专利名称：：用于抗人乳头瘤病毒型16的salmonella疫苗菌株的密码子经优化的hpv16li的制作方法
技术领域：
：本发明涉及如在SEQIDNO:1中提供的编码抗原HPV16LI蛋白的新核酸序列(HPV16L1S),其中该所述序列具有至少一个经修饰的密码子以在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物的免疫原性。本发明还涉及用编码HPV16(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的核酸转化的原核微生物的减毒林。另外，本发明公开一种生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关癌变危险的基于原核微生物的疫苗的方法。
背景技术：
：宫颈癌是全世界妇女癌症死亡的第二主要原因，且实际上所有这些肺瘤可归因于人乳头瘤病毒(HPVs)亚型的感染，其中，发现HPV16是最常见的(6,41)。因此期待抗这些HPVs的有效疫苗，以对此癌症和其前期病变发病率，以及归因于这些病毒的少见肺瘤具有明显效果。首位候选的是预防疾病的亚单位HPV病毒样颗粒(sub-unitHPVvirus-likeparticle)(VLP)疫苗(在(35)和(24)中评论)。原理功效试验的证据显示用HPV16VLPs接种的妇女受到高度保护以防通过此病毒型的生殖器黏膜感染(19)。然而，其预期目标人群将会比儿童期疫苗的预期目标人群年长的疫苗的多次注射的要求可能表现在广泛实行上的实质性的障碍。在发展中国家这尤其正确，这些发展中国家占有大于四分之三的全世界宫颈癌病例(6)。已将经减毒但仍有侵入性的重组减毒Sa7iMo刀e/7a菌抹广泛用作黏膜疫苗载体以将病原体特异保护的抗原决定部位递送至翻膜相关性、淋巴样组织中。通过此途径，抗该载体和外源抗原的黏膜和系统免疫应答均可以获得(在(ll，22，36)中评论)。我们已示出如果经减毒的Saimo"e77ae"feWca血清变型Typhimurium菌林表现出PhoPc表型，则用表达该HPV16主要衣壳蛋白LI(在VLPs中自组装)的6W7230i3e"a的小鼠的鼻接种，在血清和生殖分泌物中诱导出抗-HPV16的构象与中和抗体(3，4，31)。然而，即使用原始PhoPc抹，也需要双鼻免疫以诱导高抗-HPV16VLP抗体效价，而口免疫是无效的(31)。在缺乏抗生素选择时低水平LI表达和LI编码的质粒的高不稳定性的观察结果强烈表明LI蛋白或LI基因对细菌可能是有毒的。由于该病毒LI基因此设计并测试用于在Sa/mo"e7/a中翻译的具有经优化的密码子的编码LI蛋白的合成核芬酸序列(在此以后标记为L1S)。基于这样的VLPs且在目前在临床试验中测试的该HPV疫苗已证明是良好耐受性的、高免疫原性的及能够防止HPV16诱导的宫颈上皮内瘤变的发展(由[Schiller,2004弁1431〗和[Lowy,2003#1397]评论)。然而，这些昂贵的疫苗要求多次肌肉用药以生效，且由于多数宫颈癌发生在发展中国家，这些疫苗对于最需要它们的人来说似乎是难以得到的。因此非常需要开发其它具有全世界适应性的策略。活减毒6^7/fiOi2e^a菌抹可能是有效的抗原递送系统，由于它们在口接种之后能够表达外源抗原并引起抗同源和异源抗原的黏膜及系统免疫应答(在[Sch5del，1992#245;Curtiss，1994#466;Levine，1997弁1416]中评论)。在本研究中，我们已进一步优化了抗HPV16的基于SaZmoneZ/a的疫苗以便能够在妇女中测试它。我们已首先用卡那霉素抗性基因替换了用于质粒维持的氨节霉素选择标记，已知其更高的生物安全记录的该卡那霉素抗性基因对于在人类中的使用是更加可接受的(FDA在1994[Administration,1994#1522]中批准)。然后，我们已在三个已显示在人类中是安全的SaZmaaeWae"&Wca血清变型Typhi疫苗抹，即目前已得到许可的伤寒症疫苗Ty21a[Germanier，1975#103],以及两个高免疫原性的伤寒症疫苗候选Ty800[Hohmann，1996弁596]详口CVD908htrA[Tacket，1997弁643]中观'H式了；亥#斤质粒。使用小鼠的鼻内免疫模型[Galen，1997#661],比较由此三菌抹引起的抗同源和异源抗原的免疫应答。我们的数据显示在用该新重组菌抹鼻或口免疫之后抗-HVP16YLP的体液反应大大增加。引起关注的是，这与增加的LI表达无关，而与在体外和体内LIS-表达质粒的显著的稳定性有关。另外，如在其它其减毒适于人类{吏用的Salmonellaenterica血清变型Typhimurium菌才朱戶斤显示的那样，免疫原性不限于PhoPc。图1显示密码子经优化的HPV16L1S可读框。(SEQIDNO:1)在给出的L1S的核苷酸序列中，加下划线的为经修饰的密码子和用粗体的为经修饰的核苷酸。图2显示在PhoP。Ll和PhoP。L1S重组菌林中HPV16L1的表达。图3显示LI和LIS-质粒在体外的稳定性。图4显示在用PhoPcL1S鼻和口接种后，抗-HPV16VLP系统的(A)和阴道的(B)抗体效价。图5显示在用％4989L1S、x4990L1S、PhoP"LlS和AroAL1S鼻或口接种后，抗-HPV16VLP系统的IgG效价。图6为在用PhoPckanL1S、Phop-kanLlS禾口AAroAkanL1S口接种后，血清抗-HPV16VLP抗体效价的比较。图7显示在不同6^7z3ei^en'ca血清变型Typhi菌株中kanLIS质粒在体外的稳定性。图8是在用Ty21akanL1S、Ty800kanL1S和CVD908htrAkanL1S鼻接种后，血清抗-HPV16VLP抗体效价的比较。图9是HPV16VLP和鞭毛蛋白—特异004+T细胞增值的比较。图10显示在用Ty21akanL1S鼻接种的小鼠的血清和阴道分泌物中HPV16-中和与抗-HPV16VLP抗体。