一种分离高纯度尿液外泌体的方法和试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种分离高纯度尿液外泌体的方法和试剂盒。

背景技术：

外泌体(exosome)是一种很多细胞都能分泌的直径约30-150nm的包含有多种蛋白质和rna的膜性囊泡，具有在细胞之间传递信息的功能。不同的细胞可能分泌特异性的蛋白质和rna。研究表明尿液中也含有外泌体。

尿液外泌体研究中的一个难点是尿液中外泌体的提取与分离。在目前存在的分离外泌体的分离方法主要有以下几种:

第一种方法是利用不同的超速离心速度(thérycetal.currprotoccellbiol,2006；3:1–29)或者是密度梯度离心(taurobjetal.methods2012；56:293–304.)，这种方法被认为是外泌体分离的金标准，用此方法分离的外泌体的纯度高，但此方法需要配有价格不菲的超高速离心机和耗材，且可能破坏外泌体结构(linaresretal.jextracellvesicles2015；4:29509)。

第二种方法是超滤法(merchantmletal.proteomics-clinappl2010；4:84–96)，此方法虽然操作简单。但是得到的外泌体的纯度不高(danqiwangandweisun,proteomics,2014；14,1922-1932)。

第三种方法是商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到外泌体的沉淀(lobbrjetal.jextracellvesicles2015；4:27031)，但这类方法面临的不足是提取的外泌体纯度不够且试剂盒价格昂贵。另一类方法是将样品加入到柱子中(boanetal.jextracellvesicles2014；3:23430)，在通过柱子的过程中，样品中的蛋白质等杂质会进入到柱子中，而粒径较大的外泌体会先从柱子中流出，这样能较快速的得到纯度较高的外泌体。但成本过高限制了这种方法的应用。

第四种方法是利用价格便宜的聚乙二醇将外泌体沉淀下来(ridermaetal.scirep2016；6:23978)，此种方法和商品化的外泌体提取试剂盒原理相类，其优点在于提取成本不高，缺点是提取的外泌体的纯度不高。

因此，目前缺少一个具有成本低、操作简单、产率和纯度高且外泌体结构完整等优点的尿液外泌体分离方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是建立一种分离高纯度尿液外泌体的方法，具有成本低、操作简单、产率和纯度高且外泌体结构完整等优点。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案，包括以下步骤：

步骤一、尿液样品离心，弃沉淀，收集上清液；

步骤二、将步骤一得到的上清液用滤头过滤，收集过滤液；

步骤三、将步骤二得到的过滤液装入透析袋中透析得到外泌体；

步骤四、将步骤三中获得的外泌体在超滤管中超滤最终得到浓缩的尿液外泌体。

进一步地，步骤一中的尿液样品是新鲜尿液、-20℃冷冻保存过的尿液和/或-80℃冷冻保存过的尿液。

进一步地，步骤一中离心的时间为5min，转速是3000rpm。

进一步地，步骤二中过滤上清液的滤头的规格为0.22微米。

进一步地，步骤三中用到的透析袋的规格为300kda和/或透析袋的孔径是25nm～30nm。

进一步地，步骤三中透析液为pbs或0.9％生理盐水，透析时间9小时且每3小时更换一次新鲜的透析液。

进一步地，步骤三中过滤液与透析液的使用体积比是1:100-300。优选地，步骤三中过滤液与透析液的使用体积比是1:200。比如，步骤三中过滤液为10ml，透析液为2l。

进一步地，步骤四中用到的超滤管的规格为100kda～200kda，优选地，超滤管的规格为100kda。超滤条件为3000rpm，5min。

本发明的另一目的是提供一种分离高纯度尿液外泌体的试剂盒，包括滤头、透析袋和超滤管；滤头的规格是0.22微米，透析袋的规格是300kda和/或透析袋的孔径是25nm～35nm，超滤管的规格是100kda～200kda。优选地，透析袋为美国spectrum(光谱医学)公司生产的透析袋，透析袋的规格是300kda，超滤管的规格是100kda。透析液，透析液是pbs或0.9％生理盐水。

进一步地，还包括说明书，说明书上记载着如上所述的分离高纯度尿液外泌体的方法。

进一步地，按照如上所述的分离高纯度尿液外泌体的方法使用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明不需要昂贵的设备。

(2)本发明方法简单、易于操作。

(3)本发明所用耗材价格低廉，且为了进一步降低试验费用，透析袋和超

滤管可以在清洗后反复利用。

(4)本发明可同时处理多个样品。

(5)本发明获得的外泌体纯度高，杂蛋白污染少。

(6)本发明获得的外泌体结构完整。

由于外泌体的粒径是从30-150纳米，本发明采用的300kda的透析袋对照透析袋公司(http://spectrumlabs.com/dialysis/poresize.html)所给孔径换算为30纳米左右，这样既能保证小于30纳米的杂质和小于300kda的杂蛋白能够更快去除掉，又能保证外泌体不能被透析出去。因此几乎可以获得样品中所有的外泌体，实现获得高产率的外泌体的目的。

