一种具有生物活性的COX52‑69多肽的固相合成方法及其用途与流程

本发明提供了一种采用化学合成的方法-fmoc法合成cox52-69多肽的工艺，采用该方法所合成的cox52-69多肽在动物体内体外实验，证明其具有生物活性；并且本发明中还提供了所述cox52-69多肽的用途，属于生物医药技术领域。

背景技术：

短肽cox52-69是一条含有18个氨基酸的多肽，最初是从猪的小肠中分离纯化出来的，经氨基酸序列比对后发现其与细胞色素氧化酶ⅷ的第52至69完全重叠，所以命名cox52-69。其序列为llpagwvlshldsykkre。用生化分离纯化得到的cox52-69多肽做功能实验发现该多肽能够抑制葡萄糖引起的胰岛素的分泌，该发现目前已于2013年10月11日申请中国发明专利，申请号为201310471571.9。在该专利申请中通过从生物组织(猪肠道)中分离纯化获得cox52-69多肽，但是从生物组织中分离纯化获得cox52-69多肽是一个高成本的过程。为此需要寻求一种非生化分离的方法以获取有活性的该肽，并能够提高了产量和降低了成本。然而在本领域中，虽然通过化学合成或生物工程的方法获得一个多肽是件容易的事，但是这些获得的多肽通常是没有生物活性的。

技术实现要素：

本发明解决了现有技术中的不足，提供了一种具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法，并且利用化学合成的cox52-69多肽在动物体内体外实验，均发现化学合成的cox52-69多肽有抑制葡萄糖引起的胰岛素分泌的功能和减轻体重的作用，即具有生物活性。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法，该多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示：llpagwvlshldsykkre，所述固相合成方法包括以下步骤：

(1)、缩合反应：使用dmf预溶胀树脂，滤去溶剂备用；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后脱去树脂上的的fmoc保护基团，抽干，继续采用dmf清洗后抽干，并检测；

称取第一个fmoc-氨基酸fmoc-glu(tbu)-oh，同时称取hobt备用，将二者同时加入反应柱中，并且溶于dcm中，然后加入dic并搅拌；称取dmap投入反应柱中；氨基酸与反应试剂一同反应，反应完毕后抽干并用dmf清洗；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后，脱去树脂上的的fmoc保护基团，抽干，继续采用dmf清洗后抽干，并检测；

接下来的按照cox52-69多肽的顺序重复添加肽链上的下一氨基酸，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检测通过；全部完成后，使用无水甲醇清洗并使用抽滤瓶将其抽干；

(2)、肽链的切割：在抽干的合成肽树脂中加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，收集滤液，滤液经乙醚萃取后放置于干燥瓶内进行干燥，直至其成为白色粉末，即制得多肽粗品；

(3)、粗肽的检测和纯化：利用高效液相色谱检测合成的多肽粗品，并分析合成产物中多肽的纯度；

(4)、肽的质谱鉴定：用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否是目标产物，最后将收集的样品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入样品杯中，冷冻过夜，次日用真空干燥剂冷冻干燥，最后获得的白色粉末状物质即为纯品cox52-69多肽。

步骤(1)中所述脱保护及缩合反应的检测方法如下：检测时分别取三滴5％茚三酮无水乙醇溶液和三滴80％苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒充分混匀，105℃加热5min，观察颜色变化，若变蓝色或紫色，则说明游离氨基存在，脱保护完全；若为亮黄色或无色则表示缩合完全，能够继续进行下一个缩合反应。

步骤(1)中在合成每一个氨基酸时，反应过程中维持温度在25℃～28℃。

步骤(2)中萃取的步骤为：在滤液中按1：10的体积比加入事先4℃下预冷的乙醚，进行萃取，再以每分钟3000转的速度离心2分钟，并使用乙醚清洗离心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分钟离心。

步骤(3)中高效液相色谱检测的方法为：取多肽粗品置于ep管，加入三氟乙酸和水，于超声振荡机中震荡使多肽粗品溶解，用c18分析柱进行hplc，流动相：a相：乙腈，0.1％tfa；b相：水，0.1％tfa，洗脱梯度：b相的浓度从90％到0，洗脱速度1ml/min，洗脱时间25min，检测波长220nm。

