突触核蛋白病以及淀粉样变性病的预防和治疗的制作方法

专利名称：突触核蛋白病以及淀粉样变性病的预防和治疗的制作方法
相关申请的交叉引用本申请是2005年7月19日提交的11/185907申请的部分继续，其是2004年8月9日提交的10/915,214申请的部分继续，其是2003年10月31日提交的10/699,517和2003年10月31日提交的10/698,099申请的部分继续，二者根据35U.S.C.§119(e)要求2002年11月1日提交的60/423,012申请的优先权。上述申请在此处引入作为通用的参考。
背景技术：
α-突触核蛋白(αSN)脑病理学是若干包括帕金森氏症(PD)，具有Lewy体的痴呆(DLB)，阿尔茨海默氏病的Lewy体变体(LBVAD)，多系统萎缩症(MSA)和具有脑铁累积1型的神经退行性病变(NBIA-I)的神经退行性疾病的显著特征。所有这些称作突触核蛋白病变的疾病的共有特征是神经元和神经胶质中不溶性蛋白包涵体，所述包涵体主要由αSN构成。
Lewy体和Lewy轴突是主要由αSN构成的神经元内包涵体。Lewy体和Lewy轴突是帕金森氏症(PD)的神经病理学标志。PD及其它突触核蛋白病已经被总称为Lewy体病(LBD)。LBD的特征在于多巴胺能系统的退化，运动的变化，认知损伤以及形成Lewy体(LBs)。(McKeith等，Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewybodies(DLB)Report of the CDLB International Workshop，Neurology(1996)471113-24)。其它LBDs包括弥漫性Lewy体病(DLBD)，阿尔茨海默氏病的Lewy体变体(LBVAD)，合并的PD和阿尔茨海默氏病(AD)，以及多系统萎缩症。具有Lewy体的痴呆(DLB)是调解术语LBDs中的差异的标准术语。
具有LBs的失调继续成为老年人运动障碍和认知损伤的普遍原因(Galasko等，Clinical-neuropathological correlations in Alzheimer′sdisease and related dementias.Arch.Neurol.(1994)51888-95)。尽管其发病率持续提高，产生严重的公共卫生问题，但是迄今为止这些失调既没有治愈的也不能预防，并且对PD的病因和发病机理的理解对于发展新型治疗是很关键的(Tanner等，Epidemiology of Parkinson′s diseaseand akinetic syndromes，Curr.Opin.Neurol.(2000)13427-30)。PD的病因是很有争议的并且多种因素已经被认为是具有一定的作用，包括多种神经毒素以及遗传敏感因素。
最近几年中，出现了对PD的发病机理的了解的新的期盼。具体地，若干研究已经表明突触蛋白α-SN在PD发病中起着重要作用，因为(1)该蛋白在LBs中累积(Spillantini等，Nature(1997)388839-40；Takedsi等，AM.J.Pathol.(1998)152367-72；Wakabayashi等，Neurosci.Lett.(1997)23945-8)，(2)在α-SN基因中的突变与稀有家族形式的震颤麻痹共-隔离(Kruger等，Nature Gen.(1998)18106-8；PolymeropoulosMH，等，Science(1997)2762045-7)以及，(3)在模拟PD的若干病理学方面的转基因小鼠(Masliah等，Science(2000)2871265-9)以及果蝇(feany等，Nature(2000)404394-8)中过表达。因此，α-SN在脑中聚集的事实与诸如人，小鼠以及蝇的广泛物种中类似的形态学以及神经学变化表明这个分子与PD的发展有关。
以前确定的作为AD淀粉样斑的成分的α-SN片段被命名为AD淀粉样蛋白的非-淀粉样-β(非-Aβ)组分(NAC)(Iwai A.，Biochim.Biophys.Acta(2000)150295-109)；Masliah等，AM.J.Pathol(1996)148201-10；Ueda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)9011282-6)。尽管NAC的确切功能是未知的，其却在突触事件中，诸如发育期间的神经可塑性，学习以及LBD，AD及其它病症的病理学条件下神经末梢的退化中发挥重要的作用(Hasimoto等，Alpha-Sunuclein in Lewy body disease andAlzheimer’s disease，Brain Pathol(1999)9707-20；Masliah，等(2000))。
AD，PD以及具有Lewy体的痴呆(DLB)是老年人最常发现的神经退行性病症。尽管发病率持续提高，产生严重的公共卫生问题，迄今为止这些病症既不能治愈也不能预防。最近的流行病学的研究已经显示了AD和PD之间紧密的临床关系，因为约30％的阿尔茨海默病人也患有PD。因此，与其余的老年人群相比，患有AD的病人更可能发展伴发的PD。此外，发狂的PD病人通常已经发展了典型的AD。尽管每一神经退行性疾病似乎都有发生在特定的脑区域和细胞群体，产生不同的病理学特征的偏好，PD、AD、DLB和LBD也共有常见的病理学标记。患有家族AD，唐氏综合征或者散发AD的病人在扁桃体上发展LBs，是PD的典型神经病理学标记。另外，其中的每一种疾病都与神经元，神经元间突触连接以及最终的细胞死亡，缺失神经递质，以及异常聚集异常折叠的蛋白有关，所述异常折叠的蛋白前体参与正常的中枢神经系统功能。生化研究已经证实了AD，PD和DLB之间的联系。
作为AD的典型病理学标志的神经炎斑包含β-淀粉样蛋白(Aβ)肽和非-β淀粉样蛋白组分(NAC)肽。Aβ源自于称作淀粉样前体蛋白(APP)的较大前体蛋白。NAC源自于称作APP的非-β淀粉样蛋白组分的较大前体蛋白，现在更普通称为α-SN。NAC包含α-SN的60-87或者61-95氨基酸残基。Aβ和NAC首先是在淀粉样斑中作为他们各自的全长蛋白质的分解蛋白的片段被鉴定出来的，鉴定并克隆了全长蛋白质的全长cDNA。
α-SN属于包括β-和γ-突触核蛋白和synoretin的蛋白质的大家族。α-SN表达为与突触有关的正常状态并且被认为是在神经可塑性，学习和记忆中起一定作用。人(h)α-SN中加强α-SN的聚集的突变已经被鉴定出来(Ala30Pro和Ala53Thr)并且与PD的常染色体显性形式的稀有形式相关。这些突变加强α-SN聚集的倾向的机制是未知的。
尽管在人群中可以发现APP和α-SN中的大量突变，AD和PD的典型病例却是散发性的。这些疾病的最频繁的散发形式分别与Aβ和α-SN的异常累积有关。然而，这些蛋白质的过量累积的原因却是未知的。ABAβ分泌自神经元并累积在细胞外淀粉样蛋白斑中。另外，Aβ可以在神经元内部检测到。α-SN累积在神经元内包涵体中，称作LBs。虽然这2种蛋白通常一起存在于细胞外神经炎AD斑中，他们还偶而一起存在于胞内包涵体中。
α-SN累积引起神经退行性病变以及PD的特征症状的机制还不清楚。然而，鉴定促进和/或阻断α-SN聚集的因子的功用是理解LBD发病机理以及开发用于其相关症的新型治疗的关键。对鉴定治疗的研究已经集中到寻找降低α-SN聚集的化合物(Hashimoto，等)或者检验促进多巴胺能神经元的再生和/或存活的生长因子上，所述多巴胺能神经元是主要受到影响的细胞(Djaldetti等，New therapies for Parkinson′sdisease，J.Neurol(2001)248357-62；Kirik et al，Long-termrAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson′s modelintrastriatal but not intranigral transduction promotes functionalregeneration in the lesioned nigrostriatal system，J.Neurosci(2000)204686-4700)。对于AD的转基因小鼠模型的新近研究显示针对Aβ1-42的抗体促进并刺激淀粉样蛋白从脑中去除，改善AD-样病理学并引起认识能力的改善(Schenk等，Immunization withamyloid-βattenuates Alzheimer-disease-like pathology in PDAPP mouse，Nature(1999)408173-177；Morgan et al，A-beta peptide vaccinationprevents memory loss in an animal model of Alzheimer′s disease，Nature(2000)408982-985；Janus et al，A-beta peptide immunizationreduces behavioral impairment and plaques in amodel of Alzheimer′sdisease，Nature(2000)408979-82)。与阿尔茨海默氏病人脑中发现的细胞外淀粉样斑相比，Lewy体是胞内的，并且抗体通常不进入细胞。
令人吃惊地，考虑到LBs在脑组织中的胞内特性，本发明人成功降低了用突触核蛋白免疫的转基因小鼠体内包涵体的数目。本发明尤其涉及通过在使病人产生有益的免疫应答的条件下施用突触核蛋白，突触核蛋白的片段，模拟突触核蛋白或者其片段的抗原，或者突触核蛋白的某些表位的抗体治疗PD及其他与LBs有关的疾病。本发明人还令人惊讶地成功降低了用Aβ免疫的转基因小鼠体内的包涵体的数目。本发明尤其涉及通过在使病人产生有益的免疫应答的条件下施用Aβ，Aβ的片段，模拟Aβ或者其片段的抗原，或者Aβ的某些表位的抗体治疗PD及其他与LBs有关的疾病。因此，本发明实现了对神经病理学以及某些病人与PD及其他与LBs有关的疾病有关的认知损伤的预防和缓解的治疗方案的长期需要。
相关申请09/585,817(2000年6月13日提交的)，60/137,010(1999年6月1日提交的)，09/580,015(2000年5月26日提交的)以及10/698,099(2003年10月31日提交的)在此全文引入作为通用的参考。
发明概述一个方面，本发明提供了预防或治疗特征在于在脑内聚集Lewy体或者α-SN的疾病的方法。这样的方法需要诱导针对α-SN的免疫原性应答。这样的诱导可通过主动施用免疫原或被动施用突触核蛋白的抗体或抗体的衍生物实现。在一些方法中，病人是无症状的。在一些方法中，病人患有疾病并且是无症状的。在一些方法中，病人具有患病的危险因素并且是无症状的。在一些方法中，该疾病是帕金森氏症。在一些方法中，该疾病是帕金森氏症，并且施用药剂改善了病人的运动特征。在一些方法中，该疾病是帕金森氏症，并且施用药剂预防了病人的运动特征的退化。在一些方法中，该病人未患阿尔茨海默氏病。为了治疗在脑中具有Lewy体或α-SN聚集的病人，一个治疗方案需要给病人施用一剂量的α-SN或其活性片段来诱导免疫应答。在一些方法中，在至少6个月的时间内多剂量施用α-SN或其活性片段。α-SN或其活性片段例如可以经末梢，腹膜内，口服，皮下，头盖骨内，肌内，局部，鼻内或者静脉内施用。在一些方法中，α-SN或其活性片段与加强针对α-SN或其活性片段的免疫应答的佐剂一起施用。在一些方法中，免疫原性应答包括针对α-SN或其活性片段的抗体。
在一些方法中，药剂是α-SN的氨基酸35-65。在一些方法中，药剂包括α-SN的氨基酸130-140并且具有合计小于40个氨基酸。在一些方法中，该药剂包含α-SN的氨基酸130-136并且具有小于总计40个氨基酸。在一些方法中，药剂的C-末端氨基酸是α-SN的C-末端氨基酸。在一些上述的方法中，α-SN或活性片段在α-SN或活性片段的N-末端与载体连接。在一些方法中，该药剂包含α-SN的氨基酸1-10并且具有小于总计40个氨基酸。在一些方法中，该药剂的N-末端氨基酸是α-SN的N-末端氨基酸。在一些上述的方法中，α-SN或活性片段在α-SN或活性片段的C-末端与载体连接。一些上述的方法中，α-SN或活性片段与载体分子连接形成结合物。在一些方法中，通过施用编码包含α-SN片段的多肽的多核苷酸将该药剂施用于病人。
为了治疗患有在脑内聚集Lewy体或α-SN的病人，一个治疗方案需要给病人施用一定剂量的α-SN或活性片段的抗体来诱导免疫应答。使用的抗体可以是人，人源化，嵌合，或多克隆抗体并且可以是单克隆或多克隆的。在一些方法中，抗体的同种型是人IgG1。在一些方法中，从用α-SN肽免疫的人制备抗体并且所述人可以是用抗体治疗的病人。在一些方法中，抗体结合具有Lewy体的神经元细胞的外表面由此将Lewy体消散。在一些方法中，抗体被内在化在具有Lewy体的神经元细胞内由此将Lewy体消散。
在一些方法中，与药用载体一起作为药物组合物的形式施用抗体。在一些方法中，以0.0001至100mg/kg，优选至少1mg/kg体重抗体的剂量施用抗体。在一些方法中，在延长的时间内例如至少6个月内多剂量施用抗体。在一些方法中，可以缓释组合物的形式施用。例如可以经末梢，腹膜内，口服，皮下，头盖骨内，肌内，局部，鼻内或者静脉内施用抗体。在一些方法中，监控病人血液中所施用的抗体的水平。
在一些方法中，通过给病人施用编码至少一个抗体链的多核苷酸施用抗体。表达多核苷酸产生病人体内的抗体链。任选地，多核苷酸编码抗体的重链和轻链并且表达多核苷酸产生病人体内的重链和轻链。
本发明更进一步地提供了药物组合物，包括本申请中描述的任一α-SN的抗体以及药用载体。
另一方面，本发明提供了预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-SN的疾病的方法，包括施用诱导针对α-SN的免疫原性应答的药剂，更进一步地包括施用诱导病人针对Aβ的免疫原性应答的第二药剂。在一些方法中，该药剂是Aβ或其活性片段。在一些方法中，该药剂是Aβ的抗体。
另一方面，本发明提供了预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-SN的疾病的方法，包括给病人施用诱导针对Aβ的免疫原性应答的药剂。在一些方法中，该药剂是Aβ或其活性片段。在一些方法中，该药剂是Aβ的抗体。在一些方法中，该疾病是帕金森氏症。在一些方法中，该病人未患阿尔茨海默氏病并且没有患该病的危险因素。在一些方法中，更进一步地包含监控病人帕金森氏症的病征或症状。在一些方法中，该疾病是帕金森氏症并且施用该药剂引起帕金森氏症病征或症状的改善。
本发明更进一步提供了药物组合物，包括诸如如上所述的有效诱导针对病人Lewy体的组分的免疫原性应答的药剂以及药用佐剂。在一些化合物中，该药剂是α-SN或活性片段，例如，NAC或本申请中描述的任一C-末端片段。本发明还提供了含有Lewy体的组分的特异性抗体的药物组合物。
本发明还提供了药物组合物，包含有效引发针对病人淀粉样蛋白斑的突触核蛋白-NAC组分的免疫应答的药剂。一些化合物中，该药剂是α-SN或活性片段，例如NAC，本申请中描述的α突触核蛋白的任一C-末端片段，以及任选的佐剂。在其他化合物中，该药剂是特异性结合α-SN或其片段的抗体或其片段以及任选的药用载体。
在另一方面，本发明提供了筛选抗体预防或治疗与Lewy体有关的疾病的活性的方法。这样的方法需要，将表达突触核蛋白的神经元细胞与抗体接触。然后确定与未接触抗体的对照细胞相比，接触是否降低细胞中突触核蛋白的沉积。
另一方面，本发明提供了筛选预防或预防病人脑中Lewy体疾病的活性的抗体的方法。这样的方法需要将抗体与包括α-SN的至少5个连续氨基酸的多肽接触。然后确定抗体是否特异性结合多肽，特异性结合提供了抗体具有治疗疾病活性的指示。本发明更进一步提供了影响特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的预防或治疗的方法。所述方法包括给患有或处于患疾病的危相中的病人施用多肽，所述多肽包括有效诱导免疫原性应答的α-突触核蛋白的免疫原性片段，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的，由此影响疾病的预防或治疗。
任选地，α-突触核蛋白的免疫原性片段不含α突触核蛋白的1-69残基，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。任选地，免疫原性的应答包括特异性结合选自如下的表位内的人α突触核蛋白的抗体SN83-101，SN107-125，SN110-128和SN124-140，所述残基根据SEQID NO1编号。任选地，免疫原性的应答不含特异性结合所选择的表位外的人α突触核蛋白的残基的抗体。任选地，免疫原性片段具有α突触核蛋白的70-140位置之间的5-20个连续氨基酸，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。任选地，免疫原性片段具有α突触核蛋白的120-140位置之间5-20个连续的氨基酸，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。任选地，免疫原性片段包括选自如下的人α突触核蛋白片段SN87-97，SN111-121，SN114-124和SN128-136，并且包含α突触核蛋白的总计不超过40个连续的残基，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。任选地，免疫原性片段包括SN125-140，并包含α突触核蛋白的总计不超过40个连续的残基，所述残基根据SEQ ID NO1编号。任选地，免疫原性片段包括SN130-140并且包含α突触核蛋白的总计不超过40个连续残基，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。任选地，免疫原性的片段包括SN83-140，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
任选地，免疫原性片段选自SN124-140，SN125-140，SN126-140，SN127-140，SN128-140，SN129-140，SN130-140，SN131-140，SN132-140，SN133-140，SN134-140，SN135-140，SN136-140，SN137-140，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN129-139，SN130-139，SN131-139，SN132-139，SN133-139，SN134-139，SN135-139，SN136-139，SN137-139，SN124-138，SN124-138，SN125-138，SN126-138，SN127-138，SN128-138，SN129-138，SN130-138，SN131-138，SN132-138，SN133-138，SN134-138，SN135-138，SN136-138，SN124-137，SN125-137，SN126-137，SN127-137，SN128-137，SN129-137，SN130-137，SN131-137，SN132-137，SN133-137，SN134-137，SN135-137，SN124-136，SN125-136，SN126-136，SN127-136，SN128-136，SN129-136，SN130-136，SN131-136，SN132-136，SN133-136和SN134-136，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
任选地，免疫原性应答包括特异性结合选自如下的表位内的人α突触核蛋白的抗体SN1-20，SN1-21，SN1-23和SN1-40，所述残基根据SEQ ID NO1编号。任选地，免疫原性的应答不含特异性结合人α突触核蛋白SN25-69，SN25-140，SN40-69，SN40-140或者SN70-140区域内的残基的抗体。任选地，免疫原性片段具有α突触核蛋白的1-140位置之间的5-20个连续氨基酸，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。任选地，免疫原性片段具有α突触核蛋白的1和20位置之间5-20个连续的氨基酸，以及α突触核蛋白的120和140位置之间5-20个连续氨基酸，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。任选地，免疫原性片段包括α突触核蛋白的总计不超过40个连续残基，所述残基是根据SEQID NO1编号的。
