本发明涉及生物医药
技术领域：
，涉及一种多肽，具体涉及一种抑制肿瘤转移的多肽及其应用，一种与趋化因子CXCL12相互作用的多肽及其在抑制癌症迁移方面的应用。
背景技术：
：癌症是严重危害人类身体健康的一类疾病，癌症是全世界的一个严重健康问题。在2007年，据估计全世界有760万人死于癌症。例如在英国，癌症每年造成126,000人死亡，四分之一的人死于癌症。癌症迁移是导致癌症病人死亡的主要原因。趋化因子是一类单链小分子蛋白质，通过与细胞表面的G蛋白偶联受体相互作用，引起细胞支架重排，与细胞的迁移、粘附和侵袭等行为有关。其中，基质细胞衍生因子SDF-1(stromalcell-derivedfactor-1)，也就是趋化因子CXCL12，及其特异性受体CXCR4在多种肿瘤和白血病细胞的器官特异性迁移中发挥着非常重要的作用。肿瘤细胞和白血病细胞表面高表达趋化因子受体CXCR4，而趋化因子CXCL12在骨髓、淋巴结和某些器官中高表达。高表达CXCR4的肿瘤细胞和白血病细胞在CXCL12的趋化作用下，逆浓度梯度迁移至趋化因子产生源的某些器官，例如肺、肝脏等，形成器官特异性迁移(BalkwillF.,SeminImmunol,2003,15,49-55)。因此，使用抑制剂靶向阻断CXCL12/CXCR4之间的相互作用可以阻断癌症细胞与基质细胞的黏附，增加肿瘤细胞与化疗药物的敏感性，防止癌症的迁移和复发。由于多肽易于合成，在人体内易于代谢并且不会带来毒副作用和严重的免疫反应，因此使用多肽来抑制肿瘤细胞的迁移是一种有效且无副作用的方法。CN105434347A公开了一种癌症治疗性多肽纳米胶束，所述多肽能够抑制癌症迁移，该多肽靶向于细胞表面CXCR4受体，而本发明所提供的多肽靶向于CXCL12/CXCR4这条趋化轴中趋化因子CXCL12这一部分，在多肽浓度较低时可以有效抑制肿瘤细胞的迁移。技术实现要素：为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抑制肿瘤转移的多肽及其应用，该多肽抑制剂与CXCL12能够特异性结合，亲和力较高，并且可以引起CXCL12二级结构的改变，从而阻断CXCL12与其受体CXCR4的结合，抑制肿瘤细胞和白血病细胞等的迁移。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO.1-6所示的氨基酸序列；所述氨基酸序列如下：SEQIDNO：1：GVSLSYDCGCDFFRSDV；SEQIDNO：2：RRRGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDV；SEQIDNO：3：DDDGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDV；SEQIDNO：4：GGRGDLDWIQRYLRDA；SEQIDNO：5：RRRGGRGDLDWIQRYLRDA；SEQIDNO：6：DDDGGRGDLDWIQRYLRDA。本发明针对CXCL12的结构和关键片段的序列，设计合成了一种特异性识别CXCL12的多肽，该多肽作用于CXCL12之后可以引起CXCL12二级结构的改变，因此该多肽可以作为变构调节剂结合到CXCL12的变构调节位点上，引起CXCL12构象的改变，从而影响CXCL12与CXCR4正构位点(orthostericsite)的构象，阻断CXCL12与其受体CXCR4的结合，抑制肿瘤细胞和白血病细胞的迁移。第二方面，本发明提供了一种DNA片段，其包含编码第一方面所述多肽的核苷酸序列。第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的表达载体。第五方面，本发明提供了如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重组载体或如第四方面所述的重组细胞在抑制肿瘤细胞迁移的应用。优选地，所述肿瘤细胞迁移包括细胞的横向迁移和细胞的纵向迁移。优选地，所述肿瘤细胞为CXCR4高表达相关癌症细胞。优选地，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞和/或白血病细胞。本发明多肽抑制乳腺癌细胞的横向迁移，抑制乳腺癌细胞和白血病细胞的纵向迁移。第六方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括如如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重组载体或如第四方面所述的重组细胞。