酶组合在相同的水解条件下和在不同的反应持续时间对 给定的生物质底物即碱性KRAFT预处理的软木底物FPP-27所实现的水解水平的比较：市 售的纤维素酶/半纤维素酶组合物Accellerase? 份Aceellerase? TRIO?与1份 (即10重量％ )BliGh3多肽的共混物；9份AccenemseK TRIO?与1份GH5的三种其他 0-甘露聚糖酶之一的共混物，所述三种其他0-甘露聚糖酶为SEQ ID N0:4的天蓝色链霉 菌A3 0-甘露聚糖酶（"ScoManl")、SEQ ID N0:5的热速芽孢杆菌0-甘露聚糖酶（"Bsp Manl"）、SEQ ID N0:6的小单孢菌L5 0-甘露聚糖酶（"Msp Man2)。图6A示出了 24小时 后的水解结果。图6B示出了 48小时后的水解结果。图6C示出了 72小时后的水解结果。 实验的细节见实例9。
[0096] 图7示出了如下的酶组合对FPP-27碱性KRAFT预处理的软木底物在24小时至72 小时的时程后的总水解的比较：Aecellerase? TRI0?;9份Aecellerase?TRl〇?与分别1份 (即10重量％)BliGh3多肽、SEQ ID勵:4的天蓝色链霉菌八3 0-甘露聚糖酶("5(3〇1&1111")、 SEQIDN0:5的热速芽孢杆菌0-甘露聚糖酶（"BspManl"）、SEQIDN0:6的小单孢菌L5 0-甘露聚糖酶（"MspMan2)的共混物。实验的细节见实例9。
[0097] 图8A-图8G不出了本公开的序列和序列标识符。
【具体实施方式】
[0098] 1.综沭
[0099] 本文描述涉及来自地衣芽孢杆菌的属于糖基水解酶家族5的重组0 -甘露聚糖酶 的组合物和方法。本组合物和方法部分地基于这样的观察结果，即重组BliGh3多肽较于具 有类似最佳pH和/或最佳温度的其他已知0 -甘露聚糖酶，赋予包含至少一种纤维素酶 和/或至少一种其他半纤维素酶的纤维素酶和/或半纤维素酶组合物改善的水解木质纤维 素生物质材料或者原料的能力。本组合物和方法还基于这样的观察结果，即当将包含重组 BliGh3多肽的组合物用于水解合适的木质纤维素生物质底物，尤其是当这种底物在高固形 物水平下被处理时，并且当这种底物含有明显水平的半乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡甘露 聚糖（GM)时，该多肽赋予快速的粘度降低。BliGh3多肽的这些特征使其或其变体适合用于 多种过程，包括例如用于木质纤维素生物质原料的转化或者水解。
[0100] 在更详细地描述本发明组合物和方法之前，应当理解，本发明组合物和方法不限 于所述的具体实施例，因为这些当然可改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述具体 实施例的目的，并非旨在进行限制，因为本发明组合物和方法的范围将仅受所附权利要求 的限定。
[0101] 当提供值的范围时，应当理解，介于该范围的上限与下限之间的每一个中间值 (除非上下文另有明确指明，否则精确到下限单位的十分之一）和所述范围内的任何其他 所述值或中间值均涵盖于本发明的组合物和方法内。这些较小范围的上限和下限可以独立 地被包括在较小的范围内，并且也涵盖于本发明组合物和方法内，除非是在所述范围内的 任何明确排除的界限。当所述范围包括界限中的一者或两者时，排除这些被包括的界限中 的任一者或两者的范围，也被包括在本发明组合物和方法中。
[0102] 某些范围在本文中通过前面带有术语"约"的数值表述。术语"约"在本文中用于 为它之后的确切数字以及接近或近似该术语之后的数字的数字提供字面支持。在确定数字 是否接近或近似明确列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其中表述它的上 下文中提供明确列举的数字的基本上等值的数字。例如，与数值相关的术语"约"是指该数 值的-10%至+10%的范围，除非该术语在上下文中另有明确定义。又如，短语"约6的pH 值"是指5. 4至6. 6的pH值，除非pH值另有明确定义。
[0103] 本文提供的标题并不是对本发明组合物和方法的各个方面或实施例的限制，这些 方面或实施例都可以通过整体参考本说明书而获得。因此，通过整体参考本说明书可更完 全地限定下文定义的术语。
[0104] 本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会认识到，在一个章节中进 行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。
