本发明涉及一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术：
维生素b2，又名核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用）。当缺乏维生素b2时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等。维生素b2是水溶性维生素，容易消化和吸收，不能在体内蓄积，因此只有通过日常膳食摄取维生素b2，维生素b2广泛存在于酵母、肝、肾、蛋、奶、大豆等中。儿童生长发育期、妇女妊娠哺乳期、创伤期由于机体需求量大，日常饮食摄入可能无法满足需要，因此需要补充维生素b2。
中国居民膳食维生素b2推荐摄入量男士1.5mg/天，女士1.2mg/天，妊娠期间需要1.6mg/天，哺乳6个月内要摄取1.8mg/天，之后的6个月为1.7mg/天。食品营养强化剂使用卫生标准gb14880-94规定了维生素b2的用量，维生素b2强化婴儿食品配方中需要8～14mg/kg，妊娠食品配方4～22mg/kg。
目前维生素b2含量分析方法有微生物法、分光光度法、色谱法。色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)、气质联用(gc-ms)、液质联用(lc-ms)、超临界流体色谱(sfc)、毛细管电泳(ce)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的维生素b2检测方法具有重要意义。酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4，由该细胞株制备的抗体对维生素b2具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立维生素b2的免疫学检测方法。
本发明的技术方案：一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmccno.13094。
维生素b2单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.13094的维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4分泌产生。
所述维生素b2单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中维生素b2的分析检测。
本发明提供的维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4的制备基本步骤为：
1）完全抗原的合成：
称取8.42mgvb2（维生素b2）于1ml无水dmf中，加入18.15mgcdi（羰基二咪唑），40℃水浴避光搅拌，活化1h；另取5mgbsa溶解于2ml、0.05m、ph9.6的cb溶液中，将上述活化后的vb2溶液缓慢逐滴加入bsa溶液中，室温搅拌反应过夜，即得vb2完全抗原混合液，4℃透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
2）小鼠的免疫：维生素b2完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用维生素b2完全抗原（25μg/只，不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测血清效价和抑制；
3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行3次亚克隆，最终筛选获得维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4；
4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株gz-4分泌的单克隆抗体，对维生素b2具有较好的特异性和检测灵敏度（ic50值为11ng/ml），可以用于对牛奶、维生素饮料、婴幼儿食品中维生素b2的检测，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株单克隆细胞株gz-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.13094，保藏日期为2016年10月31日。
附图说明
图1gz-4所分泌单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将维生素b2完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了对维生素b2有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1杂交瘤细胞株gz-4的制备
（1）完全抗原的合成：称取8.42mgvb2（维生素b2）于1ml无水dmf中，加入18.15mgcdi（羰基二咪唑），40℃水浴避光搅拌，活化1h；另取5mgbsa溶解于2ml、0.05m、ph9.6的cb溶液中，将上述活化后的vb2溶液缓慢逐滴加入bsa溶液中，室温搅拌反应过夜，即得vb2完全抗原混合液，4℃透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
（2）小鼠免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取维生素b2完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第1次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第2次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第3次免疫后7天采血，使用ic-elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第5次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
（3）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞3次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集sp2/0细胞：融合前7～10天，将sp2/0瘤细胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培养基在5%co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1～4*107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1ml的peg4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mlrpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mlrpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5%co2培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用维生素b2为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对维生素b2标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复3次，获得细胞株gz-4。
（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被：将包被原vb2-ova用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从1µg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应1h；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μl2m的h2so4终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。
用ic-elisa测定单克隆抗体维生素b2的ic50为：11ng/ml，说明对维生素b2有很好的灵敏度，可用于维生素b2免疫分析检测。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐温20的pbs；
tmb显色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1︰5混合即为tmb显色液，现用现混。