任选地，免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体以及特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体。任选地，免疫原性应答包括特异性结合人α突触核蛋白的1-20残基内的表位以及人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位的抗体。任选地，免疫原性应答不包含特异性结合人α-突触核蛋白41和119残基内表位的抗体。
任选地，免疫原性片段与载体连接形成结合物。任选地，多肽包含与载体融合的免疫原性片段。任选地，免疫原性片段与载体分子在α-突触核蛋白片段的C-末端连接。任选地，多拷贝的片段与多拷贝的载体相互连接。任选地，免疫原性片段与佐剂一起施用。任选地，施用步骤影响了Lewy体的至少部分的清除。任选地，施用步骤使Lewy体解聚。任选地，施用步骤降低了突触中α突触核蛋白寡聚物的水平。任选地，施用步骤通过活化溶酶体途径清除了突触核蛋白。
任选地，通过施用单个多肽或融合蛋白诱导免疫原性应答。任选地通过施用超过一种多肽(2种多肽)诱导免疫原性应答。任选地，通过施用包括有效诱导免疫原性应答的α-突触核蛋白的第一免疫原性片段的第一多肽，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体，以及施用包括有效诱导免疫原性应答的α-突触核蛋白的第二免疫原性片段的多肽，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基，以及优选120-140残基的抗体。
任选地，通过施用两或更多多肽的组合诱导免疫原性应答。任选地，两或更多多肽共施用和/或共配制。
另一方面，本发明提供了组合物，包括含有α-突触核蛋白的第一免疫原性片段的第一多肽以及包括α-突触核蛋白的第二免疫原性片段的第二多肽，其中第一免疫原性片段可有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体的免疫原性应答，α-突触核蛋白的第二免疫原性片段可有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答。任选地，该组合物不含α-突触核蛋白的免疫原性片段，所述α-突触核蛋白包括α-突触核蛋白的25-69残基。第一和第二免疫原性片段可以物理连接(例如，作为结合物或融合蛋白)。第一和第二免疫原性片段可以共配制。
本发明更进一步地提供了影响特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的预防或治疗的方法。一个实施方案中，该方法包含给患有或者处于患疾病的危相中的病人施用有效量的抗体，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。另一实施方案中，该方法包含给患有或者处于患疾病的危相中的病人施用有效量的抗体，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-40残基内的表位，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。在另一实施方案中，该方法包括给患有或者处于患该病危相中的病人施用有效量的第一抗体和第二抗体，所述第一抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-40残基内的表位，所述第二抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。
当抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位时，任选地，抗体特异性结合人α-突触核蛋白的83-140残基内的表位，所述残基均根据SEQ ID NO1进行编号。任选地，抗体特异性结合人α突触核蛋白的120-140残基内的表位。任选地，抗体特异性结合人α突触核蛋白选自如下的片段内的表位SN83-101，SN107-125，SN110-128和SN124-140，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。
当抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-40残基内的表位时，任选地，抗体特异性结合1-20残基内的表位，或1-10残基内的表位，残基根据SEQ ID NO1进行编号。
当第一抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-40残基内的表位，第二抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位时，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号，任选地，第二抗体特异性结合人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位。任选地，第一抗体和第二抗体同时施用。任选地。第一抗体和第二抗体在相同的治疗过程中施用。
任选地，抗体是单克隆抗体。任选地，抗体是多克隆的抗体群，其缺乏与表位外的α突触核蛋白的残基特异性结合。任选地，抗体是人源化抗体。任选地，抗体是人抗体。任选地，抗体是人IgG1同种型的抗体。任选地，与药用载体一起作为药物组合物的形式施用抗体。任选地，以0.0001至100mg/kg，优选至少1mg/kg体重抗体的剂量施用抗体。任选地，在至少6个月的时间段内多剂量施用抗体。任选地，抗体作为缓释组合物的形式施用。任选地，可以经末梢内，腹膜内，口服，皮下，头盖骨内，肌内，局部，鼻内或者静脉内施用抗体。任选地中，抗体被内在化在具有Lewy体的神经元细胞内由此将Lewy体消散。任选地中，抗体结合具有Lewy体的神经元细胞的外表面由此将Lewy体消散。任选地，抗体结合神经元细胞的外表面上的α突触核蛋白促进α突触核蛋白的交联。其中施用步骤使Lewy体解聚。任选地，施用步骤降低了突触中人α突触核蛋白寡聚物的水平。任选地，施用步骤通过活化溶酶体途径清除了人α突触核蛋白。在一些方法中，该疾病是帕金森氏症。任选地，抗体特异性结合经免疫印迹确定的变性的人α-突触核蛋白。任选地，抗体特异性结合变性的人α-突触核蛋白，亲和力至少为109M-1。任选地，经免疫细胞化学确定抗体特异性结合突触。
本发明还提供了用于预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的组合物，所述组合物包括第一单克隆抗体和第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位，所述第二单克隆抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基(以及优选120-140残基)内的表位，所述残基根据SEQ IDNO1进行编号。
本发明还提供了用于预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的试剂盒，所述试剂盒包括含有抗体的第一容器，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位，以及包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基(以及优选120-140残基)内的表位的抗体的第二容器，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。
本发明更进一步地提供了影响特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的预防或治疗的方法。该方法包括给患有或者处于患疾病的危相中的病人施用有效量的药剂，所述药剂诱导包括抗体的免疫原性应答，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号，由此影响疾病的预防和治疗。任选地，免疫原性应答不含特异性结合人α突触核蛋白的1-69残基内的表位的抗体，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。任选地，免疫原性应答包括特异性结合人α突触核蛋白选自如下的片段内的表位的抗体SN83-101，SN107-125，SN110-128和SN124-140，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。
本发明更进-步地提供了筛选具有用于治疗特征在于Lewy体的疾病的活性的药剂的方法。该方法包括将该药剂与倾向于发展特征在于Lewy体疾病的转基因非人动物接触；以及确定该药剂是否影响与对照转基因非人动物相比特性的发展程度和速度。该药剂是(i)诱导特异性结合人α突触核蛋白的70-140残基内的至少一个表位的抗体的α突触核蛋白的片段或(ii)特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基的表位的抗体，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号。
任选地，转基因非人动物包括表达人α-突触核蛋白的转基因。任选地，该方法更进一步地包括筛选大量结合变性人α突触核蛋白的检验抗体以及选择最高结合水平的抗体作为药剂。任选地，该方法更进一步地包括经免疫细胞化学筛选大量结合组织切片中的突触核蛋白沉积的检验抗体以及选择最高结合水平的抗体作为药剂。
本发明更进一步地提供了使单克隆抗体8A5或6H7人源化的方法，包括确定单克隆抗体的CDR区域的氨基酸序列；选择受体抗体；以及产生包括来自单克隆抗体的CDRs以及来自受体抗体的可变区框架的人源化抗体。
本发明更进一步地提供了产生嵌合形式的单克隆抗体8A5或6H7的方法，包括确定单克隆抗体的轻链以及重链可变区的氨基酸序列；选择重链以及轻链恒定区；产生包括含有与轻链恒定区融合的轻链可变区的轻链，以及与重链恒定区融合的重链可变区的重链的嵌合抗体。


图1显示了分别与2个NAC氨基酸序列，SEQ ID NO2和SEQ IDNO3比对的α-SN的氨基酸序列(SEQ ID1)。
图2显示了来自非转基因小鼠(A，E和I试验组)，用单独的佐剂免疫的α-SN转基因小鼠(B，F，J试验组)，和用α-SN免疫的α-SN转基因小鼠，其发展了低滴度(C，G，和K试验组)和高滴定度(D，H和T试验组)的针对α-SN的抗体的免疫组织染色的脑切片。用抗α-突触核蛋白抗体对切片进行染色检测突触核蛋白的水平(A-D试验组)，用抗IgG抗体染色确定切片中存在的总IgG水平(E-H试验组)以及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，星形神经胶质细胞的标志。
图3显示了经光学显微术观察的抗mSYN多克隆抗体对转染的GT1-7细胞中突触核蛋白聚集的影响。
图4是在分析前用预免疫血清以及用(1∶50)浓度的67-10抗体处理48小时的GT1-7α-syn细胞的细胞质(C)和膜(P)中突触核蛋白水平的Western印迹。
图5显示了在非转基因，SYN，APP和SYN/APP转基因小鼠脑中Aβ1-42免疫淀粉样沉积的效果的研究结果。在APP和SYN/APP小鼠中观察到的可检测的淀粉样蛋白水平由Aβ1-42免疫降低了。
图6显示了在非转基因，SYN，APP和SYN/APP转基因小鼠脑中突触核蛋白包涵体形成后Aβ1-42免疫的效果的研究结果。在SYN和SYN/APP小鼠中可检测的突触核蛋白包涵体由Aβ1-42免疫降低了。
图7显示了抗体阻断α-SN聚集的直接的和间接的机制。
图8显示了抗体表位作图。来自显示高滴度和高亲合力抗人α-突触核蛋白抗体的小鼠的抗体使用ELISA技术进行作图。在大多数来自接种小鼠的抗血清样品中，识别的表位在人α-突触核蛋白的C-末端区域范围内。在来自CFA处理的对照血清中，没有检测到表位。
图9显示了人α-突触核蛋白免疫反应性及其他神经退行性病变标志的水平的图像分析。(A)枕叶皮层中hα-突触核蛋白阳性包涵体的平均数目。用人α-突触核蛋白接种与对照相比引起包涵体数目的显著降低。与I组相比此效果在II组小鼠中更显著。(B)额骨皮层中由突触泡蛋白-免疫活性末梢占据的神经纤维网的面积百分比。在用单独的CFA处理的转基因(tg)小鼠中，突触泡蛋白免疫标记的末梢的数目减少20％，而每个突触的突触泡蛋白免疫反应性的水平无变化。(C)枕叶皮层中CD45免疫反应性(小神经胶质标志)的水平比人α-突触核蛋白接种的小鼠的脑中稍微高一些。(D)枕叶皮层中由人-α-突触核蛋白免疫活性末梢占据的神经纤维网的面积百分比。在用人α-突触核蛋白接种的tg小鼠体内，在突触泡蛋白-免疫活性末梢中α-突触核蛋白的累积有所下降。*＝与用单独的CFA处理的人α-突触核蛋白tg小鼠相比差异显著(p＜0.05，斯氏t检验法)。
图10显示接种动物中人α-突触核蛋白和突触泡蛋白免疫反应性的水平的Western印迹分析。与用单独的CFA处理的tg小鼠的脑相比(1-3泳道)，hα-突触核蛋白接种的tg小鼠(4-6泳道)中，人α-突触核蛋白寡聚物和单体二者的水平均下降(上部的泳道)，而突触泡蛋白免疫反应性的水平在后面的组中增加(下部的泳道)。
图11显示了脑内注射抗α-突触核蛋白抗体后神经元内α-突触核蛋白聚集的分析。C-末端抗体8A5和N-末端抗体6H7具有清除效果。IgG1，IgG2a和IgG2b是同种型对照。横条代表中值。
图12显示了用单克隆抗体注射的小鼠的对侧的切片(左试验组；切片内的圆褐色点是α-突触核蛋白聚集)以及同侧(右试验组)的切片。用α-突触核蛋白的多克隆抗体进行免疫染色。对侧中神经元内α-突触核蛋白聚集是环形的。
定义术语“基本上的同一性”是指2个肽序列当诸如使用缺省缺口权重的GAP或BESTFIT程序最佳比对时，共有至少65百分比的序列同一性，优选至少80或90百分比的序列同一性，更优选，至少95百分比的序列同一性或更多(99百分比的序列同一性或更高)。不同一的残基的位置优选通过保守氨基酸取代相区分。
为了序列比较，通常，一个序列作为比较试验序列的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验以及参考序列输入电脑，如有必要指定子序列坐标并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于所指定的程序参数计算试验序列与参考序列相比的百分比序列同一性。
例如，可以通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J.MoI.Biol.48443(1970)的同源性比对算法，Pearson & Lipman，Proc.Natl Acad.Sci USA852444(1988)的相似法搜查，这些算法的计算机化实施(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或经肉眼检查(参见Ausubel等，上述))进行用于比对的序列的最佳比对。适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述在Altschul等的J.MoI.Biol.215403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件可以由National Center forBiotechnology Information(NCBI)网址公开获得。通常，默认值程序参数可用于进行序列比较，尽管还可以使用专用化参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3字码长度(W)作为默认值，期望值(E)为10，以及BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.ScL USA 89，10915(1989))。
为了将氨基酸取代化分为保守或非-保守的，对氨基酸进行如下分组，I组(疏水性侧链)正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；II组(中性亲水性侧链)cys，ser，thr；III组(酸性支链)asp，glu；IV组(碱性侧链)asn，gln，his，lys，arg；V组(影响链取向的残基)gly，pro；以及VI组(芳香烃侧链)trp，tyr，phe。保守取代包括相同类型的氨基酸之间的取代。非-保守取代构成了这些类型的一个成员交换另一个成员。
本发明的治疗剂的纯度一般满足基本上不含不希望的污染物。这意味着药剂通常至少约50％w/w(weight/重量)纯度，并且基本上不含干扰蛋白以及污染物。有时，该药剂至少为约80％w/w并且，更优选至少90或约95％w/w纯度。然而，利用常规的蛋白纯化技术，可以获得至少99％w/w的同源肽。
分子“特异性结合”靶的短语是指决定在其它生物异源群体存在下分子存在的结合反应。由此，在命名的免疫测定条件下，指定的分子优先结合特定的靶并且不以显著量结合样品中存在的其它生物物质。抗体与靶在这样的条件下特异性结合需要选择抗体对靶的特异性。多种的免疫分析形式可用来选择与特定的蛋白具有特异性免疫活性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白进行特异性免疫反应的单克隆抗体。例如参见Harlow and Lane(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，描述的可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式以及条件。两个实体之间的特异性结合是指至少106，107，108，109M-1或1010M-1的亲和性。优选亲和性大于108M-1。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”用于包括完整的抗体及其结合片段。通常，片段与它们所衍生的完整抗体竞争与抗原的特异性结合。片段包括分离的重链，轻链，Fab，Fab′F(ab′)2，Fabc以及Fv。片段经重组DNA技术，或经完整免疫球蛋白的酶或化学分离产生。术语“抗体”还包括与其它蛋白的融合蛋白化学结合或者表达为与其它蛋白的融合蛋白的一或多种免疫球蛋白链。术语“抗体”还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同重链/轻链对以及两个不同结合位点的人造杂合抗体。双特异性抗体可以经多种方法产生，包括杂交瘤的融合或者Fabl片段的连接。例如，参见Songsivilai &Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。术语“抗体”还包括重链以及轻链可变域通过间隔基连接的单链抗体。
APP695，APP751和APP770分别指由人APP基因编码的695，751和770氨基酸残基长的多肽。参见Kang等，Nature 325，773(1987)；Ponte等，特性331，525(1988)；以及Kitaguchi等，Nature 331，530(1988)。人淀粉样前体蛋白(APP)内的氨基酸根据APP770同种型的序列指定编号。诸如Aβ39，Aβ40，Aβ41，Aβ42和Aβ43的术语是指含有1-39，1-40，1-41，1-42以及1-43的氨基酸残基的Aβ肽。
“抗原”是抗体特异性结合的实体。
术语“表位”或者“抗原决定簇”抗原上B和/或T细胞应答的位点。B-细胞表位可以从连续氨基酸或者非连续的氨基酸形成，所述非连续的氨基酸由蛋白的三级折叠毗连。由连续氨基酸形成的表位通常保持暴露于变性溶剂，而由三级折叠形成的表位通常用变性溶剂处理后消失。表位通常包括独特空间构象的至少3，且更通常至少5或者8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如，X-射线晶体衍射法和2-维核磁共振。例如参见Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology，66卷，Glenn E.Morris，主编(1996)。识别相同表位的抗体可以表明抗体阻断另一个抗体与靶抗原结合的能力的单一免疫测定中进行鉴定。T-细胞识别CD8细胞约9个氨基酸的连续表位或者CD4细胞的约13-15个氨基酸。识别表位的T细胞可以通过由致敏T细胞应答表位3H-胸腺嘧啶掺入(Burke等，J.Inf.Dis.170，1110-19(1994))，由抗原依赖的杀伤(cytotoxic T lymphocyte assay，Tigges等，J.Immunol.156，3901-3910)或者通过细胞因子分泌测定的测定抗原依赖的增殖的体外分析进行鉴定。