图ll显示在4义用Ty21akanLIS的或在初始时用经纯化的VLPs的鼻接种的小鼠的血清和阴道分泌物中HPV16中和与抗-HPV16VLP抗体。在说明书中涉及的表的详细说明表1&1A涉及在本研究中使用的Salmonella菌林。表2涉及在鼻或口免疫后两周，携带Ll-或LlS-编码质粒的6^Zmoi2e77aPhoPc的回收。表2A涉及在口免疫后两周，携带氨,青霉素e或卡那霉素抗性基因的Ss7i2a2e77aPhoP。LIS-编码质粒的回收。表3涉及在鼻免疫后一周，携带kanLIS质粒的不同AS^/mo"a/7aez^ei-ica血清变型Typhi的回收。发明目的本发明的主要目的是提供如在SEQIDNO:l中提供的编码抗原HPV16Ll蛋白的新核酸序列(HPV16LIS),其中，所述序列具有至少一个经修饰的密码子，以在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物的免疫原性时。本发明的另一目的是构建包含SEQIDNO:l的重组载体pFS14nsdHPV16Ll和pFS14nsdHPV16kanLIS,其中前者携带氨苄青霉素且后者携带卡那霉素作为选择标记。本发明的又一目的是提供用编码HPV16(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的核酸转化的原核微生物的减毒株。本发明的再一目的是提供一种生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关癌变危险的基于原核微生物的疫苗的方法。
发明内容因此，本发明提供如在SEQIDNO:l中提供的新核酸序列(HPV16LIS),基于编码抗原HPV16Ll蛋白的人乳头瘤病毒型16(HPV16),其中所述序列具有至少一个经修饰的密码子，以当在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物的免疫原性，优选该菌抹属于6^7/23o"eWa种。本发明进一步涉及构建包含SEQIDNO:1的重组载体pFS14nsdHPV16Ll和pFS14nsdHPV16kanLIS,其中前者携带氨千青霉素且后者携带卡那霉素作为选择标记。本发明进一步提供用包含SEQIDNO:l的pFS14nsdHPV16Ll或pFS14nsdHPV16kanLIS转化的属于Sa/723o"e〃a种的减毒抹。此外，本发明公开一种生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的基于SaZrac^e/7a的疫苗的方法。具体实施方式有用单次口接种诱导长效系统和翁膜免疫的理论优势，将对全世界实行具有非常大的价值。然而，尽管我们已在小鼠中显示了此策略的可行性(31),但在将基于SaZmo72e/7a的疫苗能够安全地用于在妇女中测试之前还必须应对几个缺点。这些缺点包括需要特殊的SaZmoi2e77a表型(PhoP(3，4))和免疫的鼻途径以有效诱导中和抗体反应，以及LI-编码质粒没有抗生素选择时不稳定(31,4)或在用半致死互补系统使其稳定时弱表达((3)的观察结果。在这里，我们报导通过使用用于HPV16LI衣壳基因(HPV16L1S)表达的密码子优化策略解决了这些问题的大多数。的确，当用鼻或口途径递送不同减毒的细菌时，在^aZmo2e/7a中合成的L1S基因稳定表达并带来更高免疫原性。在哺乳动物细胞中天然乳头瘤病毒衣壳基因的表达是有限的，但是造成的HPVDNA疫苗的免疫原性缺乏可以通过密码子优化解除(20，23和42)。对于其它DNA疫苗已i/v识到密码子选4奪对免疫原性的影响(l，12，32和38)，其中较高的异源基因表达导致较高的免疫原性。对于在^3//30726//3中的翻译，由于原始HPV16衣壳基因的密码子选择也不是最理想的，我们期望密码子优化的L1S基因的表达将产生更高的VLP表达及由此更高的重组5^7/7303e/^的免疫原性。令我们惊讶的是，不同减毒的LlS重组Sa/i230i2eZ/a的较高的免疫原性与在这些细菌中产生的较高量的L1/VLPs不相关。事实上，此对立是正确的，与原始LI序列的表达(VLP量在20和60(ig/1011CFU之间，(4))相比，当表达LIS基因时(范围从AroAUS菌才朱的3jig/1011CFU至x4989IJS的23pg/1011CFU)，产生较少量的HPV16VLPs。这与用经优化的人HPV16LI基因在哺乳动物细胞中获得的>104的1^表达增加形成对比(20)。然而，我们应该注意，我们不能排除当Sa^30"e77a入侵其中代谢作用约束(metabolicconstraints)不同的小鼠组织时，在细菌中VLPs的表达量可能变化。不幸地，我们不能测量VLP在体内表达，因为回收的细菌数量相对低(103-104CFU/器官)和获得的VLP表达低(〈lfg/细菌)。与密码子优化的LIS序列的表达相关的另一值得注意的特征是在不存在抗生素选择时，LIS-表达质粒在体外和体内的稳定性提高。由于其带来由该细菌携带的该VLP抗原的较长的持久性，这可能有助于重组SaZmo"e77a的较高的免疫原性。此解释与以下的观点一致在黏膜相关性淋巴样组织中较长的抗原持久性是成为由6^7i23o"e77a疫苗菌抹引起的免疫应答的基础的关键机理(34),且与其它的已接触抗原黏膜淋巴样组织的抗原起始量是用于诱导有效免疫应答的关键点的提议(8，IO)形成对比。已使用不同的途径来提高质粒在细菌载体中的稳定性(在(13，25)中评论)。它们包括使用体内可诱导的启动子或平衡的致死质粒稳定化系统，但是，据我们所知以前没有报道过优化异源抗原的密码子来诱导质粒稳定性。引起关注的是，该质粒的稳定性和较低的VLP表达与LIS表达细菌在体外较迅速的生长速率相关。采取将在翻-泽系统中的该投入(investment)优化以提供最大的细菌生长速率，并且这通过在不同tRNA和它们的关连密码子之间充分的平衡来实现(5)。