一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]退行性骨关节病又称骨关节炎、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等，实际上其并非炎症，而是一种退行性病变，属于关节提前老化，特别是关节软骨的老化，由增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节(如颈椎、腰椎、膝关节、髋关节等)。过度负重或使用这些关节，均可促进退行性变化的发生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。
[0003]目前退行性骨关节病的主要治疗方法是减少关节的负重和过度的大幅度活动，以延缓病变的进程。例如肥胖患者应减轻体重，下肢关节病变患者可用拐杖或手杖等。理疗及适当的锻炼可保持关节的活动范围，对控制急性期症状有所帮助。对晚期病例，目前公认的消除疼痛、矫正畸形、改善功能的有效方法是在患者全身情况能耐受手术的条件下行人工关节置换术，可以大大提高患者的生活质量。
[0004]但是不管是理疗还是人工关节置换术，并不能从根本上修复损伤的关节软骨，退行性骨关节病患者将终生带病生存。体外实验显示间充质干细胞可以向软骨细胞分化，动物实验也提示间充质干细胞可以修复受损的关节软骨。有学者提出从健康成人骨髓中分离间充质干细胞并用于修复受损的关节软骨，但是抽取骨髓对人体有损伤，且抽取的骨髓量较少，有骨髓疾病时无法采集。各项研宄显示，新生儿脐带中含有大量的间充质干细胞，其生物学特性与健康成人骨髓来源的间充质干细胞相似，并且具有易于分离培养、增殖能力强、低免疫原性等优点，其已成为生物医学工程领域的“明星细胞”。脐带是胎儿娩出后的附属产物，往往作为废弃物丢掉或烧毁。采集脐带过程很简单，且采集时对胎儿及产妇没有任何损伤。基于以上优点，我们认为脐带来源的间充质干细胞可以替代骨髓来源间充质干细胞用于治疗退行性骨关节病。
【发明内容】
[0005]基于上述原因，本发明为了克服现有技术的不足，通过长期的研宄，确定了一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂及其制备方法:以健康新生儿的脐带为原料，原代分离培养并大规模扩增培养脐带间充质干细胞，利用扩增后的脐带间充质干细胞制备干细胞制剂，该制剂可直接用于临床治疗退行性骨关节病。
[0006]本发明是通过下述技术方案实现的。
[0007]一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，以健康新生儿的脐带为原料，原代分离培养并大规模扩增培养脐带间充质干细胞，扩增后脐带间充质干细胞用人血白蛋白和二甲基亚砜的复方电解质注射液重悬，反复吸吹混匀后，将细胞逐渐降低保存温度冷冻成制剂。
[0008]优选地，上述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，所述扩增后脐带间充质干细胞通过7代扩增培养后制得。
[0009]优选地，所述治疗退行性骨关节病的干细胞制剂，所述扩增后脐带间充质干细胞用PBS重悬，反复吸吹混匀，再离心；离心结束后吸弃上清液；离心后扩增后脐带间充质干细胞用含有2?5%人血白蛋白和10%二甲基亚砜的复方电解质注射液重悬，反复吸吹混匀后，将细胞冻存盒置于普通冰箱保存30?60min，继续将细胞置于超低温冰箱(_80°C )保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(_196°C )中长期保存。
[0010]一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，经过以下步骤:
[0011]采集脐带:取健康新生儿脐带，48小时内运输至实验室处理；
[0012]原代培养:将脐带灭菌消毒，去除脐静脉与脐动脉，撕取脐带华通氏胶，将华通氏胶置于离心管中；剪碎脐带华通氏胶，加入脐带间充质干细胞完全培养液，在细胞培养箱中培养；吸弃旧脐带间充质干细胞完全培养液及华通氏胶，浸洗贴壁细胞；加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2% FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为原代培养的脐带间充质干细胞(PO代)；
[0013]传代培养1:将PO代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用电动吸液器反复吸吹混匀后接种1.5?2.0X 16个细胞至底面积75cm 2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全细胞培养液至每瓶15?20ml，将细胞培养瓶置于37°C、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80%以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用10?20ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2% FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(Pl 代)；
[0014]参照上述传代培养I的方法，将脐带间充质干细胞传代至P3代，然后冻存P3代细胞建立脐带间充质干细胞种子库；
[0015]冻存细胞1:将P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，反复吸吹混匀后分装；将细胞置于常温(20°C )放置的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(_80°C )中保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(_196°C )中长期保存；