术语“免疫的”或者“免疫”应答是发展针对受体病人的淀粉样肽的有益的体液的(抗体介导的)和/或细胞(抗原特异性T细胞或者其分泌产物介导的)。这样的应答可以是通过施用免疫原诱导的主动应答或者通过施用抗体或者致敏的T-细胞诱导的被动应答。细胞免疫应答是通过呈递与I类或者II类MHC分子相连的多肽表位激活抗原-特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞引发。该应答还可以包括单核细胞，巨噬细胞，NK细胞，嗜碱性细胞，树状细胞，星形细胞，小神经胶质细胞，嗜酸性细胞或者先天免疫的其它组分的活化。细胞介导的免疫应答的存在可以通过增殖分析(CD4+T细胞)或者CTL(细胞毒性T细胞)分析(参见上述的Burke；Tigges)确定。体液和细胞应答对于免疫原的保护性或者治疗性效果的相对贡献可以通过分别分离来自免疫的同基因动物的抗体和T-细胞以及测定第二受试者的保护性或者治疗性效果进行区分。
“免疫原性药剂”或者“免疫原”能够在给哺乳动物施用，任选与佐剂一起施用后诱导针对其自身的免疫应答。
术语“所有的-D”是指具有≥75％，≥80％，≥85％，≥90％，≥95％，以及100％D-构型氨基酸的肽。
术语“裸多核苷酸”是指不与胶状材料复合的多核苷酸。裸多核苷酸有时克隆在质粒载体中。
术语“佐剂”是指当与抗原一起施用时增加针对抗原的免疫应答，但是当单独施用时不产生针对抗原的免疫应答的化合物。助剂可以通过包括淋巴细胞募集，刺激B和/或T细胞以及刺激巨噬细胞的若干机制加强免疫应答。
术语“病人”包括接受预防或者治疗的人及其它哺乳动物受试者。
抗体之间的竞争通过分析进行确定，所述分析中试验的免疫球蛋白抑制参考抗体与共通抗原，诸如α-SN的特异性结合。很多类型的竞争性结合分析是已知的，例如固相直接或者间接放射免疫测定法(RIA)，固相直接或者间接酶免疫分析法(EIA)，夹心竞争分析(参见Stahli等，Methods in Enzymology 9242 253(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.1373614-3619(1986))；固相直接标记的分析，固相直接标记的夹心分析(参见Harlow and Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988))；利用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，Molec.Immunol.25(1)7-15(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology176546-552(1990))；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.3277-82(1990))。通常，这样的分析包括利用结合固体表面或者具有这些的任何一个的细胞的纯化抗原，未标记的测验免疫球蛋白以及标记的参比免疫球蛋白。在测验免疫球蛋白存在下通过确定结合固体表面或者细胞的标记的量测定竞争性抑制。通过竞争分析(竞争抗体)鉴定的抗体包括结合相同表位作为参比抗体的抗体以及结合足够邻近于由参比抗体结合的表位用于空间阻碍的发生的邻近的表位的抗体。通常，当竞争抗体过量存在时，将抑制参比抗体与共通抗原特异性结合的至少50％或者75％。
术语“病征”或者“临诊症状”是指由病人认知的疾病的主观征兆，诸如改变的步伐。“征兆”是指由医生观察的疾病的客观征兆。
短语“组合”当指两种或更多抗-人α-突触核蛋白抗体(即每一识别不同的表位)的施用或者两个或更多诱导抗人α-突触核蛋白的抗体反应的多肽或者免疫原的施用时，包括同时施用以及同一个疗程中的施用。同时施用药剂包括施用作为融合蛋白或者结合物(例如，彼此物理相关)的药剂，共-药剂(例如，药剂被合并或者化合成剂型，例如缓释或者贮存药剂)，作为几分钟或者2小时内分开的组合物施用，或者作为同一日分开的组合物施用。同一疗程中的施用是指给病人施用两种药剂用于治疗或者预防相同的病症。每一药剂可以一次或者多次施用。例如，可以首先施用一个药剂，然后在随后的几天或者随后的几周施用的第二药剂。类似地，2个药剂可以不止一次施用，例如连续天，隔天，隔星期或者根据其它日程表(例如，使得病人的效果预期超过单独施用任一药剂)。
以SNx-y形式命名的片段是指开始于氨基酸X并终止于氨基酸Y的α突触核蛋白的片段。这样的片段可以连接于异源多肽而不是人α突触核蛋白的其它氨基酸，因此该片段在X之前开始或者在Y后终止。
当α-突触核蛋白或者片段如上所述利用缺省参数与SEQ ID NO1最大限度比对时α-突触核蛋白或者其片段中的残基根据SEQ ED NO1编号。
“包括”一或多种描述的元件的组合物或者方法可以包括其它没有具体描述的元件。例如，包括αSN肽的组合物包括分离的α-SN肽和α-SN肽作为较大的多肽序列的组分。
发明详述I.总则本发明提供了预防或者治疗若干特征在于在病人的脑中以Lewy体的形式存在聚集成不溶性团的α-SN肽的沉积的疾病以及病症。这样的疾病总称为Lewy体疾病(LBD)，并且包括帕金森氏症(PD)。这样的疾病特征为聚集具有β-折叠结构并且用硫代黄素-S和刚果-红染色的α-SN(参见Hasimoto，Ibid)。本发明提供了利用可以产生针对α-SN的免疫原性应答的药剂预防或者治疗这样的疾病的方法。免疫原性应答用于阻止脑细胞内突触核蛋白沉积的形成的清除突触核蛋白沉积。尽管对于机制的理解对于实施本发明并不是必要的，免疫原性应答可以诱导由于单独或者连同α突触核蛋白在细胞内内在化的突触核蛋白的抗体的澄清。显示于实施例中的结果表明施用的α突触核蛋白的抗体外围跨越血脑屏障并且单独的或者与α突触核蛋白一起内在化在含有α突触核蛋白沉积的细胞内。内在化抗体可以促进α突触核蛋白经溶酶体途径的活化的降解。变性形式的具有α突触核蛋白亲和性的内在化抗体还可以将分子稳定在解聚形式。或者，抗体可以干扰突触核蛋白在细胞外表面上的聚集。例如，α-突触核蛋白的抗体可以识别并且异常交联神经元细胞表面中的适合的蛋白。在一些方法中，清除应答可以至少部分由Fc受体介导的噬菌作用的影响。用突触核蛋白免疫可以还原突触核蛋白聚集在脑中突触和神经元细胞体中。尽管对机制的理解不是实施本发明必须的，这个结果可以由被神经元细胞(例如由突触小泡)吸收的突触核蛋白的抗体解释。
任选地，产生针对α-SN的免疫原性应答的药剂可以与产生针对Aβ的免疫原性应答的药剂组合使用。免疫原性应答可用于清除个体Aβ的沉积，所述个体具有这样的沉积(例如，患有阿尔茨海默和帕金森氏症的个体)；然而，免疫原性应答还具有清除突触核蛋白沉积的活性。由此，本发明单独使用这样的药剂，或者与产生具有LBD的针对个体的α-SN免疫原性应答的药剂结合，所述个体没有患有或者处于发展阿尔茨海默氏病的危相。
本发明进一步提供了用于预防和治疗淀粉样变性疾病的药物组合物。已经显示α-和β突触核蛋白参与某些淀粉样疾病尤其是阿尔茨海默氏病中淀粉样沉积的成核现象(Clayton，D.F.，等，TINS 21(6)249-255，1998)。更具体地说，α-和β-突触核蛋白(残基61-95)的NAC功能域的片段已经从阿尔茨海默病人淀粉样的斑中分离出来；事实上这个片段包括约10％的斑，所述斑在用十二烷基硫酸钠(SDS)溶解后保持不溶性。(George，J.M.，等Neurosci.Newsl12-17，1995)。进一步，全长α-SN及其NAC片段据报道可以加速β-淀粉样肽体外聚集成不溶性淀粉样蛋白(Clayton，上文所述)。淀粉样斑的NAC组分用作本发明基于免疫治疗的靶，如下所述。根据一个方面，本发明包括含有有效引发针对病人淀粉样斑的突触核蛋白-NAC组分的免疫应答的药剂的药物组合物。这样的组合物可以有效阻止，阻碍或者降低淀粉样蛋白病中斑的沉淀。
II.产生针对α突触核蛋白的免疫原性应答的药剂免疫原性应答可以是主动的，施用免疫原诱导与病人体内的α-SN的具有反应活性的抗体时，或者是被动的，当施用本身结合病人的α-SN的抗体时。
1.诱导主动免疫应答的药剂治疗剂诱导特异性针对α-SN肽内某些表位的免疫原性应答。优选的药剂是αSN肽本身及其片段。在2003年5月提交的美国申请60/471,929以及PCT专利公开WO05/013889，在这里引入作为通用的参考，公开了可用作治疗剂，任选地与佐剂结合的新型α-突触核蛋白片段。也可以使用这样的片段的变体，诱导和/或与α-SN肽的优选表位交叉-反应的抗体的天然α-SN肽的类似物和模拟物。2003年5月19日提交的美国申请60/471,929和PCT专利公开WO05/013889，在这里引入作为通用的参考，提供了用于预防和治疗突触核蛋白病和淀粉样变性疾病的方法中的新型α-突触核蛋白。任选地，这些片段可与佐剂组合使用。
α突触核蛋白最初在人脑中被鉴定AD斑的非-β淀粉样组分(NAC)的前体蛋白(Ueda等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90(23)11282-11286(1993)。还称做AD淀粉样蛋白(NACP)的非-Aβ组分的前体的α-SN是140个氨基酸的肽。α-SN具有如下氨基酸序列MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQ ID NO1)(Uéda等，Ibid.；GenBank登录号P37840)。
AD淀粉样蛋白(NAC)的非-Aβ组分来源于α-SN。α突触核蛋白内高度疏水性功能域NAC是由至少28个氨基酸残基组成的(残基60-87)(SEQ ID NO3)以及任选地由35个氨基酸残基组成(残基61-95)(SEQ ID NO2)。参见图1。NAC显示了形成β-片状结构的倾向(Iwai，等，Biochemistry，3410139-10145)。Jensen等已经报道NAC具有如下的氨基酸序列EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV(SEQ IDNO2)(Jensen et al.，Biochem.J.310(Pt 1)91-94(1995)；GenBank登录号S56746)。
Uéda等已经报道NAC具有如下的氨基酸序列KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS(SEQ ID NO3)(Uéda等，PNAS USA 9011282-11286(1993)。
解聚的α-SN或者其片段，包括NAC是指单体肽单位。解聚的α-SN或者其片段通常是可溶性的，并且能够自我聚集形成可溶性寡聚物。α-SN及其片段的寡聚物通常是可溶性的并且主要作为α-螺旋存在。单体α-SN可以通过将冷冻干燥的肽溶解在纯DMSO中用超声波作用体外制备。离心所合成的溶液除去所有不溶性颗粒。聚集的α-SN或者包括NAC的其片段是指α-SN或者其结合成不溶性β-片层组合体的片段的寡聚物。聚集的α-SN或者其包括NAC的片段也指纤丝状聚合物。小纤维通常是不溶性的。一些抗体结合可溶性α-SN或者其片段或者聚集的α-SN或者其片段。一些抗体比单体形式或者纤丝状形式更强烈结合α-突触核蛋白的寡聚物。一些抗体结合可溶性以及聚集的α-SN或者其片段，并且任选地也为寡聚形式。
α-SN，PD的Lewy体特性的主要成分及其片段诸如，例如NAC或除了NAC的其他片段可用于诱导免疫原性应答。这样的片段优选包括α-SN或其类似物的4或更多个氨基酸。一些活性片段包括α-SN的C-末端上或其附近的表位(例如，氨基酸70-140，100-140，120-140，130-140或135-140内)。在一些活性片段中，表位的C末端残基是α-SN的C末端残基。Lewy体的其他组分，例如synphilin-1，Parkin，泛素，神经丝，β-晶状体蛋白以及其表位片段还可以用于诱导免疫原性应答。
如上所述，α-突触核蛋白的某些优选的片段来自于C-末端分子。这样的片段缺乏人α-突触核蛋白的1-69残基。用这样的片段免疫产生包括人α-突触核蛋白的70-140残基内的一或多个表位的抗体的免疫原性应答。如图8所示，免疫原性C-末端片段包括SN85-99，SN109-123，SN112-126和SN126-138，以及其他与这些中的一种在任一末端有多达2个的另外的或者更少氨基酸的片段。另一优选的片段SN83-140包括所有这些表位。α突触核蛋白的一些片段产生特异性结合人α突触核蛋白的一个或多个如下的片段内的表位的抗体SN83-101，SN107-125，SN110-128和SN124-140。一些片段产生专用于特异性结合以上所述4个片段之一内的抗体。例如，SN83-101片段开始于α-突触核蛋白的残基83，终止于残基101并仅仅产生特异性结合SN83-101的抗体。
一些片段总计具有来自α突触核蛋白的不超过40个连续的残基。一些这样的片段包括SN 125-140，SN130-140，SNS87,97，SN111-121，SN114-124或SN128-136。一些片段具有来自α突触核蛋白的C-末端半部分的总共5-20个连续氨基酸(即，残基70-140)。一些片段具有来自α突触核蛋白.的120-140之间位置的5-20个连续的氨基酸。尤其优选的片段包括SN124-140，SN125-140，SN126-140，SN127-140，SN128-140，SN 129-140，SN130-140，SN131-140，SN132-140，SN133-140，SN134-140，SN135-140，SN136-140，SN137-140，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN129-139，SN130-139，SN131-139，SN132-139，SN133-139，SN134-139，SN135-139，SN136-139，SN137-139，SN124-138，SN124-138，SN125-138，SN126-138，SN127-138，SN128-138，SN 129-138，SN130-138，SN131-138，SN132-138，SN133-138，SN134-138，SN135-138，SN136-138，S SN124-137，SN125-137，SN126-137，SN127-137，SN128-137，SN129-137，SN130-137，SN131-137，SN132-137，SN133-137，SN134-137，SN135-137，SN124-136，SN125-136，SN126-136，SN127-136，SN128-136，SN129-136，SN130-136，SN131-136，SN132-136，SN133-136和SN134-136。
可用于影响特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病(例如，帕金森氏症)的α-突触核蛋白的其他片段来自于分子的N-末端区域。用片段免疫产生包括抗体的免疫原性应答，所述抗体为残基1-20内的一或多个表位或者，有时候残基1-10内的一或多个表位的抗体。如实施例IX所示，施用识别α-突触核蛋白的氨基末端的抗体6H7似乎清除了过表达人α-突触核蛋白转基因小鼠的脑中聚集的α-突触核蛋白。可以预期用包括α-突触核蛋白氨基末端区域的α-突触核蛋白片段免疫同样将引起这样的对聚集的清除和/或阻止聚集的形成。
因此，一方面，本发明提供了通过给患有或者处于患该疾病危相中的病人施用多肽影响预防或治疗特征在于在脑中聚集Lcwy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，所述多肽包括可有效诱导包括抗体的免疫原性应答的α-突触核蛋白的免疫原性片段，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-40，1-20，或者1-10残基内的表位，所述残基根据SEQID NO1进行编号。在一个实施方案中，α-突触核蛋白的免疫原性片段不含α突触核蛋白的70-140残基。在一个实施方案中中，免疫原性片段不含α-突触核蛋白的41-140残基。在一个实施方案中，免疫原性片段不含α-突触核蛋白的25-140残基。
影响预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或者α-突触核蛋白的疾病的合适的免疫原，包括但是不局限于包括α突触核蛋白的氨基末端的5到20个连续氨基酸残基的片段。在一优选实施方案中，该片段包括α突触核蛋白的第一个(氨基末端)残基。因此，示范性的片段包括SEQ ID NO1的1至Na残基的序列，其中Na是5至20(例如，MDVFMKGLSKAKEGVVAAAE；MDVFMKGLSKAKEGVVAAA；MDVFMKGLSKAKEGVVAA；MDVFMKGLSKAKEGVVA；MDVFMKGLSKAKEGVV；MDVFMKGLSKAKEGV；MDVFMKGLSKAKEG；MDVFMKGLSKAK；MDVFMKGLSKA；MDVFMKGLSK；MDVFMKGLS；MDVFMKGL；MDVFMKG；MDVFMK；以及MDVFM。在其他的优选实施方案中，该片段不包括α突触核蛋白的氨基末端残基但是包括α突触核蛋白的第二和/或第三残基。因此，示范性的片段具有SEQ ID NO1的2至Nb的残基以及3至Nc残基的序列，其中Nb是6至21并且Nc是7至22(例如，DVFMKGLSKAKEGVVAAAEK；DVFMKGLSKAKEGVVAAAE；DVFMKGLSKAKEGVVAAA；DVFMKGLSKAKEGVVAA；DVFMKGLSKAKEGVVA；DVFMKGLSKAKEGVV；DVFMKGLSKAKEGV；DVFMKGLSKAKEG；DVFMKGLSKAK；DVFMKGLSKA；DVFMKGLSK；DVFMKGLS；DVFMKGL；DVFMKG；DVFMK；VFMKGLSKAKEGVVAAAEKT；VFMKGLSKAKEGVVAAAEK；VFMKGLSKAKEGVVAAAE；VFMKGLSKAKEGVVAAA；VFMKGLSKAKEGVVAA；VFMKGLSKAKEGVVA；VFMKGLSKAKEGVV；VFMKGLSKAKEGV；VFMKGLSKAKEG；VFMKGLSKAK；VFMKGLSKA；VFMKGLSK；VFMKGLS；VFMKGL；以及VFMKG)。如下所述，上述的片段可与载体分子相连(例如，结合物或者融合蛋白，参见II(3)节)。或者，如下所述，上述的片段可以通过用编码该片段的核酸接种受试者施用(参见II(4)节)。
参考α-SN包括如上所述天然的人氨基酸序列以及包括等位，种以及诱导的变体，全长形式及其免疫原性片段的类似物。在所有实施方案中，意味着具有与SEQ ID NO1或者其等位变体相同氨基酸序列的人α突触核蛋白是优选的。类似物通常与天然存在的肽在一个，两个或者几个位置不同，常常借助于保守性取代。类似物一般与天然的肽显示至少80或者90％的序列同一性。当对类似物以及天然的α突触核蛋白进行最大限度比对时，在天然α突触核蛋白的类似物中氨基酸的位置被赋予对应于天然α突触核蛋白中的相应氨基酸的数值。一些类似物还包括N或者C末端氨基酸一个，两个或者几个位置的非天然的氨基酸或者修饰。例如，α-SN的139位置的天然的谷氨酸残基可以用异天冬氨酸替换。非天然的氨基酸的实例是D，α，α-二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，4-羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸盐，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，ω-N-甲基精氨酸，β-丙氨酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，甲状腺素，γ-氨基丁酸，高丝氨酸，瓜氨酸以及异天冬氨酸。治疗剂还包括α-SN片段的类似物。本发明的一些治疗剂是所有的-D肽，例如，所有的Dα-SN或者所有的D NAC以及所有的D-肽类似物。类似物特异性结合天然人α突触核蛋白的多克隆抗体群。可以筛选片段以及类似物与如下所述未经处理的或者安慰剂对照相比转基因动物模型中的预防或者治疗效能。