我们的观察结果表明优化该异源LI基因的密码子选择，释放出允许翻译内生的细菌蛋白的tRNA池，由此，提高损害L1/VLP表达的生长速率。此在体外提高的生长速率与在体内细菌的增强入侵和/或持续不相关，由此，我们不能预见LlS表达可能影响Sa7/230i2eZ^疫苗菌抹的安全性。该PhoPcL1S在小鼠中的免疫原性的确提高了，并且与用经纯化的HPV16VLPs诱导的免疫原性相比良好，其是目前在三期临床试验中最主要的原型预防亚基(prototypeprophylacticsub-unit)疫苗(在(24)中评i仑)。用PhoPcLlS的单次鼻免疫诱导出，与用lpg经纯化的HPV16VLPs三次皮下注射，或用与黏膜佐剂霍乱毒素共同使用的5pgVLP剂量的三次鼻/气雾免疫类似的血清和阴道抗-HVP16VLPsIgG效价，包括诱导用于黏膜方法的在阴道清洗液中的特异IgA(2，29)。虽然我们已示出用重组^a^2^刀e/h的鼻接种在低剂量时可以是高效的，并且没有伴随的肺炎(28)，但是在用此途径在人类中免疫时仍存在安全上的忧虑。在此，我们报道可以将较安全的口服进入用作用免疫原性的PhoPcL1S的单次口接种，虽然该VLP-特异效价比下面的鼻免疫低，但是它们与在三次不含佐剂的鼻/气雾5ngVLP用药之后诱导的效价类似(2)。在人类中测试基于HPV166^77zone77s疫苗的最主要的限制之一是，该包含单一减毒突变的PhoPc菌抹的已报道的可逆性(PhoQ24(27))以及此表型在小鼠中诱导有效抗-VLP反应的必要性(3，4)。在此，我们显示其它S.^7^i/23"27'"i23菌株(x4989,PhoP"和aroA)能够在鼻接种后在小鼠中诱导抗-VLP反应，这些菌林的减毒突变已在6UjTin'中测试并显示在人类中是安全的(x4632(30,39)，Ty800(15)和CVD908-htrA(40))。然而，该效价比通过PhoPc菌抹诱导的效价低一或两个数量级，这与我们以前的发现一致(3，4)。该PhoQ24的表达(3)是否可以增强该新LlS重组菌抹的免疫原性还有待测试。虽然口免疫比鼻免疫效果低，但是该AroAL1S的免疫原性较少受口服进入的影响。由于包含Aro缺失的S.typhi菌抹(CVD908htrA)具有在人类中的最好的安全和免疫原性记录(在(13，21和33)中评论)，此结果是非常鼓舞人心的。此重组CVD908htrALIS菌林可代表用于预防HPV16感染和相关病变的最好的候选口服活疫苗以在人类志愿者中测试。许多年以来，产生具有全世界适用性的抗宫颈癌的预防疫苗一直是我们的主要目标。在此，我们报道在基于SaZmo72e77a的疫苗的开发上的决定性的改进，即，可接受的选择标记和安全疫苗菌株的鉴定，现在这将允许在妇女中测试此疫苗。重组细菌疫苗的开发经常需要使用选择性标记。不幸地，我们使用天冬氨酸B-半醛脱氬酶平^f致死载体-宿主系统[Curtiss，1990#59]以稳定L1S在PhoPc中的表达的尝试没有诱导出任何VLP-特异免疫应答(数据未示出)。因此我们已选出了抗生素选择标记即，卡那霉素，其具有确定的生物安全记录且其使用已由FDA批准[Administration,1994#1522]。该卡那霉素选择性标记将不会给微生物带来任何试验室以外的可选择的优势并且该表型在自然界中已非常普遍。事实上，对卡那霉素的普遍的细菌抗性已限制了此抗生素在人类医药中的使用和酶的高底物特异性保证抗现代抗生素治疗的抵抗或阻碍的发展的缺乏。引起关注的是，虽然此卡那霉素抗性基因的存在进一步提高了在体内该L1S表达质粒在Phopc中的稳定性，但是用包含该kanL1S质粒的三个减毒的*9a7i22oze77aez力erAa血清变型Typhimurium口免疫i秀导的免疫应答，与用包含氨节青霉素Lis质粒的细菌获得的免疫应答类似[Baud，2004#1439]。除在人类中作为重组疫苗测试的Salmonellaenterica血清变型TyphimuriumPhoP—菌才朱之夕卜[Angelakopoulos，2000#1194]，该基于Salmonella的疫苗是首先被开发作为抗伤寒疫苗的经减毒的Salmonellaenterica血清变型Typhi菌抹(在[Levine，2001#1428〗中评论)。两种候选伤寒疫苗Ty800[Hohmann,1996#596]和CVD908htrA[Tacket，1997#643]以与Typhimurium菌抹(PhoP-andAroA)同样方式包含减毒作用(分别为PhoPQ和aro)，在此将其选作用于HPV16VLP的潜在的疫苗载体。此外我们还测试了已经得到许可的疫苗Ty21a。三个重组菌抹的体外分析显示了相似的VLP表达水平和相对的质粒不稳定性，就此方面来说，该kanLlS质粒在Typhi菌4朱中不如其在Typhimurium菌株中稳定，但是它比在PhoPc中的amp质粒稳定[Baud,2004#1439]。当使用脲酶编码质粒时，同样观察到质粒在Typhi中不稳定，4旦在Typhimurium中则不然[Angelakopoulos,2000#1194]。在小鼠中鼻滴给予高剂量的经减毒的Salmonellaenterica血清变型Typhi引起一系列免疫应答，这与在口服l会予减毒林的志愿者中观察到的免疫应答类似(在[Pasetti，2003#1404]中评论)。这支持用此小动物模型来预临床评估活SW/30刀e77a疫苗候选物的免疫原性和功效。我们首先使用此模型来研究该kanL1S质粒的体内稳定性。在免疫后一周从肺中回收相对高数量的细菌，反映在深度麻醉下用鼻接种可实现优异的肺輩巴向[Balmelli，1998#930;Londono-Arcila，2002#1526],然而，与之前的研究一致，在此后的时间点几乎没有细菌从脾回收[Pasetti，2000#1494;Lee，2000#1530;Pickett，2000弁1158]。