[0105] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明组合物和方 法所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的 任何方法和材料也可用于实践或测试本发明组合物和方法，但是现在描述的是代表性的示 例性方法和材料。
[0106] 在本说明书中引用的所有出版物和专利以引用的方式并入本文，如同每个单独的 出版物或专利明确地并单独地指示为以引用的方式并入，并且以引用方式并入本文来公开 和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用是关于提交日前的其公开 内容，并不应视为承认本发明组合物和方法由于在先发明而无权早于此类出版物。另外，所 提供的公布日期可能与实际的公布日期不同，这可能需要独立地核实。
[0107] 根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则 单数形式"一个"、"一种"和"所述（该）"包括多个指代物。因此，例如，提及"酶"包括多个 此种酶，而提及"剂量"则包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物， 等等。
[0108] 还应当注意，权利要求书可能撰写成排除了任何任选元素。由此，该陈述旨在充当 使用与权利要求书要素的引用相关的诸如"仅有"、"只有"等等的排他性术语或使用"负性" 限制的先彳丁基础。
[0109] 当关于对象细胞、核酸、多肽/酶或载体而使用时，术语"重组"指该对象已从其天 然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然（非重组）形式的细胞中存在的基因， 或者以不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。重组核酸可与天然序列相差一个 或多个核苷酸和/或在表达载体中有效连接至异源序列，例如异源启动子、允许分泌的信 号序列等。重组多肽/酶可与天然序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包 含编码甘露聚糖酶的核酸的载体例如是重组载体。
[0110] 还应当注意，如本文所用，术语"基本上由…组成"是指这样的组成，其中该术语之 后的组分与其他已知的组分共存，所述其他已知的组分总量少于总组成的30重量％，并且 不会促进或干扰组分的作用或活性。
[0111] 还应当注意，如本文所用，术语"包含"意指包括但不限于术语"包含"之后的组分。 术语"包含"之后的组分是必要或强制性的，但包含该组分的组合物还可包含其他非强制性 或任选的组分。
[0112] 还应当注意，如本文所用，术语"由…组成"意指包括并限于术语"由…组成"之后 的组分。因此术语"由…组成"之后的组分是必要或强制性的，并且组合物中不存在其他组 分。
[0113] 对于本领域技术人员而言，阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和图示的 各个实施例中的每一个都具有分立的组分和特征，在不脱离本文所述的本发明组合物和方 法的范围或实质的前提下，这些组分和特征可容易地与其他若干实施例中任一者的特征分 离或合并。任何所列举的方法可以按列举的事件顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序实 施。
[0114] 2.宙义
[0115] "B-甘露聚糖酶"意指具有催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的 (1 - 4) - 0-D-甘露糖苷键的裂解或者水解的能力的酶多肽或多肽结构域。
[0116] 本文所用的"BliGh3"或者"BliGh3多肽"指源自地衣芽孢杆菌的属于糖基水解 酶家族5的0 -甘露聚糖酶（例如重组0 -甘露聚糖酶）（及其变体），该0 -甘露聚糖酶 当与具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他已知0 -甘露聚糖酶相比时，在纤维素酶和/ 或半纤维素酶组合物水解任选经过预处理的木质纤维素生物质底物的能力方面对该组合 物赋予出乎意料的改善。BliGh3多肽可构成纤维素酶和/或半纤维素酶混合物的实质部 分，例如高达约20重量％ (例如高达约20重量％、高达约15重量％、高达约10重量％、高 达约9重量％、高达约8重量％、高达约7重量％、高达约6重量％、高达约5重量％、高达 约4重量％、高达约3重量％、高达约2重量％、高达约1重量％ )，并在相同的条件下实现 给定木质纤维素生物质底物的相等或者更佳的水解。