α-SN，其片段以及类似物可以通过固相肽合成或者重组体表达或者合成或者可以获自天然来源。肽自动合成仪可从众多的供应者，诸如Applied Biosystems，Foster City，California市售获得。重组体可以表达在细菌，诸如大肠杆菌，酵母，昆虫细胞或者哺乳动物细胞中。重组体表达的方法由Sambrook等描述在Molecular CloningALaboratory Manual(CS.H.P.Press，NY 2d ed.，1989)。一些形式的α-SN肽还可以从例如BACHEM以及American Peptide Company，Inc市售获得。
治疗剂还包括例如α-SN肽的活性片段连同其他氨基酸的较长的多肽。例如，优选的药剂包括含有融合至诱导辅助T细胞针对异源氨基酸序列的应答以及B-细胞针对α-SN片段的应答的异源氨基酸序列的α-SN的片段。可以筛选这样的多肽与如下所述未经处理的或者安慰剂对照相比动物模型中的预防或者治疗效果。α-SN肽，类似物，活性片段或者其他的多肽可以结合或者多聚体的形式或者分离形式的治疗剂的方式施用，还包括单体免疫原性药剂的多聚体。发明的治疗剂可以包括聚赖氨酸序列。
在更进一步的变异中，免疫原性肽，诸如α-SN的片段可以由病毒或者细菌作为免疫原性组合物的一部分呈递。编码免疫原性肽的核酸被整合入病毒或者细菌的基因组或者游离基因。任选地，将核酸以使免疫原性肽表达为分泌性蛋白或者作为与病毒的外表面蛋白质的融合蛋白或者细菌的跨膜蛋白质从而使肽显示的方式整合。用于这样的方法的病毒或者细菌应该是不致病的或者减毒的。合适的病毒包括腺病毒，HSV，委内瑞拉马脑炎病毒及其他α病毒，水泡性口膜炎病毒及其他rhabdo病毒，牛痘以及禽痘。合适的细菌包括沙门氏菌以及志贺氏菌。免疫原性肽与HBV的HBsAg的融合尤其适合。
治疗剂还包括肽及其他与α-SN未必具有显著的氨基酸序列相似性但是作为α-SN的模拟物并诱导相似的免疫应答的化合物。例如，可以筛选所有的肽以及形成β-折叠片层的蛋白质的适应性。还可以使用针对α-SN或者其他Lewy体组分的单克隆抗体的抗独特型抗体。这样的抗-Id抗体模仿抗原并产生针对其的免疫应答(参见EssentialImmunology，Roit主编，Blackwell Scientific Publications，Palo Alto，CA第6版，181页)。除了α-SN的药剂应该诱导针对上列的α-SN的优选片段(例如NAC)中的一个或多个的免疫原性应答。这样的药剂优选诱导特异性针对这些片段之一而不是针对α-SN的其他片段的免疫原性应答。
还可以筛选肽或者其他化合物的随机文库的适应性。产生产生许多类型的以逐步方式合成的化合物的组合文库。这样的化合物包括多肽，β-转角模拟物，聚糖，磷脂，激素，前列腺素，甾体，芳族化合物，杂环化合物，苯二氮卓，寡聚N-取代的甘氨酸和寡氨基甲酸盐。化合物的较大组合文库可以由编码的合成文库(ESL)方法构建，所述方法描述于Affymax，WO 95/12608，Affymax，WO 93/06121，ColumbiaUniversity，WO 94/08051，Pharmacopeia，WO 95/35503和Scripps，WO 95/30642(每篇文献均在此处引入作为通用目的的参考)。还可以由噬菌体显示法产生肽文库。参见例如，Devlin，WO 91/18980。
最初通过确定组合文库及其他化合物结合α-SN或者其他Lewy体组分已知特异的抗体或者淋巴细胞(B或者T)的能力筛选组合文库及其他化合物的适应性。例如，可以用任一多克隆血清或者α-SN或者其片段的单克隆抗体进行最初的筛选。优选筛选文库结合特异性结合人α突触核蛋白的1-20或者70-140残基内的表位的抗体的能力。然后可以筛选化合物特异性结合α-SN内的特异性表位(例如，SN 1-20，SN83-101，SN107-125，SN110-128和SN124-140)。可以通过用于对抗体表位特异性作图的相同方法检验化合物。然后更进一步分析通过这样的筛选鉴定的化合物诱导α-SN或者其片段的抗体或者活性淋巴细胞的能力。例如，可以在已经预涂布有α-SN或者其片段的微量滴定板上检验血清的多重稀释物，可以进行标准ELISA来检验α-SN或者片段的活性抗体。然后可以如实施例所示检验化合物对易患与Lewy体的存在有关的疾病的转基因动物的预防和治疗效果。这样的动物包括例如过量表达α-SN或者其突变株(例如在53位丙氨酸至苏氨酸的置换)的转基因小鼠，描述于例如WO 98/59050，Masliah等，Science2871265-1269(2000)，和van der Putter等，J.Neuroscience206025-6029(2000)，或者还过量表达APP或者其突变株的这样的转基因小鼠。尤其优选的是具有Games等在Nature 373，523(1995)中描述的APP的717突变的突触核蛋白转基因小鼠以及具有McConlogue等在US 5,612,486和Hsiao等在Science 21A，99(1996)；Staufenbiel等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 94，13287-13292(1997)；Sturchler-Pierrat等，Proc.Natl Acad.Sci USA 94，13287-13292(1997)；Borchelt等，Neuron 19，939-945(1997))中描述的具有APP的670/671 Swedish突变的小鼠。这样的突触核蛋白/APP转基因动物的实例提供于WO01/60794。PD的其他动物模型包括6-羟基多巴胺，鱼藤酮和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)动物模型(M.Flint Beal，Nature ReviewsNeuroscience 2325-334(2001))。相同的筛选方法可用在α-SN的其他可能的类似物以及包括如上所述的α-SN的片段的较长肽及其他Lewy体组分和其类似物或者片段。
i.主动免疫引发针对α-突触核蛋白两个末端的表位的免疫应答如本申请所述，施用识别α-突触核蛋白的氨基末端以及羧基末端中的表位的抗体(即，8A5以及6H7)降低了过表达人α-突触核蛋白的转基因小鼠脑中α-突触核蛋白的聚集(参见例如实施例IX)。部分基于这些发现，可以预计诱导针对α-突触核蛋白的两个末端的表位的免疫应答将具有预防以及治疗益处。因此，一方面，本发明提供了通过诱导包括抗体的免疫原性应答预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基，或者1-10残基内的表位，以及人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位。在一个优选实施方案中，免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内以及人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位的抗体。包括针对该蛋白质的两个末端区域的表位的抗体的免疫应答可以称为“双重”免疫应答。双重免疫应答可以多种方式引发并且本发明不局限于引发这样的应答的任一特定的方法。
可以通过用单个多肽接种诱导双重免疫应答，所述多肽可以有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体以及特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答。在优选实施方案中抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-10残基和/或120-140残基内的表位。可以使用缺乏人α-突触核蛋白的至少25-69残基，人α-突触核蛋白的至少30-110残基，或者至少人-突触核蛋白的21-119残基的多肽。当使用这样的多肽时，免疫原性应答不包括特异性结合人α-突触核蛋白的25-69残基内的表位的抗体。
还可以通过在两种(或更多)多肽组合的接种诱导双重免疫应答，所述一个多肽诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体以及特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答。优选实施方案中，抗体特异性结合人α-突触核蛋白1-10残基内和/或120-140残基内的表位。因此，通过施用α-突触核蛋白的第一免疫原性片段以及第二免疫原性片段影响治疗或者预防，所述第一免疫原性片段诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体的免疫原性应答，所述第二免疫原性片段诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140(或者120-140)残基内的表位免疫原性应答。可以如上所述组合施用人α-突触核蛋白的片段(例如，作为融合蛋白或者结合物，在共药剂或者在统一疗程中施用)。
ii组合物以及试剂盒本发明提供了可用于引发针对α-突触核蛋白两个末端的表位的免疫应答的组合物。组合物包括包含诸如如上所述的两或更多多肽的剂型以及药剂，其中一个多肽诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体以及特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答。优选实施方案中，多肽诱导特异性结合人α-突触核蛋白1-10残基内和/或120-140残基内的表位的抗体。示范性的药剂(适于共配制多肽)是本领域已知的并且包括以下VII部分“治疗方案”所述的那些药剂。
本发明还提供了可用于引发针对α-突触核蛋白两个末端的表位的免疫应答的试剂盒。该试剂盒包括两或更多种药剂，所述药剂诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的抗体以及人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答。该药剂可以组合成用于同时使用的单个药剂。该药剂可以占据分离的容器(例如，小瓶，注射器，管，等等)，每一个容器包含用于同时，顺序或者分开使用的不同多肽。本发明的这些药剂任选可以与其他药剂组合施用，所述其他药剂至少部分有效治疗Lewy体疾病。试剂盒还可以包括增强本发明的药剂通过血脑屏障的药剂，其他的助剂以及用于施用给病人的材料。
2.用于被动免疫应答的药剂本发明的治疗剂还包括特异性结合α-SN或者Lewy体的其他组分的抗体。本发明还提供特异性结合淀粉样蛋白斑的突触核蛋白-NAC组分的抗体。α-SN的免疫活性抗体已知(例如参见Arima，等，Brian Res.80893-100(1998)；Crowther等，Neuroscience Lett.292128-130(2000)；Spillantini，等Nature 388839-840(1997)。这样的抗体可以是单克隆或者多克隆抗体。一些这样的抗体特异性结合α-SN的不溶性聚集，不特异性结合可溶性单体形式。一些特异性结合可溶性单体形式，并不结合不溶性聚集的形式。一些特异性结合聚集以及可溶性单体的形式。一些这样的抗体特异性结合天然存在的α-SN(例如NAC)的短形式，不结合天然存在的全长α-SN。一些抗体特异性结合长形式不结合短形式。一些抗体特异性结合α-SN，不结合LBs的其他组分。一些抗体特异性结合α-SN，不特异性结合淀粉样蛋白斑的其他组分。参见PCT专利公开WO 05/0138889以及2003年5月19日提交的美国申请60/471,929，其在此处引入作为通用的参考，提供了特异性结合α-突触核蛋白的片段不特异性结合完整的α-突触核蛋白本身的末端特异性抗体。这些抗体可用于预防以及治疗突触核蛋白病以及淀粉样蛋白病的方法。
在进行的支持本发明的实验中，预期的离体分析(实施例VII)可用于检验特异性结合突触核蛋白-NAC的抗体的清除。NAC的抗体与包含淀粉样蛋白斑以及小神经胶质细胞的脑组织样品接触。兔血清用作对照。随后的监控显示斑数目以及大小的显著减少盒降低，显示了抗体的清除活性。
由这些数据，很明显与阿尔茨海默氏病及其他淀粉样蛋白疾病有关的淀粉样蛋白斑负荷可以通过施用针对NAC的表位的免疫试剂大大减少，所述NAC的表位可有效降低淀粉样蛋白斑负荷。更进一步地，可以理解多种抗体可被用于这样的组合物。如上所述，2003年5月19日提交的美国申请60/471,929提供了特异性结合α-突触核蛋白的片段不特异性结合完整α-突触核蛋白本身的末端特异性抗体。
用于治疗学方法的抗体通常具有完整的恒定区或者至少充足的恒定区与Fc受体相互作用。优选人同种型IgG1，因为其对于吞噬细胞上的FcRI受体具有人同种型的最高亲合力。还可以使用双特异性Fab片段，其中抗体的一个臂对α-SN具有特异性，另一个臂对Fc受体具有特异性。一些抗体结合α-SN，任选变性的形式，诸如当用SDS处理时，结合亲合力大于或等于约106，107，108，109，或者1010M-1。本发明的一些抗体特异性结合突触或者神经元细胞体中的人α突触核蛋白，如免疫细胞化学确定的。
多克隆血清一般包含结合沿着α-SN的长度的若干表位的抗体混合群。然而，多克隆血清可以特异性于α-SN的特定的片段，诸如NAC。对于特定的片段具有特异性的多克隆血清包含特异性结合那些片段的抗体并且缺乏特异性结合α-SN的其他片段的抗体。单克隆抗体结合α-SN内的特异性表位，所述表位可以是构型或者非构型的表位。非构型的表位当用SDS对α-SN进行变性时保持呈现。抗体的预防和治疗效果可以利用实施例中描述的转基因动物模型方法检验，一些单克隆抗体结合NAC内的表位。一些方法中，使用对不同表位具有结合特异性的多种单克隆抗体。这样的抗体可以顺序或者同时施用。还可以使用针对除了α-SN的Lewy体组分的抗体。例如，抗体可以针对神经丝，泛素或者synphilin。治疗剂还包括针对α-SN及其片段的类似物产生的抗体。本发明的一些治疗剂是所有的-D肽，例如所有的-Dα-SN或者所有的-D NAC。
当抗体被认为结合指定残基，诸如α-SN1-5内的表位时，例如，就意味着抗体特异性结合包含该指定残基的多肽(即，该实例中的α-SN1-5)。这样一个抗体未必与α-SN1-5内的每个残基接触。用α-SN1-5的每一个氨基酸取代或者删除也不是显著影响结合亲合力所必需的。可以例如，通过形成噬菌体显示文库确定抗体的表位特异性，在所述文库中，不同的成员显示不同的α-SN子序列。然后选择噬菌体显示文库中特异性结合所检验的抗体的成员。分离序列家庭。通常，这样的家族包含不同成员中的共有的核心序列，以及不同长度的侧翼序列。显示对抗体的特异性结合的最短的核心序列限定了由抗体结合的表位。还可以检验抗体在与已经确定了表位特异性的抗体竞争分析中的表位特异性。
本发明的一些抗体特异性结合NAC内的表位。一些抗体特异性结合突触核蛋白的22-千道尔顿糖基化形式，例如P22-突触核蛋白内的表位(H.Shimura等，Science 2001 JuI 13293(5528)224-5)。
本发明的一些抗体结合α-SN N-末端的表位(例如，α-SN的1-20氨基酸或者1-10氨基酸内的表位，根据SEQ ID NO1进行编号)。一些抗体结合如下的表位表位的N-末端残基是全长α-SN的N-末端残基。这样的抗体不结合α突触核蛋白的缺失突变体，所述缺失突变体缺失残基1。一些这样的抗体不结合如下的全长α突触核蛋白N-末端氨基酸与异源多肽相连。本发明的一些抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-69残基或者1-20残基内的表位。一些抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位。一些抗体特异性结合具有选自SEQID NO1的1至Na的残基，其中Na是5至20；SEQ ID NO1的2至Nb残基，其中Nb是6至21；或者SEQ ID NO1的3-Nc残基，其中Nc是7至22的人α-突触核蛋白的片段的表位。一些抗体结合选自SN1-5，SN1-6，SN1-7，SN1-8，SN1-9，SN1-10，SN1-11，SN1-12，SN1-13，SN1-14，SN1-15，SN1-16，SN1-17，SN1-18，SN1-19以及SN1-20的人α突触核蛋白的片段内的表位。
一些抗体结合α-SN的C-末端或者附近的表位(例如，70-140，100-140，120-140，130-140或者135-140氨基酸内)。一些抗体结合如下的表位表位的C末端残基是(全长的)α-SN的C末端残基。这样的抗体不结合α突触核蛋白的缺失突变体，所述突变体缺失残基140。一些这样的抗体不结合其中C-末端氨基酸与异源多肽相连的全长α突触核蛋白。在一些方法中，抗体特异性结合NAC，不结合全长α-SN。
本发明的一些抗体特异性结合人α突触核蛋白的70-140残基或者83-140残基内的表位。一些抗体特异性结合人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位。一些抗体特异性结合具有选自83-101，107-125，110-128以及124-140的人α-突触核蛋白的片段的表位。一些抗体结合选自如下的人α突触核蛋白的片段内的表位SN124-140，SN125-140，SN126-140，SN127-140，SN128-140，SN129-140，SN130-140，SN131-140，SN132-140，SN133-140，SN134-140，SN135-140，SN136-140，SN137-140，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN129-139，SN130-139，SN131-139，SN132-139，SN133-139，SN134-139，SN135-139，SN136-139，SN137-139，SN124-138，SN124-138，SN125-138，SN126-138，SN127-138，SN128-138，SN129-138，SN130-138，SN131-138，SN132-138，SN133-138，SN134-138，SN135-138，SN136-138，SN124-137，SN125-137，SN126-137，SN127-137，SN128-137，SN129-137，SN130-137，SN131-137，SN132-137，SN133-137，SN134-137，SN135-137，SN124-136，SN125-136，SN126-136，SN127-136，SN128-136，SN 129-136，SN130-136，SN131-136，SN132-136，SN133-136以及SN134-136。
结合C-末端表位的单克隆抗体优选以例如至少108，109或者1010M-1的高亲和力结合人α突触核蛋白。
特异性结合α-SN的优选的片段不特异性结合α-SN的其他区域的单克隆或者多克隆抗体相比于结合其他的区域或者多克隆血清的单克隆抗体对完整α-SN具有很多优点。首先，对于相等的质量剂量而言，特异性结合优选的片段的抗体的剂量包含有效清除淀粉样蛋白斑的高摩尔剂量的抗体。第二，特异性结合优选片段的抗体可以诱导针对LBs的应答的清除不诱导针对完整的α-SN的应答的清除，由此降低副作用的可能性。
任选地，可以筛选抗体对于如上所述的LB病的转基因动物的预防或者治疗学活性。任选地，预筛选许多抗体与变性的人α突触核蛋白或者其片段的相对结合。可以从免疫印迹中信号的相对强度估计相对的结合亲合力。选择具有高于平均数的相对结合亲合力的抗体或者优选具有最高结合亲合力的抗体，用于在转基因动物中进行进一步筛选。可以进行相似的预筛选通过免疫细胞化学检验抗体与组织切片中α-突触核蛋白的聚集的结合。组织切片可以获自患病病人或者转基因动物模型的脑。
一个实施方案中，命名为6H7的抗体或者与6H7竞争特异性结合α突触核蛋白的抗体用于被动免疫。一个实施方案中，命名为8A5的抗体，或者与8A5竞争特异性结合α突触核蛋白的抗体用于被动免疫。在一些实施方案中，6H7或者8A5互相组合或者与其他的抗α突触核蛋白抗体组合使用。