虽然在回收的所有Ty21a细菌中发现该kanLIS质粒，但是其仅存在于极少数CVD908htrA和Ty800细菌中。据我们所知，以前没有报道过在鼻鼠科动物模型中用重组Ty800的试验，而以前在Ty21a[Gentschev,2004#1531]和CVD908htrA[Londono—Arcila，2002#1526]中均观察到质粒稳定性。在CVD908htrA中该kanL1S独特的不稳定性可能与在我们的质粒中存在组成型启动子而不是在其它重组CVD908htrA菌抹常用的体内可诱导nirB启动子有关[Wang，2001#1533;Londono-Arcila,2002#1526;Ruiz-Perez，2002#1532]。在CVC908htrA和Ty800中该kanLIS的不稳定性可能与这些细菌抗HVP16VLPs的低免疫原性有关。我们的数据清楚的显示在鼻鼠科动物模型中只有该重组Ty21akanLIS能够诱导强抗-HPV16VLP抗体和VLP-特异CD4+T细胞反应。相反，CVD908htrA和Ty800均比Ty21a诱导出更强的抗-LPS和抗-鞭毛蛋白抗体，以及鞭毛蛋白-特异CD4T细胞反应(对于Ty800)。此发现与先前的研究一致，是将CVD908htrA和/或Ty800与Ty21a在鼠科动物鼻模型[Wang，2001弁1533]或人类中进行了比较。本发明的实施方案涉及通过修饰它们的密码子合成基于HPV(HumanPapillomaVirus)例如HPV16、HPV18、4531等主要衣壳蛋白的新核酸序列，用于当转入原核4敖生物时，优化重组质粒载体的稳定性，以提高所得原核微生物免疫原性。该原核微生物4尤选选自由6^/mo"e/7asps、Asc力er/c力yaco/i、/S72_'《e7/aj^rw'zzh、Z/3"oZac/Z/w61、iWyco^s"eria或Z^sfe"'a组成的组中，优选6^/mo73a/7a印s。进一步，该Sa/mozzeZ/asps减毒抹选自由SaZmc)"e//aei2fe27'ea血清变型Typhimurium、Sa/mozzeZ/a^XPA厶Sa7/Z20ZZe77a^XP力i/3iZJ7'i7773或/S^7/zOi2e7/a(fwZZz'/2纟且成合勺纟且中。另夕卜，该6^/mozzeZ/a菌抹优选选自由iS^/moneY/aez^en'ca血清变型TyphimuriumPhoPc(CS022)、SaZmo"e/7aan力erica血清变型TyphimuriumPhoP(CS015)、6^//MO/3e〃aei2farz.ca血清变型Typhimuriumx4989(AcyaAcrp-cdt和AaroA(SL7207))、5^7moHe77aez,en'ca血清变型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty800组成的组中。病毒型16(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步骤a.通过修饰密码子选择合成如在SEQIDNO:l中所示的编码抗原HPV16Ll蛋白的新核酸，b.通过替换在质粒载体pFSl4nsdHPVl6Ll或pFS14nsdHPV16kanLlS中的原始HPV16L1基因构建包含SEQIDNo:l的重组pFS14nsdHPV16LlS载体，c.将来自步骤(b)的该重组质粒载体引入经减毒的微生物以获得重组接种物，d.在小鼠中给予重组接种物。另一实施方案涉及用编码HPV(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的经密码子修饰的核酸转化的原核微生物减毒抹，其中至少一个密码子是经修饰的。该HPV主要衣壳蛋白选自由HPV16、HPV18、HPV31和HPV45组成的组中，优选HPV16Ll。该上述菌抹包含新核酸序列SEQIDNO:1。本发明的又一实施方案涉及一种新核酸，其具有一个或更多经修饰的密码子，用于优化在5^//730"6"3菌抹中的重组质粒载体的稳定性，以提高所得Sa/ii20"e/h菌林的免疫原性。优选地，在本发明中在HPV16L1序歹'J中已改变来自506个原始密码子中的163个。而本发明的又一实施方案提供含有如SEQIDNO:l中所示的DNA序列的重组质粒载体，其中该所述重组质粒载体为pFSl4nsd-HPV16L1S或pFSnsd-HPV16kanLlS。本发明的另一实施方案涉及抗HPV16的基于6^/ino刀eWa的疫苗的给药模型，该模型可能选自由口、内鼻、阴道或直肠组成的组中。本发明另一实施方案提供原核微生物减毒林在制备用于预防或治疗处理乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的药物中的用途。现在非限制性地参考附图通过实施例来描述本发明优选的实施方案。本发明实施方案实施例实施例1质粒构建和所用的细菌菌林该L1S基因由瑞士Buchs的Microsynth合成。可读框在5'以ATco7限制性位点和在3'以i/i'i36/Z^限制性位点为侧翼(flanked)。将该LISA^o/-i/i'"o77/片断插入，替换在质粒pFS14nsdHPV16-Ll(31)中的原始LIiVco/-T7yz^7W片断。将该所得质粒，pFS14nsdHPV16-L1S通过电穿孑L(37)引入经减毒的ezfer/ca血清变型Typhimurium菌抹PhoPc，(CS022(27))和PhoP"(CS015(26))，两者都是来自的美国波士顿的JohnMekalanos的赠品，x4989(Acj^4ci75，(4)),x4990G4cyav4ci7-cW,(4))和4arcM(SL7207(16))，是来自IreneCorthesy-Theulaz，Lausanne,CH的赠品。HPV16LI和VLP分析如先前所述15(31),使用抗-HPV16LImAb，CAMVIR-1(Anawa)通过蛋白质印迹分析LI在Sa7/230刀e77a溶菌产物中的表达。