第七方面，本发明提供了如第六方面所述的组合物在制备治疗癌症相关药物中的应用。优选地，所述癌症为CXCR4高表达相关癌症。优选地，所述肿瘤细胞为乳腺癌和/或白血病。在本发明的一个具体实施方式中，采用表面等离子激元共振(SPR)方法进行检测本发明多肽与CXCL12的亲和力。在本发明的一个具体实施方式中，采用圆二色谱(CD)方法进行检测本发明CXCL12的二级结构的变化。在本发明的一个具体实施方式中，采用细胞划痕方法进行检测肿瘤横向迁移。在本发明的一个具体实施方式中，采用transwell方法进行检测肿瘤纵向迁移。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明所述的多肽对CXCL12的亲和力高，可以特异性地结合到CXCL12上，并且引起CXCL12二级结构的改变，从而阻断CXCL12与其受体CXCR4的结合，抑制癌症的迁移；(2)本发明多肽具有作为治疗或辅助性治疗癌症的药物的潜力，尤其是作为针对乳腺癌和白血病这两种疾病的治疗和辅助性治疗药物。附图说明图1为本发明多肽SEQIDNO：4(W4)对CXCL12诱导MCF-7细胞横向迁移的抑制作用结果图；图2为本发明多肽SEQIDNO：4(W4)对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞横向迁移的抑制作用结果图；图3为本发明多肽SEQIDNO：4(W4)对CXCL12诱导MCF-7细胞纵向迁移的抑制作用结果图；图4为本发明多肽SEQIDNO：4(W4)对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞纵向迁移的抑制作用结果图；图5为本发明多肽SEQIDNO：1-6(W1-6)对CXCL12诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用结果图；图6为本发明多肽SEQIDNO：1-6(W1-6)对CXCL12诱导U937细胞纵向迁移的抑制作用结果图；图7为本发明多肽SEQIDNO：4(W4)与CXCL12结合及其对CXCL12与MCF-7细胞结合的抑制作用结果图，其中，7(a)图表示CXCL12结合到MCF-7细胞表面的量，7(b)图表示CXCL12与W4相互作用后，结合到MCF-7细胞表面的量明显降低；7(c)图表示W4在MCF-7细胞表面几乎没有结合；图8为本发明多肽SEQIDNO：4(W4)与CXCL12结合及其对CXCL12与MDA-MB-231细胞结合的抑制作用结果图，其中，8(a)图表示CXCL12结合到MDA-MB-231细胞表面的量，8(b)图表示CXCL12与W4相互作用后，结合到MDA-MB-231细胞表面的量明显降低；8(c)图表示W4在MDA-MB-231细胞表面几乎没有结合。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。除非特别指明，以下实施例中所用的乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和白血病细胞系HL-60、U937均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水。除非特别指明，以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液(PBS)均为1×PBS溶液。实施例1：多肽的合成按照下表序列合成多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度为98％)，实验前配制成合适浓度的母液。表1合成的多肽名称序列编号W1GVSLSYDCGCDFFRSDVSEQIDNO：1W2RRRGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDVSEQIDNO：2W3DDDGGSRGDGVSLSYDCGCDFFRSDVSEQIDNO：3W4GGRGDLDWIQRYLRDASEQIDNO：4W5RRRGGRGDLDWIQRYLRDASEQIDNO：5W6DDDGGRGDLDWIQRYLRDASEQIDNO：6实施例2：多肽与CXCL12的亲和力实验将W1-W6六条多肽以及抗CXCL12的抗体(RayBiotech，美国)配置成1mg/mL的水溶液，取5μL溶液滴在羧基化的SPR芯片(Plexera，美国)上，通过氨基酸缩合反应将多肽和抗体固定在SPR芯片上，作为固定相。