i.主动免疫引发针对α-突触核蛋白的两个末端的表位的免疫应答如本申请所述，施用识别α-突触核蛋白的氨基末端和羧基末端区域中的表位的抗体(即，8A5以及6H7)降低了过表达人α-突触核蛋白的转基因小鼠的脑在聚集的α-突触核蛋白(参见，例如实施例IX)。部分基于这一发现，可以理解组合施用识别N-末端表位的抗体(例如如上所述)以及识别C-末端表位的抗体(例如，如上所述)可尤其用于预防和治疗。因此，一方面，本发明提供了通过给患有或者处于患该疾病危相中的病人组合施用有效量的第一抗体以及第二抗体预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，所述第一抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位，所述残基根据SEQ ID NO1进行编号，所述第二抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位。第一抗体优选结合SEQ ID NO1的1至Na残基的序列内，其中Na是5至20；SEQ ID NO1的2至Nb残基的序列内，其中Nb是6至21；和/或SEQ ID NO1的3至Nc的残基的序列内，Nc是7至22的α-突触核蛋白的表位。第二抗体优选特异性结合人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位。可以同时(共配制的)，在同一天，同一月和/或作为相同疗程的一部分施用第一和第二抗体。
ii.组合物以及试剂盒本发明提供了用于预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或者α-突触核蛋白的疾病的组合物，包括一或多种结合在α-突触核蛋白的末端区域的抗体，例如，具有上述的特异性。组合物包括含有两或更多种抗体的剂型和药剂。示范性的药剂(适于共配制抗体)是本领域已知的并且包括以下VII部分“治疗方案”所述的那些药剂。
本发明还提供了用于预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的试剂盒。试剂盒包括2(或更多)种抗体，其中第一抗体结合人α-突触核蛋白的N-末端的表位并且第二抗体结合人α-突触核蛋白的C-末端的表位。抗体可以组合成用于同时使用的单个药剂或者试剂盒。或者，抗体可以占据用于同时，顺序或者分开使用的试剂盒中分开的容器(例如，小瓶，注射器，管等等)。这些抗体可以任选与其他的药剂组合施用，所述其他的药剂对于治疗Lewy体疾病至少部分有效。试剂盒还可以包括加强本发明的通过血脑屏障的药剂，其他的助剂以及用于施用至病人的材料。
iii.免疫球蛋白的一般特性碱性抗体结构单元已知包括亚组的四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每个对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每个链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。
轻链被分为κ或者λ。重链被分为γ，μ，α，δ或者ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。轻链和重链内，通过约12或更多氨基酸的“J”区域将可变和恒定区相连，重链还包括约超过10个氨基酸的“D”区。(参见，Fundamental Immunology，Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989，Ch.7(在此全文引入作为通用的参考)。
每一轻链/重链对的可变区形成抗体结合部位。由此，完整的抗体具有2个结合位点。除了在双功能或者双特异性抗体中，2个结合位点是相同的。所有的链均显示出由三个高可变区，也称作互补决定区或者CDRs连接的相对保守的框架区(FR)的相同通用结构。来自每一对的2条链的CDR通过能够结合特异性表位的框架区进行比对。从N-末端到C-末端，两个轻链和重链包含功能域FRI，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。根据Kabat在Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)；Chothia & Lesk，J MoI.Biol.196901-917(1987)；或者Chothia等，Nature342878-883(1989)中的定义将氨基酸分配至每一功能域。
iv.制备非人抗体嵌合和人源化抗体具有与小鼠或者其它提供构建嵌合或者人源化抗体的原材料的非人抗体相同的或者类似的结合特异性和亲和性。嵌合的抗体是通常具有通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建的轻和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)片段可以连接于人恒定(C)片段，诸如IgG1和IgG4。优选人同种型IgG1。在一些方法中，抗体的同种型是人IgG1。IgM抗体还可以被用于一些方法中。由此典型的嵌合抗体是由来自小鼠抗体的V或者抗原-结合功能域和来自人抗体的C或者效应因子功能域组成的杂化蛋白。
人源化抗体具有基本上来自人抗体(称作受体抗体)的可变区骨架残基和基本上来自小鼠-抗体的互补决定区(称为供体免疫球蛋白)。参见Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1989)，WO90/07861，US 5,693,762，US 5,693,761，US 5,585,089，US 5,530,101，和Winter，US 5,225,539(每个在此全文引入作为通用的参考)。如果存在，恒定区也基本上或者完全来自人免疫球蛋白。人可变结构域通常选自骨架序列显示出与鼠可变区功能域高水平序列同一性的人抗体，从鼠可变区功能域衍生CDRs。重链和轻链可变区骨架残基可以来源于相同的或者不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列或者可以是若干人抗体的共有序列。参见Carter等，WO92/22653。基于它们对CDR构象和/或结合抗原的影响选择来自人可变区骨架残基的某些氨基酸的取代。这样的可能的影响的研究是通过制作模型，检验特定位置的氨基酸的特性，或者经验观测特定的氨基酸的取代效应或者致突变进行。
例如，当氨基酸在鼠可变区骨架残基和选择的人可变区骨架残基之间不同时，人骨架氨基酸应该通常由来自小鼠抗体的等效骨架氨基酸代替，合理期待的氨基酸为(1)直接非共价连接，(2)与CDR区域邻接，(3)与CDR区域(例如CDR区域的约6A内相互作用，或者(4)参与VL-VH连接。
其它用于取代的候选物是不常用于人免疫球蛋白的那个位置的受体人骨架氨基酸。这些氨基酸可以用来自小鼠供体抗体的等效位置或者来自更典型的人免疫球蛋白的等效位置的氨基酸代替。用于取代的其它候选物是不常用于人免疫球蛋白的那个位置的受体人骨架氨基酸。人源化免疫球蛋白的可变区骨架通常与人可变区骨架序列或者这样的序列的共有序列至少85％的序列同一性。
一些人源化抗体包括来源于小鼠单克隆抗体mAb 6H7或者小鼠单克隆抗体mAb 8A5的互补决定区(CDRs)序列。产生抗体6H7的命名为JH17.6H7.1.54.28的细胞系的ATCC登录号为，根据布达佩斯条约在2005年8月4日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA 20108)。产生抗体8A5的命名为JH4.8A5.25.7.36的细胞系的ATCC登录号为，保藏在2005年8月4日。
如上所述，已知大量利用表达抗体的细胞系(例如杂交瘤)用于产生嵌合和人源化抗体的方法。例如，小鼠8A5和/或6H7抗体的免疫球蛋白可变区可以利用众所周知的方法进行克隆和序列。一个方法中，用于列举而非限制的目的，通过RT-PCR利用从杂交瘤细胞制备的mRNA克隆重链可变VH区域。采用共有引物产生包括翻译起始密码子作为5’引物和g2b恒定区特异性3’引物的VH区域前导肽。典型的引物描述在Schenk等的美国专利US 2005/0009150中(在下文中称作“Schenk”)。可以比较来自多种独立衍生的克隆的序列确保在扩增期间没有引入改变。还可以通过对通过5′RACE RT-PCR法以及3′g2b特异性引物获得的VH片段的测序确定和证实VH区域的序列。
8A5或者6H73 D6的轻链可变VL区可以VH区域类似的方法进行克隆。在一个方法中，设计用于鼠VL区扩增的共有引物组被设计与包括翻译起始密码子，以及V-J连接区下游的鼠Ck区域的特异性3′引物的杂交。第二个方法中，采用5′RACE RT-PC法克隆编码VL的cDNA.。典型的引物描述在Schenk中。然后将克隆的序列与编码人恒定区的序列相连。
一个方法中，对重链和轻链可变区重工程化来编码各自的VDJ或者VJ连接下游的剪接供体序列，并克隆到哺乳动物表达载体，诸如重链的pCMV-hγ1以及轻链的pCMV-hκ1。这些载体编码人γ1以及Ck恒定区作为插入的可变区盒的下游的外显子片段。序列验证之后，可以将重链以及轻链表达载体共-转染到COS细胞中产生嵌合抗体。转染后48小时收集条件培养基并通过Western印迹分析抗体产生或者ELISA分析抗原结合。如上所述嵌合抗体是人源化的。
v.人抗体通过多种如下所述的技术提供抗α-SN的人抗体。通过竞争性结合实验选择一些人抗体，或，与特定的小鼠抗体具有相同的表位特异性，诸如在实施例IX中描述的小鼠单克隆抗体中之一。还可以通过利用α-SN的仅仅一个片段作为免疫原，和/或通过抗体抗α-SN的缺失突变体的集合筛选抗体筛选人抗体特定的表位特异性。人抗体优选地具有同种型特异性人IgG1。
(1)Trioma方法基本方法以及用于该方法的典型的细胞融合伴侣，SPAZ-4已经由Oestberg等在Hybridoma 2361-367(1983)；Oestberg，美国专利4,634,664；和Engleman等，美国专利4,634,666中描述(每个在此全文引入作为通用的参考)。由该方法获得的产生抗体的细胞系被称作triomas，因为它们来自于三个细胞-2个人细胞和1个小鼠细胞。最初，小鼠骨髓瘤系与人B-淋巴细胞融合获得不产生抗体的异种杂交细胞，诸如由上述Oestberg描述的SPAZ-4细胞系。然后异种细胞与免疫的人B-淋巴细胞融合获得产生抗体的trioma细胞系。已经发现triomas产生比由人细胞制成的普通杂交瘤更稳定的抗体。
从人供体的血液，脾脏，淋巴结或者骨髓获得免疫的B-淋巴细胞。如果需要抗特异性抗原或者表位的抗体，优选使用其抗原或者表位用于免疫。免疫可以是体内或者体外免疫。对于体内免疫，通常从用α-SN，其片段，含有α-SN或者片段的较大的多肽或者抗α-SN的抗体的抗独特型抗体免疫的人分离B细胞。一些方法中，B细胞分离自最终施用抗体治疗的相同病人。对于体外免疫，通常在诸如补充有10％人血浆的RPMI-1640培养基中将B-淋巴细胞暴露于抗原抗原7-14天的时间(参见Engleman，上述)。
通过众所周知的方法将免疫的B-淋巴细胞与诸如SPAZ-4的异种杂交细胞融合。例如，在37℃用40-50％的MW 1000-4000的聚乙二醇处理细胞约5-10分钟。从融合混合物分离细胞并在选择所需的杂交体(例如，HAT或者AH)的培养基中扩增。通过分析trioma培养基结合α-SN或者其片段的能力鉴定分泌具有所需结合特异性的抗体的克隆。产生具有所需的特异性的人抗体的triomas通过有限稀释技术亚克隆并体外生长在培养基中。然后测验所获得的trioma细胞系结合α-SN或者其片段的能力。
尽管triomas是遗传稳定的，它们不产生非常高水平的抗体。可以通过将来自trioma抗体基因的克隆到一或多种表达载体中并将载体转化到标准的哺乳动物，细菌或者酵母细胞系中提高表达水平。
(2)转基因非-人哺乳动物还可以从非-人转基因哺乳动物产生抗α-SN的人抗体，所述非-人转基因哺乳动物具有编码人免疫球蛋白座位的至少一个片段的转基因。通常，这样的转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白位点功能上是灭活的。优选地，人免疫球蛋白座位的片段包括重链和轻链组分的未重新排列的序列。内源免疫球蛋白基因的灭活以及导入外源的免疫球蛋白基因可以通过靶同源重组或者通过导入YAC染色体实现。由该过程产生的转基因哺乳动物能够功能上重排免疫球蛋白组分序列，并表达由人免疫球蛋白基因编码的多种同种型的抗体的集合，不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些特性的哺乳动物的产生和特性由例如Lonberg等详细描述在WO93/1222，US 5,877,397，US 5,874,299，US 5,814,318，US 5,789,650，US 5,770,429，US 5,661,016,US 5,633,425，US 5,625,126，US 5,569,825，US 5,545,806，Nature 148，1547-1553(1994)，NatureBiotechnology 14，826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(每个全文引入用于通用的参考)。转基因小鼠是尤其合适的。通过诸如如上由Lonberg或者Kucherlapati所述用α-SN或者其片段免疫转基因非人哺乳动物获得抗-α-SN抗体。通过例如利用常规的Kohler-Milstein技术将来自这样的哺乳动物的B-细胞融合到合适的骨髓瘤细胞系制备单克隆抗体。还可以来自用免疫原性药剂免疫的从的血清的形式提供人多克隆的抗体。任选地，可以通过利用α-SN或者其它淀粉样的肽作为亲和性的亲和纯化浓缩这样的多克隆的抗体。
(3)噬菌体显示方法获得人抗-α-SN抗体进一步的方法是根据由Huse等，Science2461275-1281(1989)描述的总方案从人B细胞筛选DNA文库。如对trioma法的描述，可以从用α-SN，片段，含有α-SN或者片段或者抗-独特型抗体的较长多肽免疫的人获自这样的B细胞。任选地，这样的B细胞获自最终接受抗体治疗的病人。选择结合α-SN或者其片段的抗体。然后克隆并扩增编码这样的抗体(或者结合片段)的序列。与噬菌体-显示技术组和由Huse描述的方案被赋予了更高的效果。例如参见Dower等，WO91/17271和McCafferty等，WO92/01047，US5,877,218，US5,871,907，US5,858,657，US5,837,242，US5,733,743和US5,565,332(每个均在此出全文引入作为通用的参考)。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中的成员在其外表面上显示不同的抗体。抗体通常显示为Fv或者Fab片段。通过亲和性富集α-SN肽或者其片段的具有所需的特异性的噬菌体显示抗体。
在变化的噬菌体-显示方法中，可以产生对所选择的鼠抗体具有结合特异性的人抗体。参见Winter，WO 92/20791。在该方法中，所选择的鼠抗体的重链或者轻链可变区用作原始材料。例如，如果轻链可变区被选为原始材料，构建噬菌体文库，其中的成员显示相同的轻链可变区(即，鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区获自重排的人重链可变区的文库。选择显示对α-SN具有强烈的特异性结合的噬菌体(例如，至少108并优选至少109M-1)。然后将来自该噬菌体的人重链可变区用作用于构建进一步的噬菌体文库的原始材料。在该文库中，每一噬菌体显示相同的重链可变区(即，从第一显示文库鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区获自重排的人可变轻链区域的文库。同样，选择对α-SN显示强烈的特异性结合的噬菌体。这些噬菌体显示全部人抗-α-SN抗体的可变区。这些抗体通常与鼠原始材料具有相同或者类似的表位特异性。
vi.选择恒定区嵌合，人源化或者人抗体的重链和轻链可变区可与至少部分的人恒定区连接。恒定区的选择部分取决于抗体依赖的补体和/或细胞介导的毒性是否是所希望的。例如，同种型IgG1和IgG3具有补体活性，而同种型IgG2和IgG4不具有补体活性。同种型的选择还可以影响抗体进入脑。优选人同种型IgG1。轻链恒定区可以是λ或者κ。抗体可以表达为含有2条轻和2条重链的四聚体，作为分开的重链，轻链，作为Fab，Fab′F(ab′)2和Fv，或者作为重链和轻链可变域通过间隔基连接的单链抗体。
vii.重组抗体的表达通常由重组表达产生嵌合，人源化和人抗体。通常，重组多核苷酸构建体包括与抗体链的编码序列，包括天然相关的或者异源启动子区域的可操作性连接的表达控制序列。优选地，表达控制序列是能够转化或者转染真核生物宿主细胞的载体中的真核生物启动子系统。一旦载体被整合入合适的宿主，在适于高水平表达核苷酸序列的条件下维持宿主，并收集和纯化交叉反应抗体。
这些表达载体通常可在宿主生物体中复制作为游离基因或者作为宿主染色体DNA不可分割的部分。通常，表达载体含有选择标记，例如，氨苄青霉素-抗性或者潮霉素-抗性来检测转化有所需的DNA序列的那些细胞。
大肠杆菌是尤其可用于克隆本发明的DNA序列的原核宿主。诸如酵母的微生物也可用于表达。酵母是优选的酵母宿主，所述宿主带有所需的具有表达控制序列，复制起点，终止序列等的合适的载体。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶及其它糖酵解酶。可诱导的酵母启动子包括，来自乙醇脱氢酶，异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
哺乳动物细胞是表达编码免疫球蛋白或者其片段的核苷酸片段的优选的宿主。参见Winnacker，From Genes to Clones，(VCH Publishers，NY，1987)。已经在本领域发展了能够分泌完整的异源蛋白的大量合适的宿主细胞系，并且包括CHO细胞系，各种COS细胞系，HeLa细胞，L细胞，人胚肾细胞和骨髓瘤细胞系。优选地，细胞是非人。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，诸如复制起点，启动子，增强子(Queen等，Immunol.Rev.8949(1986))，以及必要的处理信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点和转录终止物序列。优选的表达控制序列是来源于内源基因，巨细胞病毒，SV40，腺病毒，牛乳头状瘤病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol.1481149(1992)。
或者，抗体编码序列可以整合入转基因中用于导入转基因动物的基因组并随后在转基因动物的奶中表达(参见，例如美国5,741,957，美国5,304,489，美国5,849,992)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因，诸如酪蛋白或者β乳球蛋白的启动子和增强子可操作性连接的轻和/或重链的编码序列。
含有目的DNA片段的载体可以由已知的方法转移到宿主细胞中，取决于细胞宿主的类型。例如，通常利用氯化钙转染原核细胞，而磷酸钙处理，电穿孔，脂转染，biolistics或者基于病毒的转染可用于其它的细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括利用聚凝胺，原生质体融合，脂质体，电穿孔和显微注射(参见，Sambrook等，上述的)。为了产生转基因动物，可以将转基因微注射到受精的卵母细胞中，或者可以整合到胚胎干细胞的基因组中，然后将这样的细胞的核转入去核的卵母细胞中。
一旦表达，可以根据本领域的标准方法，包括HPLC纯化，柱层析，凝胶电泳等等纯化抗体(参见，Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，NY，1982))。
3.结合物用于诱导免疫应答的一些药剂含有用于诱导抗LBs的免疫应答的合适的表位，但是太小没有免疫原性。在这种情况下，肽免疫原可以连接合适的载体分子形成结合物，帮助引发免疫应答。合适的载体包括血清白蛋白，钥孔血兰素，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，破伤风类毒素或者来自其它病原菌，诸如白喉，大肠杆菌，霍乱或者H.pylori的类毒素，或者减毒的毒素衍生物。T细胞表位也是合适的载体分子。一些结合物可以通过将本发明的药剂与免疫刺激聚合物分子(例如，三棕榈酰基-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)，甘露聚糖(甘露糖聚合物)，或者葡聚糖(β1→2聚合物))，细胞因子(例如，IL-1，IL-1α和β肽，IL-2，γ-INF，IL-10，GM-CSF)，和趋化因子(例如，MIP1α和β和RANTES)连接形成。免疫原性药剂还可以连接加强穿过组织运输的肽，如O’amahony，WO 97/17613和WO 97/17614的描述。免疫原可与带有或者不带有间隔基氨基酸(例如，gly-gly)的载体相连。