步骤(4)中质谱分析采用esi正离子模式，离子电压为8000v，碰撞气体为n2，脱溶剂气温度350e，注射泵进样速度为10ul/min。

本发明同时还提供了上述利用化学合成的方法-fmoc法所合成cox52-69多肽得新的用途，用于制备抵抗高胰岛素血症和减轻体重的药物中。

本发明中公开了可以用非生化分离的方法获得正确的有生物活性的cox52-69多肽，简化了获得该多肽的生化繁琐程序，而且还能够根据目的需要对序列中的氨基酸或化学键进行目的性的修饰。经过以上合成制备及修饰或优化后，该多肽开发成药物的成本就大大降低，效果也会更高。为后续药物开发提供了简洁可行的方法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：1、本领域中通过化学合成或生物工程的方法获得的多肽通常是没有生物活性的，然而采用本申请所提供的固相合成方法，能够制备出具有生物活性的cox52-69多肽。2、本发明中通过人工合成具有生物活性的cox52-69多肽，大大的简化了其制备步骤，降低了生产成本，能够实现工业化大规模制备。3、本发明中还提供了该多肽的新的用途，即能够用于制备抵抗高胰岛素血症和减轻体重的药物中。4、由于本申请中为采用人工合成的方法所制备的，因此能够极方便的根据目的需要对序列中的氨基酸或化学键进行目的性的修饰，以做进一步的研究开发。

附图说明

图1为本实施例中所制备的cox52-69多肽的hplc色谱图；

图2为本实施例中所制备的cox52-69多肽的质谱分析图；

图3为本发明实施例中动物大鼠腹腔注射cox52-69后引起胰岛素浓度的变化图；

图4为实施例中实验组和对照组的体重变化对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

本实施例中所提供的具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法中所采用的试剂如下：

1.实用王树脂(wangresin，0.47mmol/g)购自天津南开和成科技有限公司；

2.fmoc-tyr(tbu)-oh等其他使用fmoc保护的氨基酸均购自上海吉尔生化；

3.缩合试剂n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)购自上海吉尔生化(分析纯)；

4.1-羟基-苯丙-三氮唑(hobt)购自上海吉尔生化(分析纯)；

5.二异丙基乙胺(diea)购自上海吉尔生化(分析纯)；

6.二甲氨基吡啶(dmap)购自苏州昊帆生物科技公司(分析纯)；

7.二异丙基碳二亚胺(dic)购自上海吉尔生化(分析纯)；

9.二环己基碳二亚胺(dcc)购自上海吉尔生化(分析纯)；

10.2，6-二氯苯甲酰氯(dcb)购自上海吉尔生化(分析纯)；

11.二甲基甲酰胺(dmf)购自上海吉尔生化(分析纯)；

12.二氯甲烷(dcm)购自上海吉尔生化(分析纯)；

13.哌啶(pip)购自上海吉尔生化(分析纯)；

14.甲醇(meoh)购自上海吉尔生化(分析纯)；

15.四氢呋喃(thf)购自上海吉尔生化(分析纯)；

16.吡啶(py)购自上海吉尔生化(分析纯)；

17.三氟乙酸(tfa)

18.乙腈。

实验试剂的配制如下：

脱保护试剂：哌啶：dmf溶液＝1:5(体积比)

切割溶液：tfa：edt：苯甲硫醚：苯酚：水＝86:5:5:2:2(体积比)

肽沉淀溶液：乙醚

游离氨基检测试剂kaiser的配制：

溶液a：6g水合茚三酮溶于100ml无水乙醇中，稍加热或搅拌促溶

溶液b：8g熔融苯酚溶解在10ml无水乙醇中

溶液c：2％0.001m的kcn的吡啶溶液

具体的合成包括以下步骤：

缩合反应

(1)溶胀树脂：选取取代率为0.47mmol/g的wang树脂，并计算使用量。计划合成10mg多肽，分子量为2112，并且按照5％的收率来算，应投入10/5％/2112/0.47＝0.2g，使用dmf预溶胀树脂30分钟，并且滤去溶剂备用；

(2)脱保护反应：向反应柱中加入脱保护试剂4ml，反应15分钟，脱去树脂上的的fmoc保护基团，抽干，dmf洗3遍，抽干，并检测；

(3)连接反应：称取第一个fmoc-氨基酸fmoc-glu(tbu)-oh，分子量是425.48，按照2倍投料量计算，0.2*0.47*425.48*2＝79.99mg，称取0.08g谷氨酸备用，同时计算hobt(分子量135)用量为0.2*0.47*135*2＝25.38mg，称取0.025ghobt备用，将二者同时加入反应柱中，并且溶于dcm中，然后加入dic，搅拌10分钟；第一个氨基酸与树脂的链接需要dmap为之提供弱碱环境，其分子量为122，计算其所用量为0.2*0.47*122*2＝22.94mg，称取0.023gdmap投入反应柱中。氨基酸与反应试剂一同反应3h，并且抽干，用dmf洗3遍；

