制备记忆性γδT细胞的方法及其应用与流程

本发明属于体外细胞培养领域，具体是一种简单高效制备记忆性γδt细胞的方法。

背景技术：

t淋巴细胞根据表达t细胞抗原受体（tcellreceptor,tcr）的不同分为两类：tcrαβt细胞和tcrγδt细胞，简称为αβt细胞和γδt细胞。其中γδt细胞是介于天然免疫和获得性免疫之间的特殊免疫类型的细胞，具有抗原特异性识别功能而无mhc限制性。大多数为cd4和cd8双阴性分子。γδt细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过t细胞总数的5%。当机体受到病毒或者肿瘤细胞的侵袭时，γδt细胞起到第一道防线作业而进行免疫监视。但是由于γδt细胞在外周血和肿瘤组织中含量和杀伤特异性并不高的原因，因此我们要想获得大量高效的对肿瘤有特异记忆性的γδt细胞是本发明阐述的关键。经广泛查阅国内外专利文献，迄今为止，均未见有此发明或报道。因此，发明一种简单，高效的体外制备记忆性的γδt细胞对人类抗感染和抗肿瘤的作业非常重要，对于攻克解决恶性肿瘤疾病也具有十分重要的价值。

技术实现要素：

本发明的目的是为提供一种简单实用，高效的体外培养记忆性γδt细胞的制备方法，克服常规制备的γδt细胞的记忆特异性不高的限制。进一步明确记忆性γδt细胞在生物学的特性提供研究平台。

本发明所采用的技术方案是：一种制备记忆性γδt细胞的方法，本发明通过如下步骤实现：

（1）制备外周血单个核细胞：采取健康志愿者的外周血，肝素抗凝，应用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离得到单个核细胞，用gt-t551培养基或rpmi1640培养基重悬细胞。

（2）单个核细胞分组：将所获得的单个核细胞进计数并分为两组，分别为常规对照组和记忆实验组。对照组和实验组均加入磷酸抗原刺激剂20ng/ml和rhil-2细胞因子1000iu/ml来诱导成为γδt细胞，此外实验室还加上一定量效靶比为10：1的肿瘤细胞为记忆诱导剂。

（3）记忆性γδt细胞诱导：步骤使用悬浮肿瘤细胞k562，预先对k562进行cfse染色，染色条件控制在1－2x106/ml,37⁰c，30min，然后用pbs洗涤2次，1000rpm离心5ming，最后用gt-t551培养基重悬细胞；实验组的pbmc计算总数，按照e:t为10：1把需要肿瘤细胞的数量添加到实验组内。

（4）记忆性γδt细胞表型检测：收集细胞于第0天（pbmc）,第7天和第14天进行表型检测，检测指标有cd3,vγ9，cd4,cd8,cd27，cd45ro。并同时对cfse进行荧光检测。

（5）记忆性γδt细胞增值数量检测：收集第0天，第3天，第6天，第8天，第10天，第13天和第14天细胞进行细胞计数，并统计出细胞增长倍数。

（6）记忆性γδt细胞杀伤实验检测：培养至第10天开始，收集细胞检测细胞的杀伤实验的杀伤效率，取对数生长期的k562细胞，用calcein－am对细胞染色后，调整细胞弄为2x10⁵，1x10⁵，5x10⁴，铺板于24孔板中，效应细胞为1x10⁶，最终使得效靶比为5：1，10：1和20:1,各孔分别设置3个复孔，于37度培养箱共孵育24小时后，收集细胞上流式检测细胞的杀伤效率。

（7）记忆性γδt细胞的胞内细胞因子检测：培养至第13天，取细胞进行细胞内因子ifn-γ检测，观察常规的γδt和记忆性的γδt的胞内ifn-γ的分泌量。

附图说明

图1是常规对照组与记忆性实验组的细胞增殖倍数比较示意图；

图2是常规对照组与记忆性实验组的cfse荧光检测比较示意图；

图3是常规对照组与记忆性实验组的记忆标记cd45ro的流式结果图比较示意图；

图4是常规对照组与记忆性实验组的细胞杀伤实验的结果比较示意图。

具体实施方式

下面用实施例具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1

本实施例1是用外周血的提取pbmc细胞并进行分组，包括以下步骤：

1.采取健康志愿者外周血，用肝素纳抗凝，应用人淋巴细胞分离液ficoll进行密度梯度分离获得单个核细胞。具体步骤：510g/分，离心7分钟，降速度为2，离心完毕后，吸取上层血浆层，56度灭活30分钟后510g/分，离心7分钟，取上层血浆层转到干净离心管备用。沉淀的血细胞用生理盐水稀释后，将人淋巴细胞分离液与稀释血液按照1：2的比例加入离心管中，680g/分,离心20分钟，升降速都调为1，离心完毕后，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，510g/分，离心7分钟。最后沉淀用gt-t551重悬沉淀，即可得到pbmc细胞。