可以通过将本发明的药剂与至少一个T细胞表位连接形成一些结合物。一些T细胞表位是混杂的，而其它的T细胞表位是通用的。混杂的T细胞表位能够加强显示多种HLA类型多种受试者中T细胞免疫性的诱导。与混杂的T细胞表位相比，通用的T细胞表位能够加强大百分比，例如至少75％的受试者的T细胞免疫性的诱导，所述受试者显示由不同HLA-DR等位基因编码的多种HLA分子。
大量天然存在的T-细胞表位存在，诸如，破伤风类毒素(例如，P2和P30表位)，乙型肝炎表面抗原，百日咳，，麻疹病毒F蛋白，Chlamydiatrachomitis主要外膜蛋白，白喉类毒素，镰状疟原虫环孢子T，镰状疟原虫CS抗原，曼氏血吸虫丙糖磷酸异构酶，大肠杆菌TraT，以及流感病毒血球凝集素(HA)。本发明的免疫原性肽可以与下列文献中描述的T-细胞表位结合，如F.等，Nature，336778-780(1988)；Chicz R.M.等，J.Exp.Med，17827-47(1993)；Hammer J.等Cell 74197-203(1993)；FaIk K.等，Immunogenetics，39230-242(1994)；WO 98/23635；以及，Southwood S.等J.Immunology，1603363-3373(1998)(每一个在这里引入作为参考)。进一步的实例包括流感血球凝集素HA307-319PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO4)疟疾CST3表位EKKIAKMEKAS SVFNV(SEQ ID NO5)乙型肝炎表面抗原HBsAg19-28FFLLTRILTI(SEQ ID NO6)热激蛋白65hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG(SEQ IDNO7)
卡介苗QVHFQPLPPAVVL(SEQ ID NO8)破伤风类毒素TT830-844QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO9)破伤风类毒素TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO10)HIV gp120 T1KQIINMWQEVGKAMYA(SEQ ID NO11)或者，可通过将本发明的试剂连接于至少一个能够结合一大部分MHC II类分子诸如平面(pan)DR表位(″PADRE″)的人造T-细胞表位来形成结合物。PADRE描述在US 5,736,142，WO 95/07707，以及Alexander J等，Immunity，1751-761(1994)(每一个在这里引入作为参考)文献中。优选的PADRE肽是AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO12)，(通用残基用粗体表示)其中X优选地为环己基丙氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸，其中环己基丙氨酸是最优选的。
可通过化学交联将免疫原性药剂与载体连接。用于连接免疫原与载体的技术包括利用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基-硫)丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)形成二硫键(如果肽缺巯基，可通过添加半胱氨酸残基来提供)。这些反应物在本身和存在于蛋白上的肽半胱氨酸以及通过赖氨酸上的ε-氨基，或其它氨基酸中的自由氨基之间产生二硫键。各种此类的二硫化物/酰胺-形成剂描述在Immun.Rev.62，185(1982)中。其它双功能的偶联剂形成硫醚而不是二硫键。许多这样的硫醚-形成剂是市售的，且包括6-马来酰亚胺基己酸，2-溴乙酸，以及2-碘乙酸，4-N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸的活性酯。可通过将羧基与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸，钠盐结合来激活羧基。
可通过在Th表位和本发明的肽免疫原之间添加间隔基残基(例如，Gly-Gly))来改进免疫原性。除了将Th表位与B细胞(即，肽免疫原)表位分开之外，甘氨酸残基可破坏任何由将Th表位与肽免疫原连接产生的人工二级结构，并且消除了T和/或B细胞应答之间的干扰。辅助表位和抗体激发功能域之间的构象分离由此使得呈递的免疫原和合适的Th以及B细胞之间的相互作用更加有效。
为了增强大多数对本发明药剂显示不同HLA类型的受试者的T细胞免疫性的诱导，可制备具有不同Th细胞表位的结合物的混合物。混合物可含有至少两种具有不同Th细胞表位的结合物的混合物，至少三种具有不同Th细胞表位的结合物的混合物，或至少四种具有不同Th细胞表位的结合物的混合物。混合物可与佐剂一起施用。
免疫原性肽还可以表示为与载体的融合蛋白(即，异源肽)。免疫原性肽可在其氨基末端、其羧基末端或二末端被连接于载体。任选地，免疫原性肽的多重重复可存在于融合蛋白中，免疫原性肽可例如，在肽的N和C两个末端连接于异源肽的多拷贝。某些载体肽用来诱导抗载体肽的辅助T-细胞应答。诱导的辅助T-细胞反过来诱导抗与载体肽连接的免疫原性肽的B-细胞应答。
本发明的某些药剂包含融合蛋白，其中融合蛋白的α-SN的N-末端片段在其C-末端连接于载体肽。在这种药剂中，α-SN的片段的N-末端残基构成融合蛋白的N-末端残基。因此，这种融合蛋白在诱导那些结合需要游离态α-SN的氨基末端的表位的抗体中是有效的。本发明的某些药剂包含大量在载体肽的一或多种拷贝的C末端连接的NAC重复。某些融合蛋白包含串接的α-SN的不同片段。
本发明的某些药剂包含一种融合蛋白，其中α-SN的片段的C-末端在它的N-末端连接于载体肽。在这种药剂中，α-SN的片段的C-末端残基构成了融合蛋白的C-末端残基。因此，这种融合蛋白在诱导结合需要游离态α-SN的C-末端残基的表位的抗体的诱导中是有效的。本发明的某些药剂包含大量C-末端肽的重复，诸如在N-末端连接于载体肽的一或多个拷贝的SN125-140。某些融合蛋白包含串接α-SN的不同片段。
在某些融合蛋白中，NAC在其N-末端融合于异源载体肽NAC可与C-末端融合一起使用。某些融合蛋白包含与NAC的N-末端或C-末端连接的异源肽，其反过来连接于一或多个串接α-SN的其他NAC片段。某些融合蛋白包含α突触核蛋白肽的C-末端的多拷贝，如上所述，且异源肽的多拷贝彼此互连。
某些适用于本发明的融合蛋白的实例显示如下。某些这样的融合蛋白包含与诸如US5,196,512、EP378,881和EP427,347中描述的破伤风类毒素表位连接的α-SN(包括任一如上所述的片段)片段。某些融合蛋白包含连接至少一个PADRE的α-SN的片段。某些异源肽是混杂的T-细胞表位，而其它的异源肽是通用的T-细胞表位。在某些方法中，用于施用的药剂仅仅是在线性构象中具有连接异源片段的α-SN片段的单一融合蛋白。本发明的治疗剂可以用通式表示。例如，在某些方法中，药剂是用通式2x表示的融合蛋白的多聚体，其中x是由1-5的整数。优选地x是1，2，或3，且2是最优选的。当x为2时，这种多聚体具有四个在优选构象中连接称为MAP4的融合蛋白(参见US5,229,490)。
MAP4构象显示如下，其中支链结构是通过在赖氨酸的N末端和侧链胺二者处激发肽合成来产生的。取决于赖氨酸整合到序列中以及分支的次数，产生的结构将呈递多重N末端。在这些实例中，在分支的含有赖氨酸的核心上已经产生四个相同的N末端。这种多样性大大增强了同源B细胞的应答。

Z是指NAC肽，NAC肽片段，或如上述I.2部分所述的α-SN的其它活性片段。Z可表示一个以上的活化片段，例如Z＝α-SN 60-72(NAC区域)肽＝NH2-KEQVTNVCGGAVVT-COOH(SEQ ID NO13)Z＝α-SN 73-84(NAC区域)肽＝NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH(SEQ ID NO14)Z＝α-SN 102-112肽＝NH2-C-氨基-庚酸-KNEEGAPCQEG-COOH(SEQ ID NO15)α-SN 128-140肽融合蛋白的其它实例包括在MAP4构象中的Z-破伤风类毒素830-844Z-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO16)在MAP4构象中的Z-破伤风类毒素947-967Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO17)在MAP4构造中的Z-破伤风类毒素830-844Z-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO18)在线性构象中的Z-破伤风类毒素830-844+破伤风类毒素947-967Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ IDNO19)PADRE肽(所有均为线性构象)，其中X优选地为环己基丙氨酸，酪氨酸或苯丙氨酸，环己基丙氨酸是最优选的-ZAKXVAAWTLKAAA-Z(SEQ ID NO20)3Z-PADRE肽Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO21)
融合蛋白的进一步实例包括AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z(SEQ ID NO22)Z-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO23)Z-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO24)PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z(SEQ ID NO25)Z-PKYVKQNTLKLAT-Z(SEQ ID NO26)Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO27)Z-Z-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO28)Z-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKAS SVFNV-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-Z-Z-Z-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO29)Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-QYKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z(SEQ ID NO30)在2个分支的树脂上的Z-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO31) EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO32)(在MAP-4构象中的突触核蛋白片段融合蛋白)相同的或类似的载体蛋白以及连接方法可用于产生供被动免疫产生抗α-SN抗体使用的免疫原。例如，可给实验动物施用α-SN或连接载体的片段来产生α-SN的单克隆抗体。
4.编码治疗剂的核酸可通过施用用于被动免疫的编码α-SN肽的片段的核酸，及其片段，其它肽免疫原，或抗体以及它们的组分链来诱导编码抗Lewy体的免疫应答。这种核酸可以是DNA或RNA。编码免疫原的核酸片段通常连接调控元件，诸如允许DNA片段在病人的预定靶细胞中表达的启动子以及增强子。为了在血细胞中表达，如所希望的免疫应答诱导，来自免疫球蛋白轻链或者重链基因的启动子和增强子元件或CMV主要立即早期启动子以及增强子适于介导表达。连接的调控元件和编码序列往往克隆到载体中。为了施用双-链抗体，两个链可以克隆在相同的或单独的载体中。本发明的编码治疗剂的核酸可同时编码至少一个T细胞表位。在这里公开的内容涉及助剂的应用以及将其改变(mutatismutandis)应用于它们与编码本发明治疗剂核酸的应用。
大量病毒载体系统是可利用的，包括逆转录病毒系统(参见，例如，Lawrie and Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3，102-109(1993))；腺病毒载体(参见，例如，Bert等，J.Virol.67，5911(1993))；腺病毒相关病毒载体(参见，例如，Zhou等，J.Exp.Med.179，1867(1994))，来自痘家族包括牛痘病毒和鸡痘病毒的病毒载体，来自α病毒属诸如来源于辛德毕斯和西门利克森林病毒的病毒载体(参见，例如，Dubensky等，J.Virol.70，508-519(1996))，委内端拉马脑脊髓炎病毒(参见US5,643,576)和杆状病毒，诸如水疱性口腔炎病毒(参见WO 96/34625)以及乳头状瘤病毒(Ohe等，Human Gene Therapy 6，325-333(1995)；Woo等，WO 94/12629以及Xiao & Brandsma，Nucleic Acids.Res.24，2630-2622(1996))。
编码免疫原的DNA，或含有其的载体，可以被包装到脂质体中。合适的脂类以及有关类似物描述在US 5,208,036，US 5,264,618，US5,279,833，以及US 5,283,185中。编码免疫原的载体和DNA还可以被吸附于或与粒子载体连接，实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及聚交酯和聚(丙交酯-共乙交酯)，(参见，例如，McGee等，J.Micro Encap.1996)。
基因治疗载体或裸DNA可以通过施用于个体病人体内递送，通常通过系统给药(例如，静脉注射，腹膜内，鼻的，胃的，皮内的，肌内的，皮下，或头盖骨内的输注)或局部施用(参见，例如，US 5,399,346)。这种载体可进一步包括推进剂诸如bupivacine(参见例如，US5,593,970。DNA还可以利用基因枪来施用。参见Xiao & Brandsma，同上。编码免疫原的DNA沉淀在显微金属珠的表面上。用激波或膨胀氦气加速微弹射，并穿透组织到几个细胞层的深度。例如，Agacetus，Inc.Middleton，WI生产的AccelTMGene Delivery装置是合适的。或者，仅仅通过化学药品或机械刺激将DNA与点样在皮肤上使得裸DNA透过皮肤到血流中(参见WO 95/05853)。
在进一步变化中，免疫原编码载体可以离体递送给细胞，诸如来自个体病人(例如，淋巴细胞，骨髓抽出物，以及组织活体)或通用供血者造血干细胞的细胞外植体，然后将细胞再植入到病人中，通常在选择插入该载体的细胞之后。
III.诱导抗Aβ免疫原性应答的试剂Aβ，又称β-淀粉状肽，或A4肽(参见US 4,666,829；Glenner& Wong，Biochem.Biophys.Res.Commun.120，1131(1984))，是39-43个氨基酸的肽，其是阿尔茨海默氏病特性血小板的主要成份。Aβ是由通过称为β和γ分泌酶的两种酶加工较大的蛋白质APP产生的(参见Hardy，TINS20，154(1997))。在与阿尔茨海默氏病有关的APP中的已知突变存在于接近β或γ分泌酶的位点，或Aβ内。例如，717位点临近于APP在加工Aβ的γ-分泌酶分裂位点，且位点670/671临近于β-分泌酶裂解的位点。普遍认为与裂解反应相互作用，突变引起AD，其中通过裂解反应形成Aβ，从而增加了产生的Aβ的42/43氨基酸形式的量。
Aβ具有与众不同的特性，其可以固定和激活典型的和可选择性的两种补体的级联。尤其是，其结合Clq且最终结合于于C3bi。这种结合促进与导致B细胞活化的巨噬细胞的结合。另外，C3bi进一步地分解且然后以导致这些细胞活化增加10,000倍的T细胞依赖的方式结合B细胞上的CR2。此机制导致Aβ产生超过其他抗原的免疫反应。
Aβ具有一些自然界存在的形式。人源的Aβ称为Aβ39，Aβ40，Aβ41，Aβ42和Aβ43。这些肽的序列以及与APP前体的关系显示在Hardy等.，TINS20，155-158(1997)的图1中。例如，Aβ42具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT(SEQ ID NO33)Aβ41，Aβ40和Aβ39不同于Aβ42，其从C-末端分别缺失Ala，Ala-Ile，和AIa-Ile-Val。Aβ43不同于Aβ42，因为Aβ43在C-末端存在Thr残基。
上述α-SN的类似试剂以前被用于描述Aβ(参见WO98/25386和WO00/72880，这两篇文献均在这里引入作为参考)。这些试剂包括Aβ和其活性片段，Aβ的结合物，以及Aβ活性片段的结合物，Aβ的抗体及其活性片段(例如，小鼠，人源化的，人，以及嵌合抗体)，以及抗体链编码核酸。来自Aβ的N-末端部分的活性片段是优选的。优选的免疫原性片段包括Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，3-7，1-3，以及1-4。例如命名Aβ1-5表示包括Aβ的1-5残基并且缺少Aβ的其它残基的片段。始于Aβ的残基1-3并且终止于残基7-11的片段是尤其优选的。
在这里公开的与诱导主动免疫反应的试剂，诱导被动反应的试剂，结合物，以及治疗剂编码核酸(参见部上述的分II.1，2，3，和4)有关的内容已作必要的修正来应用于Aβ及其片段。在这里公开的与诱导主动免疫反应的试剂，诱导被动反应的试剂，结合物，以及治疗剂编码核酸(参见部上述的分II.1，2，3，和4)有关的内容已作必要的修正来应用于Aβ及其片段。本发明的内容涉及自愿接受治疗的病人，以及治疗方案(参见以下第IV和V部分)已作必要的修正来应用于Aβ及其片段。
分解的Aβ或其片段是指单体的肽单元。分解的Aβ或其片段通常是可溶性的，并且能够自我聚集来形成可溶性寡聚物。Aβ的寡聚物及其片段通常是可溶性的并且主要为α-螺旋或无规卷曲。聚集的Aβ或其片段，是指与不溶性的β-层叠组件结合的α-SN或其片段的寡聚物。聚集的Aβ或其片段，还是指纤丝状聚合物。纤丝通常是不溶性的。一些抗体结合可溶性的Aβ或其片段或聚集的Aβ或其片段。一些抗体结合可溶性的Aβ或其片段以及聚集的Aβ或其片段二者。
一些结合物的实例包括AN90549(MAP4构象中的Aβ1-7-破伤风类毒素830-844)(SEQ IDNO34)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELAN90550(MAP4构象中的Aβ1-7-破伤风类毒素947-967)DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO35)AN90542(线性构象中的Aβ1-7-破伤风类毒素830-844+947-967)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO36)AN90576MAP4构象中的(Aβ3-9)-破伤风类毒素830-844)EFRHDSG-QYIKANSKFlGITEL(SEQ ID NO37)PADRE肽(全部为线性构象)，其中X优选为环己基丙氨酸，酪氨酸或苯基丙氨酸，环己基丙氨酸是最优选的AN90562(PADRE-Aβ1-7)AKXVAAWTLAAA-DAEFRHD(SEQ ID NO38)AN90543(3PADRE-Aβ1-7)DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQID NO39)融合蛋白的其他实例(Aβ的免疫原性表位粗体表示)包括AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQID NO40)DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO41)DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO42)FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO43)