将数据归一化为如通过培养物的OD600测量的在细菌中的含量。使用识別在HPV16VLPs、H16E70和H16V5上的构象性抗原决定部位的两种单克隆抗体，通过如先前所述的夹心酶联免疫吸附测定法(sandwichELISA)(4)测量该HPV16VLP含量(9).20。小鼠的免疫，该免疫应答的分析及^.^7/2//23"27'17/23的回收在所有试验中使用来自法国IffaCredo的六周龄雌性BALB/c小鼠。在如前所述(17，31)麻醉下，胃灌(108~9CFU)或鼻滴(1067CFU)服用二十JLLl的细菌接种物。按照早期报道(17，31)进行血液和阴道清洗液(vaginalwashes)取样以及通过酶联免疫吸附测定法测定抗-HPV16VLP抗体效价。如前所述(31)，测定在来自安乐死的小鼠的器官中的6^Zmo"e77aez^er/ca血清变型Typhimurium的回收。设计用于在Sa//220/2e//a中翻译的具有经优化的密码子的HPV16LI核苷酸序列考虑用于翁3译在SaZmoi2eWaei^eWca血清变型Typhimurium中的主要内源蛋白的密码子(7，14)，以设计经优化的LI可读框(orf)。将来自原始HPV16LI序列的506个密码子(HPV16114/B(18))中的163个，修饰为在Sa/722o刀e/7a中最经常使用的密码子(见图l-SEQIDNO:1)。这包括所有在SaZmof2e7/a中极少发现的原始LI序列(136)的密码子和一些(27/72)不经常使用的密码子。然后，通过新LIS可读框在质粒pFSl4nsd-HPV16LI(31)中替换该LI可读框，产生pFS14nsd-HPV16LIS。将该新质粒首先引入经减毒的6^//23oae77aez^eWca血清变型Typhimurium菌抹PhoP。(27)以产生此后称为PhoPcLIS的重组菌林。随后生产四个其它的LIS重组减毒6^Zmoi3e77a菌抹(见下文)，表l总结了不同的菌抹和在此研究中使用的缩写。HPV16LI和VLP的表达通过蛋白质印迹比较LI蛋白在PhoPcLI和PhoPcLIS的指数培养物的溶菌产物中的表达(见图2A)。令人惊讶地，在细菌培养物中LI的表达没有随新L1S序列而提高反而降低2倍(图2B)。当通过夹心酶联免疫吸附测定法比较在两个重组菌林中生产的VLPs量时，该发现得到确认(见图2C)。当用单克隆接种50mlLB后比较达到对数中期的时间时，注意到两个菌抹在生长速率上的显著不同(对于PhoPcL1S大约7小时，对于PhoP。LI大约15小时)。这可能表明关于该相应关连tRNAs的LI经优化的密码子选择使生长速率最大化而没有伴随L1S翻译的增加。L1S编码质粒在体外和体内的稳定性发明人先前已寺艮道在体内缺乏抗生素选冲奪时，在iS^/7Zo72e/^中通过质粒分离，该原始LI-编码质粒迅速丢失(4，31)。首次比较该LlS-和LI-编码质粒在体外的稳定性。为此目的，在缺乏抗生素选择的情况下，在四个连续0/N培养期间，比较仍旧含有LI-或LIS-编码质粒的细菌的百分比(见图3)。正如所期待的，该L1-编码质粒迅速丟失。相反，在缺乏抗生素选择时，在约50代时间后，在大多数细菌中回收到该LIS-编码质粒。在小鼠的鼻或口免疫后，进一步在体内研究LIS-编码质粒的稳定性(见表2)。与原始Ll-编码质粒相反(4),该LlS编码质粒在"l妄近感染位点/入口的器官中完全稳定至少两个周。然而，在更远的器官，例如脾中观察到LIS质粒的一些不稳定性，其中约10%的细菌仍包含L1S质粒但是无一检测到包含LI质粒。我们还应该注意到没有包含L1S的细菌的侵入力或持续性更高的证据，尽管观察到在体外这些细菌高速的生长能力。在用PhoPcL1S鼻或口接种后产生抗-HPVI6VLP的系统的和黏膜的抗体最终目的是测试该HPV16L1S基因的表达是否会提高在6^^230"6//3ez^eWca血清变型Typhimurium中的HPV16VLP抗原的免疫原性。因此，我们用PhoPcLlS菌株通过鼻或口途径使成组的雌性BALB/c小鼠免疫。在图4中示出在单次免疫后的4至6、8和24周在小鼠的血清和阴道分泌物中测量的抗-VLP的抗体效价。单次鼻接种在血清中诱导出高且长持久的抗-HPV16VLP的IgG效价，以及在阴道清洗液中的特异IgG和IgA效价。这些抗体效价与在用原始PhoPeLI菌林双鼻接种后诱导的效价类似，但主要的提高是它们比用原始PhoP。LI菌抹单鼻接种获得的效价高一到两个数量级(4,31)。引起关注的是，用PhoPcLlS的口接种同样是高免疫原性的，虽然比鼻接种低，而即使用原始PhoPc菌抹两次口接种也是无效的(31)。两次鼻或三次口剂量的PhoPeLIS(数据未示出)的给予没有提高免疫应答。在用表达该HPV16L1S基因的不同减毒的Sa/iT2072e/^e/^e/v'ca血清变型Typhimurium菌林鼻或口接种后抗-HPV16VLP的系统抗体发明人先前已示出用表达原始LI编码质粒的不同减毒的AS^Zmo刀a/7ae刀fe"-ca血清变型Typhimurium菌林鼻接种小鼠仅诱导出低或没有抗-HPV16VLPs抗体(4)。已知用表达LIS编码质粒的PhoP。菌抹观察到高免疫原性，我们进一步将此质粒引入包括％4989、A4990、PhoP"和AroA的不同菌抹(准确的减毒作用物，缩写和参考文献见表l)。在图5中示出在用这些新重组菌林单次鼻或口接种后7周在小鼠中测量的该抗-HVP16VLPIgG效价。与我们先前的观察相反，在单次鼻接种后所有该新重组菌林诱导出一致的抗-HPV16VLP体液反应，虽然其效价比用PhoPcLIS菌抹获得的效价低约一个数量级(见图4)。如所预期的，口免疫的免疫原性较低，但AroALIS菌抹除外，其在两种途径接种后诱导出类似的抗-HPV16VLPIgG效价。实施例2质粒构建和所用的细菌菌林在质粒pFS14nsdHPV16-L1S[Baud,2004#1439]中，如下用卡那霉素抗性编码序列替换氨苄青霉素抗性编码序列。