这容许使用较少的纤维素酶/半纤维 素酶并更有效地进行生物质水解，从而使得总体纤维素生物质转化过程在经济上更加可行 和可持续。还出乎意料地发现，本文的BliGh3多肽赋予快速的粘度降低或者液化，这在生 物质底物在高固形物水平下经酶处理时尤其显著。根据本组合物和方法的各方面，BliGh3 多肽包括那些具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，以及与SEQ ID NO:2的氨基酸序 列或者与SEQ ID NO:2的成熟序列或者与SEQ ID NO:2的长度为至少80个残基的片段具 有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、 至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一性的衍生多肽或者变体多肽，其中所述 BliGh3多肽不仅具有0 -甘露聚糖酶活性且能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚 糖的（1 - 4) - -D-甘露糖苷键的转化水解，而且比具有类似最佳pH和/或最佳温度的其 他甘露聚糖酶具有更高的甘露聚糖酶活性，并且赋予高固形物生物质底物的快速 粘度降低和液化，这种性质是在其他已知的甘露聚糖酶中未曾观察到的。
[0117]"家族5糖基水解酶"或"GH5"是指符合根据如下文献的分类的糖基水解酶家族 5的定义的多肽：Henrissat，Biochem.J.(《生物化学杂志》），280:309-316，（1991)以及 Henrissat&Cairoch，Biochem.J.(《生物化学杂志》），316:695_696，（1996) 〇
[0118] 根据本文描述的本组合物和方法的BliGh3多肽可被分离或纯化。所谓纯化或分 离意指通过将BliGh3多肽从与其天然相关的天然存在的成分中的一些或所有分离而使 BliGh3从其天然状态改变。此类分离或纯化可通过本领域公认的分离技术如离子交换色谱 法、亲和色谱法、疏水分离、渗析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀法或其他蛋白质盐沉淀法、离心、 尺寸排阻色谱法、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离来实现，以移除最终组合物中不期 望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。还可以然后将提供附加有益效果的组分添 加到含有BliGh3的组合物，例如活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或者其他 酶类或化学品。
[0119] 如本文所用，"微生物"是指细菌、真菌、病毒、原生动物以及其他微生物或微观生 物体。
[0120] 如本文所用，多肽的"衍生物"或"变体"意指通过如下方式衍生自前体多肽（例 如，天然多肽）的多肽：将一个或多个氨基酸添加到C端和N端中任一者或二者、在氨基酸 序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在多肽的任一个或两个末端或在氨 基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸、或者在氨基酸序列的一个或多个位点 插入一个或多个氨基酸。BliGh3衍生物或变体的制备可以任何方便的方式实现，例如通过 修饰编码天然多肽的DNA序列、将该DNA序列转化到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA 序列以形成衍生物/变体BliGh3。衍生物或者变体还包括经化学修饰的BliGh3多肽，例 如糖基化或者以其他方式改变BliGh3多肽的特性。本组合物和方法涵盖BliGh3的衍生物 和变体，这种衍生物和变体与多种具有类似最佳pH和/或最佳温度的其他0 -甘露聚糖酶 相比时，在相同的木质纤维素生物质底物水解条件下将会表现出改善的甘露聚糖酶活 性，所述其他0-甘露聚糖酶为例如具有SEQ ID N0:4的序列的ScoManl、具有SEQ ID N0:5 的序列的Bsp Manl或者SEQ ID N0:6的Msp Man2。在一些实施例中，这种衍生物和变体还 将赋予纤维素酶和/或半纤维素酶组合物快速的粘度降低和液化，在生物质底物经受包含 本文的B