2.将上述的pbmc细胞，取少量进行细胞计数，并用gt-t551培养基调整浓度在（1－2）x10⁶/ml，平均分为2组，一组为常规对照组，二组为记忆实验组；两组均加入磷酸抗原激活剂和gd1因子和rhil-2因子，于37度培养箱培养；此外记忆实验组还要加入效靶比为10：1的数量的经过cfse标记的肿瘤细胞抗原作为记忆性的诱导剂。每隔2－3天进行半量补加培养基，并维持细胞密度在（1－2）x10⁶/ml。根据细胞生长状态，细胞培养时间为10－15天；选择在第7天和第14天进行细胞表型检测，在第10天开始细胞功能性检测。

实施例2

本实施例2对上述培养的γδt细胞进行形态学、细胞增殖倍数、免疫表型检测和细胞功能检测。具体步骤如下：

1.细胞培养24小时即可见γδt细胞沉于培养器皿底部，并趋于集落化，培养48小时集落开始变大，培养6－10天可见大的集落和不规则的单个核细胞。

2.分别取第0、3、6、8、10、13、14天细胞，进行细胞计数，利用beckman公司的z2细胞计数仪进行，对细胞进行稀释，使得细胞浓度在10⁵－10⁷范围之内，调整细胞粒径大小5－15um,每次计数重复3次测量，最后得出平均值。平均值乘以培养的体积即为当天的细胞总数。根据各天的总数即可以得出细胞的增殖曲线，将最后的总数与第一天进行比较，即可以得到增殖倍数。结果显示在培养至14天时常规对照组增长倍数为32倍而记忆实验组的增长倍数为45倍。

3.取第0、7、14天细胞，进行细胞表型检测，取细胞用pbs洗涤1次，再用pbs重悬细胞沉淀，分为3，其中a组为加入抗体（cd3-percp，vγ9－fitc,cd27-pe,cd56-apc）,b组加入抗体（cd3-fitc,cd4-pe,cd8-percp,cd45ro-apc）,c组为空白对照组。避光染色30min，上bdaccuric6流式细胞仪检测细胞的各个表型指标。

4.培养至到第10天后，开始对细胞功能检测。取细胞用pbs洗涤2次，然后再用t551培养基重悬，调整浓度为1x10⁶个/ml,铺板于24孔板，设定对照组，为阴性对照组，刺激对照组，阻断对照组和阳性对照组。每个组别设定3个复孔。加入刺激剂pma(10ug/ml)，ionomycin（1ug/ml）和阻断剂bfa（5ug/ml）后24小时收集细胞，用bd公司固定破膜剂（cytofix/cytopermfixationpermeabilization）4度破膜10分钟，用对应的破膜洗涤剂（perm/washbuffer）洗涤2次，最后然胞内因子抗体inf-γ，避光30分钟，上流式细胞仪检测ifn－γ含量。结果显示记忆实验组的ifn-γ分泌量比对照组的高。

5.取对数生长期的k562细胞株作为靶细胞，调整细胞密度为2x105，1x105，5x104/ml,铺板于24孔板，再取γδt细胞，调整浓度为1x10⁶/ml，铺板于24孔板，使得最后效靶比为5：1，10：1，20：1，各孔对应重复3次复孔，并设置空白对照孔，培养24小时后，收集细胞，pbs洗涤2次，加入pi染色15分钟，上流式细胞仪检测细胞杀伤率。结果显示，在效靶比为5：1的时候，记忆实验组杀伤率为53.5%，而对照组的是35.2%，同样，随着效靶比的增高，杀伤率随之增强，当效靶比为20：1时，记忆实验组的杀伤率高达76.2%，而常规对照组的只有68.7%。