用pET-9a(Novagen)质粒DNA作为模板通过PCR产生含有卡那霉素编码序列和启动子的SacII-XbaI片断。所用的引物是位于从卡那霉素第一个ATG上游54个核苦酸处且含有SacII限制性位点(加下划线)的25-mer引物5，-GGGCCGCGGTGGTCATGAACAATAA-3',和含有Xbal限制性位点(力口下划线)的28-mer引物5，-GGGTCTAGAAGCTGTCAAACATGAGAAT-3，。用Expand高保真PCR(ExpandHighFidelityPCR)(RocheMolecularBiochemicals)通过反向PCR产生含有整个pFSl4nsdHPV16-L1S质粒序列，但没有氨千青霉素抗性基因的另一SacII-XbaI大片段，用以下引物位于从氨节青霉素的ATG上游92个核苷酸处且含有SacII位点(力。下划线)的28-mer引物5，-GGGCCGCGGTTTGTAGAAACGCAAAAAG-3,和含有Xbal位点(加下划线)及氨千青霉素的终止密码子(粗体)的28-mer引物5'-GGGTCTAGATCCTAACTGTCAGACCAAG-3，。将该两个SacII-Xbal片断连接在一起以产生质粒pFS14nsd-kan3-HPV16-LIS。通过电穿孑L[Schddel，1990b#242]将该新质粒引入经减毒的SaZmo"6Z^e"&Wca血清变型Typhimurium菌抹PhoPc,(CS022[Miller,1990#181])、PhoP-(CS015[Miller，1989#178])、和AaroA(SL7207[Hoiseth，1981#123])，及引入该经减毒的6^Zmo刀e7/ae刀"Wca血清变型TyphiTy800[Hohmann，1996#596]CVD908htrA[Tacket，1997#643〗和Ty21a([Ger腦nier，1975#103]，Bernabiotech，Switzerland)。hpv16l1和vlp分析使用抗-HPV16LlmAb，CAMVIR-1(Anawa)通过如先前所述[Nardellihaefliger,1997#742]的蛋白质印迹分析Ll在SaZmoi3e7hlysates中的表达。将数据归一化为在细菌中的含量。使用识别在HPV16VLPs、H16E70或H161A和H16V5上的构象性抗原决定部位的两种单克隆抗体[Christensen，1996#1053],通过如先前所述的夹心酶联免疫吸附测定法测量该HPV16VLP的含量[Benyacoub，1999#1050]。小鼠的免疫，抗-hpv16vlp抗体的分析及^a7/22ozzeWa回收在所有试验中使用来自法国IffaCredo的六周龄雌性，BALB/c小鼠。在如先前所述的麻醉下[Hopkins,1995#381;Nardellihaefliger，1997#742]，胃灌(109CFU)或鼻滴(107-9CFU)月^用20k1的细菌4妄种物。4要月、早期净艮道[Hopkins，1995#381;Nardellihaefliger,1997#742]进行血液和阴道清洗液取样以及通过酶联免疫吸附测定法测定抗-HPV16VLP抗体效价。按照先前的描述[Nardellihaefliger，1997#742],测定在来自安乐死的小鼠的器官中的Sa/TTJOZze/Zae"fe/7'ca血清变型Typhimurium或Typhi的回^:。中和分析按照在[PastranaDV，2004#1429]中的详纟曰描述，用分泌的碱性磷酸酶(SEAP)HPV16假病毒进行中和分析。筒要地，用两倍连续血清稀释物将稀释2000倍的optiprep纯化的SEAPHPV16，支病毒在水上培育1小时，用该假病毒-抗体混合物感染293TT细胞3天。使用GreatESCAPESEAPChemiluminescenceKit(BDClontech)测定在1Opl澄清的细胞上清夜中的SEAP含量。将中和效价定义为引起SEAP活性(100。/qSEAP活性在50至100相对光照单位的范围)至少50%降低的最高血清稀释的倒数。增殖分析通过如先前所述[Balmelli,2002#1357]的机械解离分离脾细胞。依照制造商的用法说明书用抗-CD4+-涂覆的微珠(MiltenyiBiotec，Galdbach，德国)通过石兹性抗体细月包分选(MACS)来纯化CD4+T细胞。用单独的或具有刀豆球蛋白A(2.5[ig/ml)的培养基作为阴性和阳性对照，以及用HPV16VLPs(2jig/ml，GMP制备)和鞭毛蛋白(10pg/ml，纯化自Ty21a),将来自天然或经免疫的小鼠的004+T细胞培育三天，然后在一夜内将0.5jiCurie的3Hthimidine加入并以每分钟计数(cpm)测量参入。在卡那霉素抗性PhoPc菌抹中HPV16LlS的表达及质粒稳定性通过由卡那霉素选择性基因替换在原始pFSnsdHPV16LIS[Baud,2004#1439]中的氨千青霉素抗性基因构建表达HPV16L1S的卡那霉素抗性质粒。使用反向PCR方法来扩增该氨千青霉素抗性基因序列两侧的该整个质粒，并将该所得片断与卡那霉素抗性编码序列连冲姿(详见材料和方法)。该所得质粒标记为pFSnsd-kanLIS,并在PhoPc中电穿孔以产生PhoPc-kanLlS(缩写和在本研究中使用的菌抹的参考文献见表1A)。如所期望的，在该新菌抹中HPV16VLPs的体外表达与在氨千青霉素抗性菌抹PhoPc—LIS(约1(VgVLPs/1011CFU，[Baud，2004#1439])中测量的表达类似。在两菌抹间同样观察到类似的生长速率，用约7小时来达到对数中期，且质粒稳定性非常高，在不存在抗生素时，四个连续过夜培养后几乎100%的细菌仍包含该质粒。与该氨苄青霉素质粒相比，该kanL1S质粒的稳定性在体内增加，在所有检测的器官中，在口免疫和此后两周所有细菌包含该kanL1S质粒(见表2A)。