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO44)PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO45)DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD(SEQ ID NO46)DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ IDNO47)DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO48)DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKAS SVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ ID NO49)DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO50)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO51)DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ ID NO52)在两个分支树脂上DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO53)。
优选的单克隆抗体结合Aβ的残基1-10内的表位(天然Aβ的第一个N末端残基命名为1)。一些优选的单克隆抗体结合氨基酸1-5内的表位，并且一些结合5-10内的表位。一些优选的抗体结合氨基酸1-3，1-4，1-5，1-6，1-7或3-7内的表位。一些优选的抗体结合起始于Aβ的残基1-3并且终止于残基7-11的表位。其他的抗体包括结合具有残基13-280的表位的抗体(例如，单克隆抗体266)。优选的抗体具有人IgGl同种型。
IV.筛选清除活性的抗体本发明提供了筛选抗体清除Lewy体或者其他抗原，或者相关的需要清除活性的生物活性实体的方法。为了筛选抗Lewy体的活性，将来自患有PD的病人以及具有帕金森氏症病理学表现的特型的动物模型的脑的组织样品与介质中具有Fc受体的噬菌细胞，诸如小胶质细胞，以及所检验的抗体体外接触。噬菌细胞可以是初级培养物或者细胞系，诸如BV-2，C8-B4或者THP-1。一些方法中，在显微盖玻片上将组分组合来促进显微监控。一些方法中，在微滴定板的孔中平行进行多个反应。以这样的方式，可以将单独的微型显微盖玻片固定在单独的孔上，或者可以使用诸如检测α-SN的ELISA的非显微检测方式。优选地，一系列测定由测定体外反应混合物中Lewy体的量，从反应前的基线开始，以及测定反应中期间的以或者多个检验值构成。可以，例如通过用α-SN或者LBs的其他组分荧光标记的抗体的染色检测抗原。用于染色所使用的抗体可以与检验清除活性的抗体相同或者不同。LBs反应期间相对基线的下将显示所检验的抗体具有清除活性。这样的抗体很可能用于预防或者治疗PD或者其他的LBP。
类似的方法可用于筛选抗体清除其它类别的生物学实体的活性。该分析可用于检测清除几乎任何种类的生物学实体的活性。通常，生物学实体在人或者动物疾病中具有一定的作用。可以组织样品或者隔离的形式提供生物学实体。如果作为组织样品提供，优选组织样品是不固定的，从而很容易获得组织样品的组分并且避免干扰伴随固定的组分的构象。可以在该分析中测验的组织样品的实例包括癌性组织，前癌组织，含有良性生长，诸如疣或者痣的组织，受致病微生物感染的组织，有炎性细胞浸润的组织，具有细胞之间的病理学基质的组织(例如，纤维素性心包炎)，具有异常抗原的组织，以及瘢痕组织。能被使用的分离的生物学实体的实例包括α-SN，病毒抗原或者病毒，蛋白多糖，其它致病微生物的抗原，肿瘤抗原和粘着分子。这样的抗原可以获自天然来源，重组表达或者化学合成，等等。组织样品分离的生物学实体与具有Fc受体的巨噬细胞，诸如单核细胞或者小神经胶质细胞，以及中待测验的抗体接触。抗体可以针对所检验的生物学实体或者与实体相关的抗原。在后一种情况，目的是测验生物学实体是否是用抗原代偿性吞噬的，通常，尽管未必，抗体和生物学实体(有时是带有相关的抗原)要在在添加噬菌细胞的细胞之前彼此接触。然后监控培养基中保持的生物学实体和/或如果存在相关抗原的话相关抗原的浓度。培养基中抗原或者相关生物学实体的量或者浓度的减少显示抗体具有连同巨噬细胞清除抗抗原和/或相关生物学实体的应答。
还可以实施例II中描述的体外分析利用体外筛选抗体或者其它药剂清除Lewy体的活性。用表达突触核蛋白的表达载体转染的神经元细胞形成可以显微观察到的突触核蛋白包涵体。可以确定抗体或者其它药剂清除这样的包涵体的活性，将用药剂处理的转染细胞中突触核蛋白的外观或者水平与不用药剂处理的对照细胞中外观或者突触核蛋白的水平相比较。可以通过显微观察突触核蛋白包涵体或者通过在凝胶上对细胞提取物电泳并观察突触核蛋白条带监控活性。如实施例1，第2部分所示，如果提取物分馏成细胞质和膜级分，并且分析膜级分，突触核蛋白水平的改变是最显著的。
还可以利用描述于实施例IX中的体内分析筛选抗体或者其它药剂清除Lewy体的活性。简而言之，将试验抗体注入过量表达人α-突触核蛋白并且具有神经元内α-突触核蛋白聚集的转基因小鼠的新皮质中。一个方法中，使用的动物是4到8月龄的、在PDGF启动子的转录控制下的脑中过量表达人野生型α-突触核蛋白的杂合的转基因小鼠(参见Maliah，2000，Science 2871265-69)。将测验抗体和对照(例如不相关的同种型-匹配的对照抗体)溶于合适的溶液(例如，无菌磷酸盐-缓冲的-盐溶液)中用于注射到小鼠体内。对于每一只小鼠而言，在麻醉的条件下将2μl的2mg/ml抗体溶液立体方式(stereotactically)注射到右脑半球(同侧)的颅顶新皮质的深层。左侧半球(对侧)用作每一小鼠的基线对照。缝合注射部位并监控小鼠直至从麻醉中苏醒。注射后2星期，对小鼠实施安乐死，取出它们的脑并固定在4％仲甲醛中48h，并切成40μm厚。围绕注射部位的切片用α-突触核蛋白抗体(例如，识别α-突触核蛋白氨基酸115-122的ELADW-47)染色。对于每一切片而言，在同侧半球注射部位周围的4个显微镜视野中(20x物镜)以及对侧对照半球相应视野的4个视野中计算神经元内α-突触核蛋白聚集。对于每一动物而言，将两个切片的α-突触核蛋白聚集的计数相加并且将2个半球之间总α-突触核蛋白聚集计数之间的差异来确定对于每个个体小鼠而言所检验的抗体对聚集清除的影响。处理的半球中总的α-突触核蛋白聚集计数的减少显示抗体或者其它抗原清除Lewy体的活性。优选地，观察到至少10％的降低。更优选地，观察到降低至少20％，至少40％，至少60％或者至少80％。
V.易受抗-LEWY体组分感染的病人的治疗方案服从治疗的病人包括处于患突触核蛋白病危相中，但是没有显示症状的个体，以及目前显示症状的病人。服从治疗的病人还包括处于患LBD疾病危相中但是不显示症状的个体，以及目前显示症状的病人。这样的疾病包括帕金森氏症(包括突发性的帕金森氏症)，DLB，DLBD，LBVAD，纯粹的自发衰竭，Lewy体吞咽困难，偶发的LBD，遗传性LBD(例如，α-SN基因，PARK3和PARK4的突变)以及多系统萎缩症(例如，橄榄体脑桥小脑萎缩，striatonigral退化和香德综合征)。因此，本发明的方法可以给具有已知的LBD遗传危险性的个体预防性实施。这样的个体包括与患过该疾病个体有亲属关系的个体，以及通过遗传或者生化标记分析确定患病危相的个体。患PD危相的遗传标志包括突触核蛋白或者Parkin，UCHLI和CYP2D6基因中的突变；尤其是在突触核蛋白基因的53位置处的突变。目前患有帕金森氏症的个体可以从其包括静止震颤，肌肉僵硬，运动徐缓和姿势不稳定性的临床表现识别。
一些方法中，个体没有任何一种淀粉样变性疾病的临床症状，征兆和/或危险因素并患有至少一种突触核蛋白病。一些方法中，病人没有特征在于胞外淀粉样蛋白沉积的任何一种疾病的临床症状，征兆和/或危险因素。一些方法中，病人没有特征在于Aβ肽的淀粉样沉积的疾病。一些方法中，病人没有阿尔茨海默氏病的临床症状，征兆和/或危险因素。一些方法中，病人没有阿尔茨海默氏病，认知损伤，中度认知损伤和唐氏先天愚症的临床症状，征兆和/或危险因素。一些方法中，病人并发阿尔茨海默氏病和特征在于Lewy体的疾病。一些方法中，病人并发阿尔茨海默氏病和特征在于突触核蛋白聚集的疾病。一些方法中，病人并发阿尔茨海默氏病和帕金森氏症。
无症状的病人中，可以在任何年龄(例如，10，20或者30岁)开始治疗。然而，通常，并不是一定要在直至病人达到40，50，60，或者70岁开始治疗。在一段时间内治疗通常需要多剂量。可以随时间通过分析抗体，或者对治疗剂(例如，α-SN肽或者Aβ，或者两个)的活化T-细胞或者B-细胞应答监控治疗。如果应答下降，需要加强剂量。
任意地，在开始治疗之前应确定存不存在疾病的症状、征兆或危险因素。
VI.适于接受抗淀粉样组分治疗方法的病人适于接受治疗的病人包括处于患病危相但未表现出症状的个体，以及目前已表现出淀粉样变性病症状的病人。在阿尔茨海默氏病的情况下，如果他或她的生命足够长，那么事实上任何人都处于患阿尔茨海默氏病的危相。因此，本方法可对普通人群进行预防性给药而无需对患病病人的风险进行任意的评估。本方法对那些具有已知阿尔茨海默氏病的遗传风险或任意其他遗传性淀粉样蛋白病的个体尤其有用。这些个体包括那些患过这种疾病的病人亲属，以及那些通过遗传或生化标记分析被确定为有风险的个体。关于阿尔茨海默氏病风险的遗传标记包括APP基因中的突变，尤其是分别被称为Hardy和Swedish突变的在717位，670位和671位的突变(参见上述的Hardy，TINS)。其他的风险标记是在presenilin基因，PS1和PS2，和ApoE4，AD，血胆脂醇过多或动脉硬化症家族史中的突变。可根据特征性的痴呆，以及上述风险因子的存在来识别目前患有阿尔茨海默氏病的个体。此外，目前也有多种鉴定个体患有AD的诊断性检测可供使用。这包括了对CSF-tau和Aβ42水平的测定。升高的tau和降低的Aβ42水平意味着AD的存在。还可以通过使用在实施例中论述的MMSE或ADRDA标准来诊断患有阿尔茨海默氏病的个体。在无症状的病人中，可以在任意年纪(例如，10岁，20岁，30岁)开始治疗。通常，然而，不必待病人至40岁，50岁，60岁或70岁时才开始进行治疗。典型的治疗需要在一段时间内的多剂量给药。可通过分析抗体，或活化T-细胞或B-细胞随时间沿着在VII监测和诊断方法中所述的曲线，如下所述，对所述治疗剂(例如NAC)产生的反应来监测所述治疗。如果反应有所降低，则提示应加强剂量。
VII.治疗方案一般地，治疗方案涉及对病人施用诱导对α-SN产生免疫应答的有效量药剂和/或施用诱导对Aβ产生免疫应答的有效量药剂。在预防性应用中，可使用这样的治疗方法向易患，或处于LBD危相或其他突触核蛋白病的病人施用药物组合物或药剂，该治疗方法包括足以消除或降低所述风险，削减所述严重程度，或延缓疾病发病，包括所述疾病的生理、生化、组织学和/或行为症状，在该疾病发展过程中表现出的并发症和中间病理表型的组合物或药剂的施用量和频率。在治疗性应用中，可使用这样的治疗方法向怀疑或已经患有此类疾病的病人给药组合物或药剂，该治疗方法包括足以治愈，或至少部分阻抑，所述疾病(生理，生化，组织学和/或行为)症状，包括在该疾病发展过程中的并发症和中间病理表型的组合物施用量和频率。例如，在一些方法中，治疗可有效地至少部分消除Lewy体，至少部分分解Lewy体和/或降低突触中α-突触核蛋白寡聚物的水平。足以达到治疗或预防治疗的量被定义为治疗或预防有效量。足以达到治疗或预防治疗的量和剂量给药频率的组合被定义为治疗或预防有效方法。在预防方法和治疗方法中，药剂通常以若干药剂的方式进行施用，直到达到足够的免疫反应。通常，可对免疫反应进行监测，并且如果所述免疫反应开始衰退则进行重复给药。
在一些方法中，药剂的施用导致了细胞间聚集突触核蛋白水平的降低。在一些方法中，药剂的施用导致了LBD临床症状，例如在帕金森式疾病情况中运动功能的改善。在一些方法中，在施用药剂之后，以一定间隔对细胞间聚集突触核蛋白水平的降低或疾病临床症状的改善进行监控。
对治疗上述疾病而言，本发明组合物的有效量依据多种不同的因素而不同，这些因素包括施用的方式，靶位点，病人的生理状态，病人是人抑或是动物，其他的施用药剂，以及所述治疗是预防性的或治疗性的。通常，所述病人是人类，而包括转基因哺乳动物的非人类哺乳动物也可以接受治疗。治疗剂量需要进行滴定从而对安全性和效力进行优化。免疫原的量依赖于是否施用了佐剂，在缺乏佐剂时则需要较高的剂量。用于施用的免疫原的量有时介于每个病人1-500μg，更常见的是对人进行施用时，每次注射5-500μg。偶尔，也可以使用每次注射1-2mg的较高剂量。通常，对每次人类注射采用的是约10，20，50或100μg。免疫原的质量同样也赖于免疫原内的免疫原性表位与总免疫原的质量比。通常，10-3至10-5微摩尔的免疫原性表位可用作微克的免疫原。注射的时间则大相径庭，可以从一天一次，一年一次，到十年一次。在施用一计量免疫原的任意给定日子，所述剂量大于1μg/病人，且如果施用佐剂的话通常大于10μg/病人，并且大于10μg/病人，并且在缺乏佐剂的情况下通常大于100μg/病人。典型的方案包括在不时加强注射，例如6周间隔之后的免疫。其他的方法包括在1，2和12个月之后加强注射之后的免疫。其他的方案包括在生命中的每两个月就进行一次注射。或者，加强注射也可以在不规则基础上的，正如通过监测免疫反应所提示的那样。
对使用抗体进行的被动免疫而言，所述剂量介于从约0.0001-100mg/kg，且更常见的是0.01-5mg/kg宿主体重。例如，所述剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，或者换言之，对70kg的病人而言，分别为7mgs或700mgs或在70-700mgs的范围内。示例性的治疗方法需要在每两周施用一次，或每个月一次，或每3-6个月一次。在一些方法中，可以同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，每种施用抗体的剂量可在所提示的范围内有所降低。抗体通常可在多种情况下进行施用。单次施用之间的间隔可以是周，月或年。间隔还可以是不规则的，正如通过测定病人体内针对α-SN抗体的血液水平所提示的那样。在一些方法中，可对剂量进行调节从而达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，且在一些方法中达到25-300μg/ml。或者，抗体可以持续释放配方的方式施用，在这种情况下，需要较不频繁地施用。剂量和频率随病人体内抗体的半衰期的不同而不同。一般地，人类抗体具有最长的半衰期，其次是人源化抗体，嵌合抗体和非人类抗体。施用的剂量和频率可随所述治疗是预防性的或是治疗性的而有所区别。在预防性的应用中，可在长时间阶段内以较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些病人在他们的余生中持续地接受治疗，在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直到疾病的进行得到减弱或终止，且优选地直到该病人表现出该疾病症状的部分或完全改善。之后，可以对该病人施用预防性方案。
编码免疫原的核酸剂量可为约10ng-lg，100ng-100mg，1μg-10mg，或30-300μg DNA/病人。传染性病毒载体的剂量可为10-100，或更多病毒颗粒/剂。
对预防性和/或治疗性的治疗而言，可通过肠胃外，局部，静脉内，口服，皮下，动脉内，头盖骨内，胸内，腹膜内，鼻内或肌内的方式施用诱导免疫反应的药剂。免疫原性药剂的最典型施用方法就是皮下施用，尽管其他方法也是同样有效的。其次的最普通方式是肌内注射。这类注射最常见的是在手臂或大腿肌肉上进行。在一些方法中，药剂被直接注射到能够积累沉积物的特定组织中，例如头盖骨内注射。肌内注射或静脉灌注是施用抗体的优选方法。在一些方法中，可将特定的治疗抗体直接注射到头盖骨内。在一些方法中，可以持续释放的组合物或装置，例如MedipadTM装置的方式施用抗体。
如上所述，可将分别诱导针对α-SN和Aβ免疫原的药剂组合施用。所述药剂可以是单次制剂或用于同时，依次或分别使用的试剂盒的组合。所述药剂可占据该制剂或试剂盒中的单独的小管，或可在单个小管中组合。本发明的这些药剂可以任意地与其他至少部分有效治疗LBD的药剂组合施用。在帕金森氏病和唐氏综合征的情况下，LB发生在大脑中，本发明的药剂也可以与其他能够增加本发明药剂穿过血脑屏障的药剂组合施用。
本发明的免疫原性药剂，例如肽，有时可以与佐剂组合施用。有多种佐剂可与肽，例如α-SN组合使用，从而引发免疫反应。优选的佐剂能够增强针对免疫原的内在反应而不会引起影响所述反应质量形式的免疫原的构象改变。优选的佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝，3-脱氧酰化单磷酰脂A(MPLTM)(参见GB 2220211(RIBI ImmunoChem ResearchInc.，Hamilton，Montana，Corixa的新部分)。StimulonTMQS-21是从产自于南美洲的皂树(Quillaja Saponaria Molina)树皮中分离到的三萜糖苷或皂角苷(参见Kensil等人的Vaccine DesignThe Subunit andAdjuvant Approach(eds.Powell & Newman，Plenum Press，NY，1995)；美国专利第5,057,540号)，(Aquila BioPharmaceuticals，Framingham，MA)。其他的佐剂是水包油乳剂(例如角鲨烯或花生油)，可任意地与免疫刺激物，例如单磷酰脂A(参见Stoute等人N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))，聚丙二醇与环氧乙烷的聚合物，和灭活的分支杆菌组合使用。其他的佐剂还有CpG(WO 98/40100)。或者，α-SN或Aβ可与佐剂轭合。然而，这样的轭合并不会在本质上改变α-SN的构象从而影响到其发生免疫反应的本质。佐剂可作为治疗性组合物的组分与活性药剂一起施用，或者可与所述治疗剂分别施用，同时施用，或在施用所述治疗剂之后施用。
优选的一族佐剂是铝盐(alum)，例如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝。这些佐剂既可与其他特异的免疫刺激药剂共同使用，也可以不与其他特异的免疫刺激药剂共同使用，比如MPL或3-DMP，QS-21，聚合的或单体的氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸。其他族的佐剂是水包油乳剂配方的佐剂。这些佐剂既可与其他特异的免疫刺激药剂共同使用，也可以不与其他特异的免疫刺激药剂共同使用，比如胞壁酰肽(例如，N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-去甲胞壁酰降胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)，N-乙酰谷胺氨酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异glu-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(DTP-DPP)theramideTM)，或其他细菌细胞壁组分。水包油的乳剂包括(a)MF59(WO 90/14837)，其含有5％角鲨烯，0.5％Tween 80，和0.5％Span 85(可任意含有多种量的MTP-PE)，使用微流化床器，例如HOY型微流化床器(Microfluidics，Newton MA)配制成亚微米颗粒，(b)SAF，其含有10％角鲨烯，0.4％Tween 80，5％pluronic嵌段聚合物L121，和thr-MDP，要么被微流态化成亚微米乳剂，要么被涡旋产生较大颗粒尺寸的乳剂，以及(c)RibiTM佐剂系统(RAS)，(RibiImmunoChem，Hamilton，MT)，其含有2％角鲨烯，0.2％Tween 80，以及一种或多种选自于单磷酰脂A(MPL)，海藻糖二梅菌酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)，以及细菌细胞壁骨架(CWS)，优选为MPL+CWS(DetoxTM)的细菌细胞壁成分。