然后将浓度分别为50nM、100nM和200nM的CXCL12(R&DSystems，美国)的PBS溶液作为流动相进行SPR分析，并计算平衡解离常数，结果如下表所示。表2多肽和CXCL12抗体对CXCL12的亲和力从表2中可以看出多肽W1-W6与CXCL12有较强的亲和力，并且与CXCL12抗体的结合常数相近。实施例3：W4多肽对CXCL12二级结构的影响配置含有不同浓度W4多肽的5μM的CXCL12蛋白的水溶液，之后将溶液迁移到0.1cm光程的超薄石英比色皿中，在190-260nm内扫描溶液的CD(J-1500，JASCO，日本)光谱，扫描速度为200nm/min，带宽为2nm，并且波长间隔为0.5nm。同一样品测量三次取平均值，并且扣除W4多肽本身的测量信号。之后使用JASCO软件分析二级结构。表3W4多肽对CXCL12二级结构的影响如表3所示，随着W4多肽的加入，CXCL12的螺旋结构逐渐转变为折叠和无规卷曲，说明W4与CXCL12的相互作用可以会引起CXCL12二级结构的改变。实施例4：W4多肽对CXCL12诱导MCF-7细胞横向迁移的抑制作用在六孔板中，每孔使用2mL含10％胎牛血清和1％青链霉素的RPMI-1640培养基(Gibco，美国)培养5×105个MCF-7细胞，将六孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h，MCF-7细胞生长至临近90％融合时，用10μL无菌枪头在培养板的孔中沿直线划痕，然后用PBS溶液将细胞轻柔的洗涤3遍，后每孔加入含有100ng/mL的CXCL12以及不同浓度W4多肽的培养基继续培养。划痕后的0h、24h用10×镜头的显微镜(IX71，奥林巴斯，日本)观察细胞移动情况以及划痕宽度的变化，计算细胞迁移率，只加入CXCL12组的细胞迁移宽度设为100％。如图1所示，加入W4多肽可以有效地抑制MCF-7细胞被CXCL12诱导的横向迁移。实施例5：W4多肽对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞横向迁移的抑制作用在六孔板中，每孔使用2mL含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基(Gibco，美国)培养3×105个MDA-MB-231细胞，将六孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h，MDA-MB-231细胞生长至临近90％融合时，用10μL无菌枪头在培养板的孔中沿直线划痕，然后用PBS溶液将细胞轻柔的洗涤3遍，后每孔加入含有100ng/mL的CXCL12以及不同浓度W4多肽的培养基继续培养。划痕后的0h、24h用10×镜头的显微镜观察细胞移动情况以及划痕宽度的变化，计算细胞迁移率，只加入CXCL12组的细胞迁移宽度设为100％。如图2所示，加入W4多肽可以有效地抑制MDA-MB-231细胞被CXCL12诱导的横向迁移。实施例6：W4多肽对CXCL12诱导MCF-7细胞纵向迁移的抑制作用收获对数生长期的MCF-7细胞，将200μL含有1×105个细胞的培养基加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜，密理博，瑞士)的上室，下室加入800μL含有100ng/mL的CXCL12以及不同浓度W4多肽的培养基。24孔培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色20min，清水冲洗后用10×显微镜(DMI3000B，徕卡，德国)观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数N，取平均值后计算细胞迁移率，只加入CXCL12组的细胞迁移数设为100％。如图3所示，加入W4多肽可以有效地抑制MCF-7细胞被CXCL12诱导的纵向迁移。实施例7：W4多肽对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞纵向迁移的抑制作用收获对数生长期的MDA-MB-231细胞，将200μL含有1×105个细胞的培养基加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜)的上室，下室加入800μL含有100ng/mL的CXCL12以及不同浓度W4多肽的培养基。