本发明涉及一株多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12-1及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术：
多效唑作为一种抑制类的植物生长调节剂，具有延缓植物生长、抑制茎杆伸长、缩短节间、促进花芽分化、增加植物抗逆性能、提高作物产量等功能，广泛应用于水稻、麦类、花生、果树、烟草、油菜、大豆等农作物生产。多效唑在土壤中易被吸收，残留时间长，可能对非目标物产生危害，许多欧盟国家已经禁用，很多国家对多效唑也作出了严格限量，我国在农产品上对多效唑的最严限量≤0.2mg/kg。
为了有效监督监测食品中使用多效唑的情况，需要寻找一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，灵敏度低，加上食品中干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的多效唑检测方法具有重要意义。酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对多效唑具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立多效唑的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmccno.13082。
多效唑单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.13082的多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12-1分泌产生。
所述多效唑单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中多效唑残留的分析检测。
本发明提供的多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12-1的制备基本步骤为：
1）半抗原的合成：
合成路线如下：
称取化合物ⅰ多效唑5g（17.06mmol）和4-溴丁酸苄酯13.16g（51.19mmol）溶解于二甲亚砜50ml中，加入氢氧化钾1.05g（18.77mmol），在90℃下搅拌过夜，然后加水30ml，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。粗品通过制备型-hplc纯化，得到化合物ⅱ800mg；称取化合物ⅱ600mg（1.25mmol）溶解在四氢呋喃3ml和水2ml混合溶液中，加入氢氧化锂131.5mg（3.13mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型hplc纯化粗产物，得到半抗原pbba200mg；
2）完全抗原pbba-klh的制备：称取pbba4.3mg，二环己基碳二亚胺3mg，n-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解(称为a液)，室温搅拌反应4-5h。取匙孔血蓝蛋白klh1.47ml(6.8mg/ml)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液），在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物pbba-klh混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
3）小鼠的免疫：pbba-klh完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用pbba-klh完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测血清效价和抑制；
4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12-1；
5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。
取高效价低ic50小鼠的脾细胞，通过peg方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株cs12-1分泌的单克隆抗体，对多效唑具有较好的特异性和检测灵敏度（ic50值为5ng/ml），可实现对水、果蔬、谷物中多效唑残留量的检测，为食品中多效唑残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株多效唑单克隆抗体杂交瘤细胞株cs12-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，分类命名为单克隆细胞株，保藏编号为cgmccno.13082。
附图说明
图1cs12-1单克隆抗体对多效唑的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将多效唑完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了对多效唑有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1杂交瘤细胞株cs12-1的制备
（1）半抗原的合成：称取多效唑5g（17.06mmol）和4-溴丁酸苄酯13.16g（51.19mmol），溶解于二甲亚砜50ml中，加入氢氧化钾1.05g（18.77mmol），在90℃下搅拌过夜，然后加水30ml，用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。粗品通过制备型-hplc纯化，得到化合物a800mg；称取化合物a600mg（1.25mmol）溶解在四氢呋喃3ml和水2ml混合溶液中，加入氢氧化锂131.5mg（3.13mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型hplc纯化粗产物，得到半抗原pbba200mg。
（2）完全抗原的合成：称取pbba4.3mg，二环己基碳二亚胺3mg，n-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解(称为a液)，室温搅拌反应4-5h。取匙孔血蓝蛋白klh1.47ml(6.8mg/ml)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液），在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物pbba-klh混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取多效唑完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培养基在5%co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到（1~4）×107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1ml的peg1500由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mlrpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mlrpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5%co2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用多效唑为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对多效唑标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株cs12-1。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被：将包被原pbba-ova用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从1µg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h；
pbba-bsa制备如下：
a、称取步骤（1）制备的pbba2.5mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐3.3mg，n-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺和100μl超纯水混合液溶解，称为a液，室温搅拌反应4-6h；称取10mg鸡卵清白蛋白ova，pbba与ova摩尔比为30︰1，溶解于4ml硼酸缓冲溶液中，称为b液；在室温条件下逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物pbba-ova混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物pbba-ova混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得包被原pbba-ova；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。
用ic-elisa测定单克隆抗体多效唑的ic50为5ng/ml，说明对多效唑有很好的灵敏度，可用于多效唑免疫分析检测。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐温20的pbs；
tmb显色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1︰5混合即为tmb显色液，现用现混。