用携带kanLlS编码质粒的PhoPc、PhoP陽和AroA口免疫后的抗-HPV16VLPs体液反应进一步将该kanLIS质粒引入两个经减毒的Sa/moz^/hez^eWca血清变型Typhimurium菌林PhoP墨和AroA(见表1A)，已表明其在^jA230i3e7he"&Wca血清变型Typhi疫苗菌抹中的减毒突变在人类中是安全的。用三个重组6^Zmoze77sei2&Wca血清变型Typhimurium菌抹通过口服进入三个5至10个小鼠的组免疫一次，并在免疫后6周比较在血清和阴道清洗液中的HPV16VLPs特异抗体反应(见图6)。引起关注的是，通过AroAkanLlS菌抹诱导的该抗-VLP抗体效价似乎与通过PhoPckanL1S和通过前面的PhoPeL1S菌抹诱导的效价同样高[Baud,2004#1439]。这些抗体效价在至少四个月内是稳定的(数据未示出)。相反，正如以前对于Phop-L1S所报道，通过PhoP-kanL1S诱导的该抗-VLPs抗体效价较低，[Baud,2004#1439]。同样在用PhoPc和AroakanLIS免疫的小鼠的阴道分泌物中诱导出HPV16VLP特异IgG和IgA，但是在PhoP-kanL1S后没有检测到。在使用口免疫的小鼠模型中获得的这些数据表明包含Aaro缺失的重组Sa/mo72e77aei^erica血清变型Typhi可能比包含APhoP/phoQ缺失的那些的免疫原性更南。在三个^a/7nane/7ae/^ar/ca血清变型Typhi疫苗菌林中kanLIS质粒的表达和稳定性我们将该kanLIS质粒引入对于我们可以得到的三个Sa7737073e77aei3,eWca血清变型Typhi疫苗菌抹，即，Ty800(APhoP/phoQ，[Hohmann,1996#596〗)、CVD908-htrA(AaroC，AaroD，htraA,[Tacket，1997弁643])和Ty21a[Germanier，1975#103](已获得许可的typhoid疫苗菌林)(缩写和参考文献见表1A)。在此三菌抹中VLPs的体外表达类似(20至3CVgVLP/1011kanL1S质粒的稳定性(见图7)。与以前用Sa/moneWae"力en'ca血清变型Typhimurium菌林的结果相反，在该疫苗菌抹中观察到较低的kanL1S质粒稳定性。在第二个过夜后发生质粒的緩慢丟失，但是在五个连续过夜后，在Ty21akanL1S、Ty800kanL1S和CVD908-htrAkanLISA中该质粒仍然分别在9、7和18%的细菌中保留。在人类中5^//330i2e_//aez^eWca血清变型Typhi疫苗菌株仅进行有限的循环(rounds)或复制并且，它们在小鼠中通过口服进入是非侵入性的。如通过重组CVD908htrA显示，如果通过鼻途径以高的剂量服用该细菌，可以短期感染小鼠[Pickett,2000#1158][Pasetti，2000#1494]。由此在用109CFU的CVD908-htrAkanLlS和Ty21akanL1S或107CFU的Ty800kanL1S鼻内免疫后一周，我们检测了从小鼠的肺和脾回收的Sa7znc^e77a中kanL1S质粒稳定性。后面的菌林只能以低的剂量给药，因为否则其对于小鼠是致死的，与在小鼠中用猪胃教蛋白腹膜内注射这样的PhoPQ缺失细菌后的先前发现一致[Baker，1997#659]。引起关注的是，在Ty21akanL1S免疫后从肺回收的所有细菌都包含该kanLIS,而在Ty800kanLIS和CVD908-htrAkanL1S免疫后极少(分別为7.9和0.8%)包含该kanL1S质粒(见表3)。这表明在鼻鼠科动物模型中该kanL1S质粒在Ty21a中比在其它测试的SaZmoae/he72力ehca血清变形Typhi疫苗菌抹中更稳定。在鼻内鼠科动物模型中，通过表达HPV16VLPs的i5a77Z20i2e77ae/^e/7'ca血清变型Typhi疫苗菌林诱导的体液的和细胞的免疫应々合在两个每月一次的间隔鼻内用药后(对于CVD908-htra和Ty21a为109CFU,及对于Ty800重组菌林为107CFU)，在多组5至10个雌性BALB/c小鼠中，评价三个重组6^Zmozze77aez^eWca血清变型Typhi菌抹的免疫原性。在血清中测量八周抗该异源HPV16VLP抗原以及抗两个同源抗原LPS和鞭毛蛋白的IgG效价(见图8)。引起关注的是，仅在用Ty21akanL1S的两次免疫后诱导出高抗-VLPIgG效价，而由两种其它菌株诱导出低或几乎不能冲全观'J的效1^介。一目反，Ty800kanL1S牙口CVD908htrakanLlS"i秀导出比Ty21kanLIS(在第8周时p〈0.01)高的抗-LPS和抗-鞭毛蛋白IgG效价，这表明前两个重组菌林已成功地感染小鼠并诱导出抗同源抗原的体液反应。T辅助应答(Thelperresponses)参与产生和维持高抗体效价，因此同样检测了抗鞭毛蛋白和HPV16VLPs的细胞免疫应答。在免疫八周后，将该小鼠杀死并用从脾纯化004+T细胞测量抗原特异增殖(见图9)。仅在用Ty21akanLIS(p<O.OOl)两次鼻内接种后显著地诱导出004+T细胞的HPV16VLP刺激，这与抗-HPV16VLPs效价的诱导一致。相反，仅在用Ty800kanLlS(pO.OOl)接种后冲佥测出CD4+T细胞的显著的鞭毛蛋白特异刺激。在仅用Ty21akanL1S或在初始时用皮下VLP用药免疫的小鼠的血清或生殖分泌物中诱导HPV16-中和效价。在第0和4周，额外组的5个雌性BALB/c小鼠接受了两次Ty21kanLIS(ca.109CFU)的鼻用药，在8周时进行血液和阴道分泌物的取样。在血清和阴道分泌物两者中，通过酶联免疫吸附测定法和SEAPHPV16假病毒中和分析分别测定抗画HPV16VLP和HPV16-中和抗体效价(见图IOA)。