24孔培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色20min，清水冲洗后用10×显微镜观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数N，取平均值后计算细胞迁移率，只加入CXCL12的细胞迁移数设为100％。如图4所示，加入W4多肽可以有效地抑制MDA-MB-231细胞被CXCL12诱导的纵向迁移。实施例8：W1-W6多肽对CXCL12诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用收获对数生长期的HL-60细胞，将200μL含有2×105个细胞的培养基加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜)的上室，下室加入800μL含有200ng/mL的CXCL12以及不同浓度W4多肽的培养基。24孔培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，计数每个下室迁移的细胞数目N，并且计算细胞迁移率，只加入CXCL12组的细胞迁移数设为100％。如图5所示，加入W4多肽可以有效地抑制HL-60细胞被CXCL12诱导的纵向迁移。实施例9：W1-W6多肽对CXCL12诱导U937细胞纵向迁移的抑制作用收获对数生长期的U937细胞，将200μL含有2×105个细胞的培养基加入transwell小室(直径为5μm的PET微孔滤膜)的上室，下室加入800μL含有200ng/mL的CXCL12以及不同浓度W4多肽的培养基。24孔培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，计数每个下室迁移的细胞数目N，并且计算细胞迁移率，只加入CXCL12组的细胞迁移数设为100％。如图6所示，加入W4多肽可以有效地抑制U937细胞被CXCL12诱导的纵向迁移。实施例10：W4多肽与CXCL12结合对CXCL12与MCF-7细胞结合的抑制效应将1mL含有1×105个MCF-7细胞的培养基加入玻底培养皿中，过夜待细胞贴壁后，将含有1μM异硫氰酸罗丹明B(RBITC，北京安必奇生物科技有限公司)标记的CXCL12、1μM异硫氰酸荧光素(FITC，上海科肽生物科技有限公司)标记的W4以及同时含有1μMRBITC-CXCL12和1μMFITC-W4的培养基分别加入培养皿，37℃作用1h后用PBS洗去未结合的蛋白和多肽，加入细胞核染料Hoechst.33342(西格玛奥德里奇，美国)染色10min，在40×共聚焦显微镜(LSM760，蔡司，德国)下拍照。如图7(a)和7(b)所示，W4加入之后，结合到MCF-7细胞表面的RBITC-CXCL12的量明显减少，并且图7(c)显示FITC-W4在MCF-7细胞表面几乎没有结合，这说明W4多肽是通过与CXCL12相互作用从而抑制了MCF-7细胞的迁移，而不是与细胞表面CXCR4结合的效果。实施例11：W4多肽与CXCL12结合对CXCL12与MDA-MB-231细胞结合的抑制效应将1mL含有1×105个MDA-MB-231细胞的培养基加入玻底培养皿中，过夜待细胞贴壁后，将含有1μMRBITC-CXCL12、1μMFITC-W4以及同时含有1μMRBITC-CXCL12和1μMFITC-W4的培养基分别加入培养皿，37℃作用1h后用PBS洗去未结合的蛋白和多肽，加入细胞核染料Hoechst.33342染色10min，在40×共聚焦显微镜下拍照。如图8(a)和8(b)所示，W4加入之后，结合到MDA-MB-231细胞表面的RBITC-CXCL12的量明显减少，并且图8(c)显示FITC-W4在MDA-MB-231细胞表面几乎没有结合，这说明W4多肽是通过与CXCL12相互作用从而抑制了MDA-MB-231细胞的迁移，而不是与细胞表面CXCR4结合的效果。上述实验显示：本发明所述的多肽与CXCL12可以特异性结合，亲和力较高，并且该多肽作用于CXCL12之后可以引起CXCL12二级结构的改变，从而阻断CXCL12与其受体CXCR4的结合，抑制癌症的迁移。该多肽为癌症迁移的抑制提供了可行的治疗方法。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页1 2 3