源于华西雨蛙的免疫调节肽及其基因在皮肤光损伤防护上的应用的制作方法

文档序号：20989718发布日期：2020-06-05 21:34阅读：515来源：国知局

本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，尤其是涉及源于华西雨蛙的免疫调节肽及其基因，本发明还涉及该肽在制备抗炎药物等方面的应用。

背景技术：

皮肤作为人体最大的器官，是机体防御体系的第一道屏障，直接暴露于多种外界环境因素之中，如机械损伤、病原微生物入侵以及紫外线辐射等。长时间大剂量的紫外辐射会对皮肤造成一系列损伤，包括引起炎症反应、促进表皮细胞凋亡、引起色素沉淀、光老化、破坏皮肤屏障以及诱发皮肤癌等等。此外，uvb辐射还会导致皮肤出现典型的急性炎症反应，包括表皮细胞内一系列促炎细胞因子如tnf-、il-6以及il-1的合成和分泌增加，这主要是由于辐射导致表皮角化细胞中活性氧自由基(ros)的产生和dna损伤的形成进而造成与炎症相关nf-b信号通路的激活。

为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素c、维生素e、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；以及从高原两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种基因编码的小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力。

华西雨蛙为蛙科雨蛙属的两栖动物，是中国西南高原地区的特有物种，目前关于华西雨蛙来源的皮肤光损伤防护抗炎多肽的研究还没有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供两种源于华西雨蛙的抗炎免疫调节肽及其基因与应用。

本发明采取以下技术方案来实现这些内容：

一种源于华西雨蛙的免疫调节肽的前体基因，免疫调节肽的前体基因由609个核苷酸组成，其5’端至3’端的核苷酸序列为sedidno:1所示。

其5’端至3’端的核苷酸序列(sedidno:1)：

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一种1所述前体所得源于华西雨蛙的免疫调节肽，源于华西雨蛙的免疫调节肽分别为华西雨蛙免疫调节肽fw-1和华西雨蛙免疫调节肽fw-2；其,华西雨蛙免疫调节肽fw-1的编码基因的多拷贝点分别位于sedidno:1的第136-150,214-228,253-267,331-345,448-462位核苷酸；华西雨蛙免疫调节肽fw-2的编码基因的多拷贝点分别位于sedidno:1的第176-189,292-306，370-384，409-423位核苷酸。

所述华西雨蛙免疫调节肽fw-1分子量为673.8da，等电点5.52，由5个氨基酸残基组成，全序列的一级结构为：phe¹trp²pro³leu⁴ile⁵，其中c末端酰胺化修饰；

所述华西雨蛙免疫调节肽fw-2分子量为691.9da，等电点5.52，由5个氨基酸残基组成，全序列的一级结构为：phe¹trp²pro³met⁴ile⁵，其中c末端酰胺化修饰。

一种所述源于华西雨蛙的免疫调节肽的应用，所述华西雨蛙免疫调节肽fw-1和/或华西雨蛙免疫调节肽fw-2在抗紫外辐射引起的皮肤炎症反应中的应用。

所述调节肽在制备抗紫外辐射引起的皮肤炎症中免疫调节功能的药物、保健品或化妆品中的应用。

一种重组蛋白，含至少一种所述华西雨蛙免疫调节肽。

一种重组表达载体，含所述的重组表达载体。

一种重组细胞，含所述的重组表达载体。

一种组合药物，为含至少一种所述华西雨蛙免疫调节肽、重组蛋白、重组表达载体、重组细胞中一种或几种。

本发明通过uvb照射小鼠皮肤引起急性炎症反应的动物模型实验检测抗炎免疫调节肽fw-1，fw-2抗炎活性，并通过免疫调节肽fw-1，fw-2分别与动物红细胞悬液混合，检测溶血活性。

本发明的优点是：

本发明中的华西雨蛙免疫调节肽fw-1及fw-2具有分子量小、人工合成简单的特点，其所述华西雨蛙免疫调节肽具有抗紫外辐射引起的皮肤炎症反应的免疫调节功能。

蛙类皮肤提取的小分子抗炎多肽具有极高的抗炎活性和极低的溶血性，且有热稳定性强、水溶性好、无毒副作用，在人体内可被降解消化的优势，在制备抗炎药物、保健品、化妆品具有很好的应用前景。

附图说明

图1是华西雨蛙免疫调节肽fw-1及fw-2抗紫外引起的表皮增厚的活性图；

图2是华西雨蛙免疫调节肽fw-1及fw-2抗紫外引起的炎性细胞浸润活性图。

具体实施方式

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明首先通过基因克隆得到免疫调节肽fw-1与fw-2的编码基因，再通过化学合成的方法得到两种免疫调节肽的一级结构序列，两种免疫调节肽均含5个氨基酸残基。本发明中的华西雨蛙免疫调节肽fw1和fw2具有分子量小、人工合成简单、抗炎症作用高效、溶血活性低的优点，可以用于制备抗炎药物、保健品、化妆品，具有广泛的应用前景。

实施例1华西雨蛙免疫调节肽(fw-1/2)前体基因克隆：

1)华西雨蛙皮肤总rna提取：

①取200mg华西雨蛙背部皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到ep管中，加入1ml总rna提取缓冲液(trizol，美国life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(v/v)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为华西雨蛙皮肤总rna。

2)华西雨蛙皮肤cdna二链合成：采用clontech公司in-fusionsmarter^tmdirectionalcdnalibraryconstructionkit合成。

(1)cdna第一链合成(mrna反转录)：

①rnase-free的pcr管中加入1μl华西雨蛙皮肤总rna、1μl3’端一链合成引物(3’in-fusionsmartercdsprimer)(5’-cggggtacgatgagacaccattttttttttttttttttttvn-3’)和2.5μlrnase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂(均为clontech公司in-fusionsmarter^tmdirectionalcdnalibraryconstructionkit建库试剂盒中配备)，2.0μl5×第一链缓冲液、0.25μl100mmdtt、1.0μl10mmdntpmix、1.0μlsmartervoligonucleotide、0.25μlrnaseinhibitor和1.0μlsmartscribereversetranscriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cdna第一链备用。

(2)采用长末端聚合酶链式反应(ld-pcr)方法扩增第二链(所用试剂均为clontech公司in-fusionsmarter^tmdirectionalcdnalibraryconstructionkit建库试剂盒中配备)

①将2μlcdna第一链(mrna反转录)、80μl去离子水、10μl10×advantage2pcr缓冲液、2μl50×dntp混合物、2μl5’pcr引物、2μl3’in-fusionsmarterpcr引物(5’-cggggtacgatgagacacca-3’)以及2μl50×advantage2polymerasemix在95℃预热的pcr管中进行混合。

②在pcr仪中按以下程序扩增：

95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cdna双链－80℃保存。

(3)华西雨蛙免疫调节肽fw-1/fw-2编码基因克隆：

根据雨蛙科已鉴定的活性多肽cdna序列信号肽前约50个核苷酸序列的保守区域，设计上游特异性正向引物，其序列为5’-gcactcactcacccaaacat-3’,反向引物为clontech公司in-fusionsmarter^tmdirectionalcdnalibraryconstructionkit中的3’-pcr引物，其序列为5’-cggggtacgatgagacaccat-3’。pcr反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pmd19-t载体(takara,大连)，转化dh5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用m13引物pcr检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用appliedbiosystemsdnasequencer,modelabiprism377进行核苷酸测序。

测定结果：

编码华西雨蛙免疫调节肽(fw-1/2)前体的基因自5’端至3’端序列为：