如先前所报道的，在用重组iS^Zmoi3e77aez^erica血清变型typhimuriumL1S菌才朱免疫后，该HPV16-中和效价比该抗-VLP酶联免疫吸附测定法效价稍低[Baud,2004#1439]。此外，我们在此示出在阴道分泌物中i秀导出抗-HPV16VLPIgGs和IgAs,并且那些分泌物含有HPV16-中和抗体(见图10-B)。我们还研究了用lpg经纯化的VLPs的皮下(s.c.)引发，对通过用Ty21akanL1S的次优免疫(即单次109CFU鼻用药)诱导的免疫应答的影响。数据显示(图ll)用lpgVLPs的皮下引发的确导致在血清中抗-VLPIgG效价的显著增长，伴随单一Ty21akanLIS(p<0.01,与没有VLP引发相比)的鼻增长。相反，在诱导出的抗-VLP阴道IgG中没有统计学上的差别，而当将VLP和Ty21akanL1S都给药日于，仅诱导出抗-VLP阴道IgA。中和效价有待测定。参考文献1.Andre，S.,B.Seed,J.Eberle，W.Schraut，A.Bultmann,andJ.Haas.1998.IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgpl20sequencewithoptimizedcodonusage.J.Virol.72:1497-1503.2.Balmelli,C，R.Roden，A.Potts,J.Schiller,P.DeGrandi，andD.Nardelli-Haefliger.1998.Nasalimmuniz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的稳定性，以便提高该所得Sa/i230i2e/7a菌林的免疫原性。14.根据权利要求l所述的核酸，其中已将506个原始密码子中的163个改变。15.—种重组质粒载体，其含有如在SEQIDNO:l中所示的DNA序列。16.根据权利要求15所述的重组质粒载体，其中所述载体是pFS14nsd-HPV16LlS或pFSnsd-HPV16kanL1S。17.—种提高原核微生物对人乳头瘤病毒16(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步骤a.通过修饰密码子选择，合成如在SEQIDNO:l中所示的编码抗原HPV16Ll蛋白的新核酸，b.通过替换在质粒载体pFS14nsdHPV16Ll或pFS14nsdHPV16kanL1S中的原始HPV16L1基因，构建包含如在SEQIDNO:l中所示的DNA序列的重组pFS14nsdHPV16LlS载体，c.将该来自步骤(b)的重组质粒载体引入经减毒的微生物以获得重组接种物，和d.在小鼠中给予重组接种物。18.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤(c)中，重组质粒载体的引入通过电穿孔进行。19.一种提高Sa//230i3e//a菌抹对人乳头瘤病毒16型(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步骤a.通过修饰密码子选择，合成编码抗原HPV16Ll蛋白的新核酸SEQIDNO:i，b.通过替换在质粒载体pFS14nsdHPV16Ll中的原始HPV16L1基因，构建包含如在SEQIDNO:1中所示的DNA序列的重组pFS14nsdHPV16LlS载体，c.将该来自步骤(b)的重组质粒载体引入经减毒的Sa/720"e77a菌才朱以获得重组接种物，和d.在小鼠中给予重组接种物。20.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤(c)中，重组质粒载体的引入通过电穿孔进行。21.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤(c)中，该Sa7i730"e77a菌林选自由*9aZmoi2e77aei3ferica血清变型TyphimuriumPhoPc(CS022)、SaA30i2e/7aei^ei7'ca血清变型TyphimuriumPhoP一(CS015)、AS^/mooeT/ie刀力erica血；青变型Typhimuriumx4989(AcyaAcrp-cdt和AaroA(SL7207))和Sa7i32o"e77aei2&Wca血清变型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty800组成的组中。22.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤(d)中，该基于6'aAno"e7/a的抗HPV16疫苗的给药模型可以选自由口、内鼻、阴道或直肠组成的组中。23.根据任一前述权利要求所述的原核微生物的减毒抹，在制备用于乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的预防或治疗处理的药物中的用途。全文摘要本发明涉及如在SEQIDNO1中提供的编码抗原HPV16L1蛋白的一种新核酸序列(HPV16L1S)，其中所述序列具有至少一个经修饰的密码子，以在原核微生物中转化时优化重组质粒载体的稳定性，以提高该所得原核微生物的免疫原性，本发明进一步涉及构建包含SEQIDNO1的重组载体pFS14nsdHPV16L1和pFS14nsdHPV16kanL1S，其中前者带有氨卞青霉素和后者带有卡那霉素作为选择标记。本发明还涉及用编码HPV16(人乳头瘤病毒)主要衣壳蛋白并表达该相应蛋白的核酸转化的原核微生物的减毒株。另外，本发明公开一种基于原核微生物生产用于治疗乳头瘤病毒感染和相关的癌变危险的疫苗的方法。文档编号C12N15/63GK101115766SQ200580027887公开日2008年1月30日申请日期2005年6月20日优先权日2004年6月18日发明者丹尼斯·纳尔戴里申请人:印度免疫有限公司