附图说明

图1是尿液外泌体的透射电子显微镜照片。

图2是尿液外泌体的westernblot结果。

图3是尿液外泌体的粒径测量结果。

具体实施方式

本发明的试剂配方：

pbs：kcl200mg/l；nacl8g/l；kh2po4200mg/l；na2hpo41.5g/l。

0.9％生理盐水：nacl8g/l。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步地说明。

实施例1

一、将新鲜获取的尿液，离心3000rpm,5min，沉淀即是尿液中的细胞，去除沉淀，取上清液。

二、将步骤一中获得的上清液，通过0.22微米的滤头过滤，用以去除较大的杂质。

三、取步骤二中获得的过滤液10ml加入到300kda的透析袋(美国spectrum公司)中。在pbs中透析9小时，每3小时更换一次pbs，pbs用量共计为2l。将杂蛋白和其他分子透析出，留下外泌体。

四、将步骤三中的外泌体，加入100kda的超滤管中，3000rpm超滤5min用以浓缩外泌体体积。

本发明使用透射电子显微镜(tem)、westernblot、qnano对获得的尿液外泌体进行表征，具体表征结果分别如下：

(1)透射电子显微镜(tem)照片：

外泌体纯度的表征手段主要是tem电镜，如果外泌体纯度不够的话会后很多杂质。

对本实施例获得的尿液外泌体拍摄tem图片，见图1。如图1所示，在其视野范围内，尿液外泌体清晰完整，周围只有很少的几个小白点(即杂蛋白)，这说明通过本方法获得尿液外泌体纯度高，且外泌体结构完整。

(2)westernblot检测：

本实施例获得的尿液外泌体westernblot检测，从图2中可以得知，尿液外泌体表达外泌体标志蛋白tsg101和cd9。

(3)qnano检测外泌体粒径分析：

本实施例获得尿液外泌体的qnano图片，从图3中可以看出本发明获得的尿液外泌体平均粒径为102nm±23nm。

实施例2

一、将新鲜获取的尿液，离心3000rpm，5min，沉淀即是尿液中的细胞，去除沉淀，取上清液。

二、将步骤一中获得的上清液，通过0.22微米的滤头过滤，用以去除较大的杂质。

三、收集步骤二中获得的过滤液-80℃冷冻保存3天。

四、将步骤三中冻存的尿液室温融化

五、取步骤四中获得的融化尿液10ml加入到300kda的透析袋中。在2lpbs中透析9小时，且每3小时更换一次pbs。将杂蛋白和其他分子透析出，留下外泌体。

六、将步骤五中的外泌体，加入100kda的超滤管中，3000rpm超滤5min用以浓缩外泌体体积。

实施例3

一、将新鲜获取的尿液，离心3000rpm，5min，沉淀即是尿液中的细胞，去除沉淀，取上清液。

二、将步骤一中获得的上清液，通过0.22微米的滤头过滤，用以去除较大的杂质。

三、取步骤二中获得的过滤液10ml加入到300kda的透析袋中。在2l0.9％生理盐水透析9小时，且每3小时更换一次0.9％生理盐水。将杂蛋白和其他分子透析出，留下外泌体。

四、将步骤三中的外泌体，加入100kda的超滤管中，3000rpm超滤5min用以浓缩外泌体体积。

对于实施例2和3，本发明使用本发明使用透射电子显微镜(tem)、westernblot、qnano对获得的外泌体进行表征。其检测结果类似，这里不再赘述。

本发明利用透析的方法，能够将杂蛋白和其他分子透析出去，并将外泌体保留在透析袋中。得到产率和纯度高且结构完整的外泌体。本发明采用成本低廉、操作简单且外泌体纯度和得率高的方法获取尿液外泌体。

实施例4

本实施例中的分离高纯度尿液外泌体的试剂盒包括滤头、透析袋、超滤管和说明书；滤头的规格是0.22微米，透析袋的规格是300kda，超滤管的规格是100kda。说明书上记载着如实施例1-3任一项所述的分离高纯度尿液外泌体的方法和pbs和/或0.9％生理盐水的配方。

实施例5

本实施例中的分离高纯度尿液外泌体的试剂盒包括滤头、透析袋、透析液、超滤管和说明书；滤头的规格是0.22微米，透析袋的规格是300kda，超滤管的规格是100kda。透析液是pbs或0.9％生理盐水。说明书上记载着如实施例1-3任一项所述的分离高纯度尿液外泌体的方法。

以上详细描述了本发明的一个具体实施方式，仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。