[0016]复苏细胞1:从液氮罐(_196°C )中取出细胞，细胞在37°C水浴解冻；解冻完成后，将细胞冻存液转移至离心管内，加入20?30ml PBS重悬细胞，用反复吸吹混匀；离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P3代)；
[0017]传代培养2:将复苏后的P3代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用反复吸吹混匀后接种4.5?6.0X 16个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶45?60ml，将细胞培养瓶置于37°C、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80%以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用20?30ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2% FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P4代)；
[0018]参照上述传代培养2的方法，将脐带间充质干细胞传代至P6代，然后冻存P6代细胞已建立脐带间充质干细胞半成品库；
[0019]冻存细胞2:将P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞冻存保护液重悬，用反复吸吹混匀后分装；将细胞置于常温(20°C )的程序降温盒中，再将程序降温盒直接置于超低温冰箱(_80°C )中保存过夜，最后将细胞置于液氮罐(_196°C )中长期保存；
[0020]复苏细胞2:从液氮罐(_196°C )中取出细胞，细胞置于37°C水浴解冻；解冻完成后，将细胞冻存液转移至离心管内，加入30?40ml PBS，反复吸吹混匀；离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为复苏后的脐带间充质干细胞(P6代)；
[0021]传代培养3:将复苏后的P6代脐带间充质干细胞用适量脐带间充质干细胞完全培养液重悬，用反复吸吹混匀后接种2.7?3.6 X 17个细胞至底面积1272cm 2的细胞培养瓶，补充脐带间充质干细胞完全培养液至每瓶250?360ml，将细胞培养瓶置于37°C、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中继续培养；脐带间充质干细胞贴满细胞培养瓶底面80%以上时，吸弃细胞培养瓶内旧脐带间充质干细胞完全培养液，用180?200ml PBS浸洗贴壁细胞，吸弃洗涤液，加入Trypsin-EDTA消化贴壁细胞；加入含有2% FBS的PBS重悬细胞，反复吸吹混匀后离心；离心结束后吸弃上清液，沉淀细胞即为传代培养的脐带间充质干细胞(P7 代)；
[0022]制剂并冻存:将P7代脐带间充质干细胞再用30?40ml PBS重悬，再用电动吸液器反复吸吹混匀；再离心，1000?1500rpm、5min、RT ;离心结束后吸弃上清液，继续用30?40ml PBS重悬，继续用电动吸液器反复吸吹混匀；继续离心，1000?1500rpm、5min、RT ?’离心结束后吸弃上清液，按以下方法制备治疗退行性骨关节病的干细胞制剂:将P7代脐带间充质干细胞用助悬液重悬，使其细胞终密度为I?4X 17个/ml，用电动吸液器反复吸吹混匀后分装4ml细胞悬液至容积为5ml的细胞冻存管中；将细胞冻存管置于细胞冻存盒内，再将细胞冻存盒置于普通冰箱(4°C )保存30?60min，继续将细胞冻存夹置于超低温冰箱(_80°C)保存过夜，最后将细胞冻存夹置于液氮罐(_196°C)中细胞冻存架上指定的细胞冻存位置长期保存。
[0023]从液氮罐(_196°C )中细胞冻存架上制定的细胞冻存位置取出细胞冻存盒，从细胞冻存盒中取出细胞冻存管，夹住细胞冻存管头部并将细胞冻存管在37°C水浴中快速晃动；解冻完成后即可直接关节腔注射用于治疗退行性骨关节病。
[0024]优选地，一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述原代培养中适合接种的华通氏胶组织块数为48?60块/75cm2。
[0025]优选地，所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述脐带间充质干细胞完全培养液为DMEM/F12(1: I)与FBS混合液，二者体积比为9: 1，配制时分别取9份DMEM/F12 (I: I)与I份FBS于室温下直接混合，配制完成后冷藏于普通冰箱(4°C )中。需要使用时从普通冰箱(4°C )中取出并恢复至常温(20°C )。
[0026]优选地，根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，冻存细胞步骤中所述脐带间充质干细胞冻存保护液为DMSO与FBS混合液，二者的体积比为1: 9，配制时分别取I份DMSO缓缓滴入9份预先冷藏至4°C的FBS中，用电动吸液器吸吹混匀，配制完成后冷藏于普通冰箱(4°C )。需要使用时从普通冰箱(4°C )中取出直接使用。
[0027]优选地，根据权利要求4所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述PO代传代至P3代采用的是接种1.8 X 16个细胞至底面积75cm2的细胞培养瓶；所述P4代传代至P6代采用接种5.4 X 16个细胞至底面积225cm2的细胞培养瓶；所述P6代传代至P7代采用的是接种3.0X 16个细胞至底面积1272cm2的细胞培养瓶。
[0028]具体的，所述的一种治疗退行性骨关节病的干细胞制剂的制备方法，所述P7代细胞制剂的助悬液为含有适量I?10