(4)脱保护反应：向反应柱中加入脱保护试剂4ml，反应15分钟，脱去树脂上的的fmoc保护基团，抽干，dmf洗3遍，抽干，并检测；

(5)反检，用kaiser试剂检测；

(6)接下来的每一步均为重复添加肽链上的下一氨基酸，按照2、3、4、5的顺序依次重复，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检验通过，因为随着肽链的延长，氨基酸的挂靠连接就愈加困难，所需的反应条件也愈发苛刻，每一步反应过程中尽量做到维持温度在25℃-28℃之间。全部完成后，使用无水甲醇清洗两次，并使用抽滤瓶将其抽干；

脱保护及缩合反应的检测

利用游离的氨基酸除个别氨基酸(如酪氨酸与茚三酮反应不显色或显色极浅)和茚三酮反应显色的原理，在每步脱保护和缩合反应完全后，从反应柱中取少许树脂颗粒检测反应是否完全。检测时分别取三滴5％茚三酮无水乙醇溶液和三滴80％苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒充分混匀，105℃加热5min，观察颜色变化，若变蓝色或紫色，则说明游离氨基存在，脱保护完全；若为亮黄色或无色，则缩合完全，可继续进行下一个缩合反应。

肽链的切割

称取抽干的合成的肽树脂，采用tis裂解法，按1g：8ml比例加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解3h，为取下含有多肽的酸溶液，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，收集滤液。滤液按1ml：10ml的比例加入事先4℃预冷的乙醚，对多肽溶液进行萃取，以每分钟3000转的速度离心2分钟，并使用乙醚清洗离心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分钟离心，将萃取好的多肽溶液放置于干燥瓶内进行干燥，直至其成为白色粉末，即我们所需要的多肽链粗品。

粗肽的检测及纯化

利用高效液相色谱(hplc)检测合成的多肽，并分析合成产物中多肽的纯度，取少量多肽样品置于1.5mlep管，加入三氟乙酸和水，于超声振荡机中震荡使多肽样品溶解，用c18分析柱进行hplc。流动相：a相：乙腈，0.1％tfa；b相：水，0.1％tfa，洗脱梯度：b的浓度从90％到0，洗脱速度是1ml/min，洗脱时间是25min，检测波长是220nm。检测结果如图1所示，从图1中可以看出合成的多肽在将近9分钟时出峰，而且只出现一个单峰，纯度较高，经峰面积归一法得到多肽的纯度达到了98.37％。

肽的质谱鉴定

质谱分析采用esi正离子模式，离子电压为8000v，碰撞气体为n2，脱溶剂气温度350e，注射泵进样速度为10ul/min，质谱鉴定能够很准确的鉴定出合成多肽的分子量。最后将收集的样品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入样品杯中，-80℃冷冻过夜，次日用真空干燥剂冷冻干燥，最后获得的白色粉末状物质即为纯品cox52-69。质谱分析的结果如图2所示，从图中可以看出合成的多肽的分子量为2113.23，这与所计算的多肽分子量的理论值相吻合，即为本申请中所要的cox52-69多肽。

多肽生物活性检测

将本实施例中所制备出的cox52-69多肽对动物大鼠进行腹腔注射，并观察实验组和空白组的胰岛素浓度变化状况，结果如图3所示，从图3中可以看出，未注射多肽时，实验组和空白组的胰岛素的浓度并无差异，但在30min时，也就是注射完多肽30min后(2.5mg/kg))，即葡萄糖(2g/kg)灌胃结束，实验组的胰岛素浓度低于空白组(注射同体积的不含多肽的溶剂)具有差异性，在120min，也就是灌完胃90min后，实验组的胰岛素浓度仍然低于空白组，具有差异性。

然后选择同窝中相对肥胖的小鼠分为实验组和对照组。两组的初始体重没有差异。实验组(cox52-69)腹腔注射多肽cox52-69(2.5mg/kg)，对照组(ns)注射同体积的溶剂。实验结果如图4所示，结果显示20天后实验组较对照组有体重减轻(p<0.05)。

<110>：中南民族大学

<120>：一种具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法及其用途

<160>：1

<210>：1

<211>：18

<212>：prt

<213>：家猪(susscrofadomestica）

<400>：1

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