其他族的优选佐剂是StimulonTM(QS-21，Aquila，Framingham，MA)或由此产生的颗粒，例如ISCOMs(免疫刺激复合物)和ISCOMATRDC。其他的佐剂包括RC-529，GM-CSF和弗氏完全佐剂(CFA)以及弗氏不完全佐剂(IFA)。其他佐剂包括细胞因子。例如白细胞介素(例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL13和IL-15)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，颗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，和肿瘤坏死因子(TNF)。其他族的佐剂是糖脂类似物，包括N-羰基酰胺，N-糖基尿素和N-糖基氨基甲酸酯，其中的每一种都在其糖残基上被氨基酸所取代，成为免疫调节物或佐剂(参见美国专利第4,855,283号)。热休克蛋白，例如，HSP70和HSP90，也可用作佐剂。
佐剂可与免疫原一起作为单组合物进行施用，或可在施用免疫原之前，同时或之后施用。免疫原和佐剂可包装在同一小管中和供应，或者包装在不同段小管中并且在使用前混合。免疫原和佐剂通常被包装在具有指明预期治疗应用标签的包装中。如果免疫原和佐剂是分别包装的，则所述包装通常包括了在使用之前进行混合的指示。对佐剂和/或载体的选择依赖于含有所述佐剂的免疫原性配方的稳定性，施用方式，剂量时间表，针对接种种属的佐剂效力，同时，在人类中，制药可接受的佐剂是经过批准的或由相关管理机构批准适于人类施用的佐剂。例如，弗氏完全佐剂并不适于人类施用。明矾，MPL和QS-21是优选的。任意地，可同时使用两种或更多种不同的佐剂。优选的组合包括明矾和MPL，明矾和QS-21，MPL和QS-21，MPL或RC-529和GM-CSF，以及明矾，QS-21和MPL一起。同样，也可以使用弗氏不完全佐剂(Chang等人，Advanced Drug Delivery Reviews 32，173-186(1998))，任意地可与任意的明矾，QS-21，和MPL及其全部组合组合使用。
本发明的药剂可通常作为含有活性治疗剂，即，以及多种其他制药可接受成分的药物组合物进行施用。参见Remington′s PharmaceuticalScience(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。因此，可在制备治疗突触核蛋白opathic疾病的治疗剂过程中使用任意的药剂(例如，α-突触核蛋白的片断或特异性结合α-突触核蛋白的抗体)。优选的形式依赖于预期的施用和治疗应用方式。所述组合物还可包括，根据所希望的配方，制药可接受的，非毒性的载体或稀释剂，其被定义为通常用来配制适于动物或人类施用的载体。可对稀释剂进行选择从而不会影响所述组合的生物学活性。这些稀释剂的例子有蒸馏水，生理性的磷酸缓冲盐水，Ring’s溶液，葡萄糖溶液，和Hank′s溶液。此外，所述制药组合物或配方还可包括其他载体，佐剂，或非治疗性，非免疫原性的稳定剂等。
药物组合物还可包括较大的，缓慢代谢的大分子，例如蛋白，多糖，例如壳聚糖，聚乙酸，聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的琼脂糖(TM)，琼脂糖，纤维素等)，聚氨基酸，氨基酸共聚物，和脂聚集物(例如油滴或脂质体)。此外，这些载体还具有免疫刺激药剂的功能(即，佐剂)。
对肠胃外施用而言，本发明的药剂可以存在于生理可接受稀释剂中的物质溶液或悬液中，与可以是无菌流体的药用载体，例如水，油，甘油，或乙醇作为可注射的药剂进行施用。此外，辅助性的物质，例如湿润剂或乳化剂，表面活性剂，pH缓冲物质等也都可存在于组合物中。其他的药物组合物成分是那些来自于石油，动物，植物或人工合成来源的，例如，花生油，大豆油，和动物油。一般地，诸如丙二醇或聚乙二醇的乙二醇是优选的液体载体，尤其适用于可注射的溶液。抗体可以被配制成允许持续释放所述活性成分的depot注射方式或植入物药剂的形式进行施用。示例性的组合物包括5mg/mL的单克隆抗体，其被配制于含有50mM L-组氨酸，150mM NaCl的水性缓冲液中，用HCl调节至pH 6.0。用于肠胃外施用的组合物通常是基本无菌的，充分等渗的，并在FDA或类似机构的GMP条件下进行生产。例如，含有生物成份的组合物可通常采用过滤灭菌进行灭菌。组合物可被配制成单剂量施用。
通常，组合物被制成可注射的，或者是液体溶液或者是悬液；还可以制备在注射前适合于存在于溶液，或悬液液体载体中的固体形式。还可将所述药剂乳化或包被于脂质体或微颗粒，例如聚交酯，聚乙交酯，或共聚物中，从而增强佐剂效果，如上所述(参见，Langer，Science249，1527(1990)以及Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-119(1997))。本发明的药剂可以允许活性成分的持续或脉冲释放方式，以depot注射或植入物药剂形式进行施用。组合物可被配制成单位剂量形式(即，所述配方含有足够针对于一个病人一次剂量的活性成分)。
适于其他施用方式的其他配方包括口服，鼻内，和肺的药剂，栓剂，和透皮应用。
对栓剂而言，粘合剂和载体包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这些栓剂可从含有0.5％-10％的活性成分，优选为1％-2％活性成分的混合物中形成。口服配方包括赋形剂，例如制药级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁。这些组合物可采用溶液，悬液，片剂，丸剂，胶囊，持续释放配方或粉剂的形式，并含有10％-95％的活性成分，优选为25％-70％。
局部应用可导致透皮或皮内的递送。局部施用可通过与含有霍乱毒素或脱毒衍生物或其亚单位或其他类似细菌毒素的药剂共施用来得以促进。(参见，Glenn等人，Nature 391，851(1998))。可通过采用作为混合物的组分或通过化学交联获得的连接分子或作为融合蛋白的表达来完成共施用。
或者，可使用皮肤途径或使用transferosomes完成透皮递送(Paul等人，Eur.J.Immunol.25，3521-24(1995)；Cevc et al，Biochem.Biophys.Acta 1368，201-15(1998))。
VIII监测的方法和诊断的方法本发明提供了在患有或易感LBD的病人中测定针对于α-SN肽和/或Aβ肽的免疫反应的方法。所述方法对施用病人的治疗过程监测尤其有用。该方法可用于监测有症状病人的治疗性治疗和无症状病人的预防性治疗。该方法可用于监测主动免疫(例如，响应于施用免疫原而产生的抗体)和被动免疫(例如，测定施用抗体的水平)。
1.主动免疫一些方法涉及在施用药剂剂量之前测定病人体内免疫反应的基线值，并且将这一基线值与治疗后的免疫反应值进行比较。免疫反应值的显著增加(即，在相同样本的重复测定中大于试验误差的常规范围，表现为与该测定平均数有一个标准偏差)说明了阳性的治疗结果(即，该药剂的施用达到或增强了免疫反应)。如果免疫反应的值并未明显改变，或降低，则提示了阴性的治疗结果。一般地，接受免疫原性药剂治疗初始阶段的病人都被预期表现出具有连续剂量的免疫反应增加，其最终会达到一个平台。当免疫反应增加时，药剂的施用通常是连续的。平台期的达到是这样一个指示，说明治疗的施用可以是不连续的，或者在剂量或频率上有所降低。
在其他方法中，可对对照人群测定免疫反应的对照值(即，平均值和标准偏差)。通常，对照人群中的个体之前并未接受过治疗。然后，可将施用治疗药剂之后病人体内的免疫反应测定值与对照值相比较。相对于对照值的明显增加(例如，大于偏离于平均值的一个标准偏差)说明了阳性的治疗结果。未出现明显的增加或降低说明了阴性的治疗结果。当免疫反应相对于对照值为增加时，药剂的施用通常是连续的。如前所述，相对于对照值的平台获得是这样一种指示，说明治疗的施用可以是不连续的，或者在剂量或频率上有所降低。
在其他方法中，可从接受了治疗剂治疗的个体且其免疫反应已达到相应于治疗平台期的对照人群中确定免疫反应的对照值(例如，平均值和标准偏差)。将在病人体内的免疫反应测定值与对照值相比较。如果在病人体内的测定水平与对照值相比并非显著不同(例如，超过一个标准偏差)，则治疗可以是不连续的。如果病人体内的所述水平明显低于对照值，则需要批准连续的药剂施用。如果病人体内的水平持续低于对照值，则需要改变治疗方法，例如，可以提示使用不同的佐剂。
在其他方法中，可监测目前并未接受治疗但之前接受过治疗病人的免疫反应，从而确定是否需要恢复治疗。可将病人体内免疫反应的测定值与之前在接受了预先治疗病人体内的免疫反应值进行比较。相对于预先测定的明显降低(即，在相同样本的重复试验中大于通常的误差范围)是这样的指示，说明治疗需要重新开始。或者，可将在病人体内的测定值与在接受治疗过程病人的人群中所测定的对照值(平均值加标准偏差)进行比较。或者，可将病人体内的测定值与接受预防治疗未表现出疾病症状病人人群，或接受治疗性治疗表现出疾病特征改善病人人群中的对照值进行比较。在所有这些情况下，相对于对照水平的明显降低(即，超过一个标准偏差)是这样的指示，说明应该在病人中重新开始治疗。
用于分析的组织样本通常是来自于病人的血液，血浆，血清，粘液或脑脊液。对样本进行分析从而提示对任意形式的α-SN，通常是NAC，或Aβ产生免疫反应。可根据对，例如，特异性结合α-SN或Aβ的抗体或T-细胞的存在来测定免疫反应。测定特异于α-SN的ELISA方法在实施例部分中已有描述。测定具有反应活性T-细胞的方法也在前文有所描述(参见，定义)。在一些方法中，可使用清除分析，例如在之前部分VI中所述的方法测定免疫反应。在这些方法中，可将来自于病人的组织或血液样本与具有Fc受体的LB(例如，来自突触核蛋白/hAPP转基因小鼠)和吞噬细胞相接触。随后对LB的清除进行监测。清除反应的存在和程度提供了在接受检测病人的组织样本中，有效清除α-SN的抗体存在和水平的提示。
2.被动免疫一般地，被动免疫的监测过程与上述对主动免疫进行监测的过程相类似。然而，被动免疫之后的抗体分布通常表现出在抗体浓度上的立即升高，然后是呈指数的衰减。在不进行进一步增加剂量的情况下，根据所施用抗体的半衰期，在数天至数月内，所述衰退即可达到治疗前的水平。例如，一些人类抗体的半衰期是20天的数量级。
在一些方法中，在施用之前进行一次在病人体内针对α-SN抗体的基准值测定，然后再进行第二次测定从而确定峰抗体水平，并且不时地进行一次或多次深入测定从而监测抗体水平的衰减。当抗体水平降低至基准值或低于基准预定峰的百分比时(例如，50％，25％或10％)，需要施用进一步的抗体剂量施用。在一些方法中，可将峰值或随后所测定的低于背景的水平与之前测定的参考水平进行比较，从而在其他病人中制定有益的预防性或治疗性治疗方法。如果所测定的抗体水平明显低于参考水平(例如，在受益于治疗的病人人群中低于平均值减去一个标准偏差的参考值)，则提示需要给要额外剂量的抗体。
3.诊断试剂盒本发明还提供了可以实施上述诊断方法的诊断试剂盒。通常，这样的试剂盒都含有能够特异性结合针对于α-SN抗体的药剂。该试剂盒还可包括有标记。为了检测针对于α-SN的抗体，所述标记通常以标记的抗-特异型抗体形式存在。为了对抗体进行检测，所述药剂可以预先结合固相，例如结合微滴定盘小孔的形式来提供。试剂盒还通常含有提供指导使用试剂盒的标签。该标签还可包括图表，或具有针对α-SN抗体水平的其他对应方法相关标准的测定标签。术语标签是指在其生产，运输，销售或使用过程中的任意时间都附着于或与试剂盒存在于一起的书写或记录材料。例如，术语标签可以包括广告页和小册子，包装材料，使用说明，音频或视频卡带，计算机软盘，以及直接印制于试剂盒上的书写材料。
本发明还提供了实施体内造影的诊断试剂盒。这样的试剂盒通常含有结合α-SN，优选为在NAC范围之内表位的抗体。优选的，对所述抗体进行标记或在所述试剂盒中含有第二标记试剂。优选地，所述试剂盒标记有实施体内影像分析的说明书。
IX.体内显影本发明提供了在病人体内显影LB的方法。这样的方法对诊断或确证PD的诊断，或其他与大脑中LB存在相关疾病或易感于此种疾病的诊断非常有效。例如，可对表现出痴呆症状的病人使用这种方法。如果该病人具有LB，则该病人有可能患有，例如，PD。该方法还可用于无症状的病人。淀粉样异常沉积的存在说明了未来有症状疾病的易感性。该方法还可用于在之前被诊断患有帕金森氏病的病人中监测疾病发展和/或对治疗的反应。
该方法通过在病人中施用药剂，例如结合α-SN的抗体，并随后在其结合后测定所述药剂来完成。优选的抗体可在病人体内结合α-SN沉积物而不会结合全长NACP多肽。结合NAC内α-SN表位的抗体是特别优选地。如果需要的话，可通过使用缺乏全长恒定区，例如Fab的抗体片段来避免清除反应。在一些方法中，相同的抗体及可用作治疗试剂又可用作诊断试剂。一般地，结合α-SN N-末端表位的抗体并不会表现出与结合C-末端表位抗体相同强度的信号，据推测，这是因为在Lb中N-末端表位较不容易接近(Spillantini等人，PNAS，1998)。因此，这样的抗体是较不优选的。
可通过向病人体内静脉注射，或通过头盖骨内注射直接进入大脑，或通过在头盖骨上钻穿一个洞来施用诊断试剂。所述试剂的剂量应该保持在用于治疗方法的相同范围之内。通常，所述试剂是标记的，尽管在一些方法中，对α-SN具有亲和力的初级试剂是未标记的，但却使用了结合所述初级试剂的次级标记药剂。对标记的选择依赖于检测的方式。例如，荧光标记可适用于光学检测。顺磁标记可适用于层析成象检测而不会引起外科手术介入。也可使用PET或SPECT检测放射性标记。
可通过对标记位点的数量，尺寸和/或密度与对应基线值进行比较实施诊断。基线值可代表在未患病个体人群中的平均值水平。基线值还可代表在相同病人中测定的之前的水平。例如，可在开始治疗之前在病人中测定基线值，并将其后的测定值与所述基线值进行比较。相对于基线值的降低表明了对治疗产生了阳性反应。
实施例实施例I用人α-突触核蛋白免疫人α-突触核蛋白转基因小鼠导致了高滴度的能够穿过血脑屏障的抗α-突触核蛋白抗体的产生以1mg/ml的浓度将全长重组人α-SN重悬于1X磷酸缓冲液中(PBS)。对每一次注射而言，使用50μlα-SN；得到50μg每次注射的终浓度，然后再加入150μllX PBS。然后向α-SN或单独的PBS(对照)中以1∶1加入弗氏完全佐剂，漩涡并超声波处理从而完全重悬所述乳液。对初次注射而言，8只4-7月龄的单转基因D系人α-SN转基因(tg)小鼠(Masliah等人，Science 2871265-1269(2000))接受了CFA中的人α-SN注射，作为对照，4只D系人α-SN tg小鼠接受了CFA中的PBS注射。小鼠接受了总共6次注射。三次注射是在间隔两周的条件下完成了，而随后三次注射是以一个月为间隔的。在实验开始5个月之后，根据对动物进行人道处理的NIH指南处死动物。在将血液样本收集进行抗体滴度测定之后，将大脑在4％多聚甲醛的PBS溶液中浸没固定4天。通过ELISA测定的针对人α-SN的抗体水平如表1所示。根据滴度将所处理的小鼠分为两组。第一组表现出2-8,000的适当滴度。第二组表现出12000-30000的更高滴度。在对照组中未发现滴度。神经病理学分析表明，产生较高滴度的小鼠具有突触核蛋白包涵体尺寸的显著降低。产生适当滴度的小鼠具有较小的降低。图2(实验组a-d)所示为在(a)非转基因小鼠，(b)仅使用CFA处理的转基因小鼠，(c)用α-突触核蛋白和表现出适当滴度的CFA免疫的转基因小鼠，和(d)用α-突触核蛋白和表现出较高滴度的CFA免疫的转基因小鼠中的突触核蛋白包涵体。通过使用抗人α-SN抗体进行免疫染色使样本可视化。图2说明了在实验组(b)而非实验组(a)中有突触核蛋白包涵体。在实验组(c)中，处理的小鼠，适当的滴度，所述包涵体都在密度上有所降低，实验组(d)中，所述包涵体在密度上显著降低。实验组(e)-(h)分别所示为与实验组(a)-(d)中相同的4只小鼠大脑中的抗-IgG水平。可以看出，在实验组(g)中有IgG存在，而在实验组(h)中其程度更高。这些数据说明外周施用的针对于α-SN的抗体穿过了血脑屏障并到达的大脑。实验组(i)-(l)所示为对GAP，astroglial cell细胞标记进行的染色，同样也是如图中前两列中的那四只相同的小鼠。可以看出，与实验组(i)和(j)相比，实验组(k)和(l)表现出适当增高的染色情况。这些数据说明突触核蛋白沉淀物的清除伴随着温和的astroglial和小神经胶质细胞反应。
表1

实施例II清除突触核蛋白包涵体的抗体的体外筛选用表达鼠α-SN的pCR3.1-T表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染GT1-7神经元细胞(Hsue等人Am.J.Pathol.157401-410(2000))，并与使用单独的表达载体进行转染的细胞进行比较(图3，分别为实验组B和A)。用载体单独进行转染的细胞(实验组A)具有呈纤维化表现，而用α-SN转染的细胞则是圆的，并可通过光学和共聚焦扫描显微镜对细胞表面的包含体进行观察。然后用兔预免疫血清(实验组C)或67-10，亲和纯化的针对于鼠α-SN C末端残基131-140的兔多克隆抗体(Iwai等人，Neuron 14467(1995))(实验组D)处理转染的细胞。可以看出，使用预免疫血清或针对于α-SN的抗体进行处理，细胞质组分中的突触核蛋白水平并未发生较大改变。然而，在使用针对α-SN的抗体处理的GT1-7细胞膜组分中，α-SN条带消失。这些数据说明，α-突触核蛋白抗体活性导致了与细胞膜相关突触核蛋白的清除。
转染的GT1-7细胞可用来筛选抗体，从而通过免疫组织化学分析，如图3所示的光学显微镜分析，或通过如图4所示的凝胶分析来测定抗体在清除突触核蛋白包涵体中的活性。
实施例III用α-突触核蛋白进行免疫的预防效力和治疗效力i.对人α-突触核蛋白转基因小鼠的免疫对本研究而言，所使用的是杂合子人α-SN转基因(tg)小鼠(D系)(Masliah et al，2000，Science 2861265-69)和非转基因(nontg)的对照。实验动物被分为3组。对第I组而言，通过从2月龄开始对小鼠进行8个月的免疫测定早期免疫的预防性效果。对第II组而言，在6月龄开始对年轻的成年小鼠进行免疫8个月来测定是否一旦建立了适当的病理学，免疫就可降低疾病的发展。对第III组而言，在12月龄对成年小鼠免疫4个月来确定是否一旦建立了较强的病理学，免疫就可降低症状的严重程度。对全部分组而言，可使用重组人α-SN加上CFA或仅有CFA来免疫小鼠，且每个实验使用20只转基因和l0只非转基因小鼠。其中，使用人α-SN+CFA对10只转基因小鼠进行免疫，而仅使用CFA对其他10只转基因小鼠进行免疫。类似的，用人α-SN+CFA对5只非转基因小鼠进行免疫，而仅使用CFA对其他5只非转基因小鼠进行免疫。简言之，免疫程序包括用存在于CFA中的纯化重组人α-SN(2mg/ml)进行初次注射，然后在1个月之后用人α-SN与IFA组合进行再次注射。然后用这一混合物每个月对小鼠进行一次重新注射。在人α-SN tg(n＝3/每组；6月龄)和nontg(n＝3/每组；6月龄)小鼠的亚组中，还进行了用鼠(m)α-SN，人β-突触核蛋白或突变(A53T)人α-SN进行免疫的其他实验。
用96孔微滴定板测定α-SN抗体的水平，以0.4μg每小孔的纯化全长α-SN，通过在4℃碳酸钠缓冲液，pH9.6中过夜孵育对该微滴定板进行包被。用含有0.1％Tween的200μl PBS将小孔洗涤四次，并在37℃用PBS-1％BSA封闭1小时。将血清样本“在小孔中”连续稀释，1∶3，从列A开始，范围从1∶150一直稀释至1∶328,050。对对照实验而言，将小鼠单克隆抗体的样本与α-SN进行比较，没有蛋白和仅有缓冲液的空白。将样本在40℃孵育过夜，然后与羊抗鼠IgG碱性磷酸酶轭合抗体(1∶7500，Promega，Madison，WI)孵育2小时。然后在室温加入Atto-phos碱性磷酸酶荧光底物保持30分钟。将所述板在激发波长450nm和发射波长550nm的条件下进行读数。以相对荧光单位为纵坐标，血清稀释度为横坐标，将所得结果进行半对数作图。抗体滴度定义为最大抗体结合降低50％时的稀释度。
对每一小组而言，在处理结束时，小鼠将在rotarod中经历运动评价，如上所述(Masliah，et al.(2000))。完成分析之后，将小鼠处死并将大脑取出进行如下所述的详细神经化学和神经病理学分析。简言之，将右半脑冷冻并且匀浆从而通过Western印迹测定聚集和非聚集的人α-SN免疫反应活性(Masliah，et al.(2000))。将左半脑固定于4％多聚甲醛中，在振动切片机上连续切片从而进行免疫细胞化学和超微结构分析。
ii.免疫细胞化学和神经病理学分析。
为了测定是否免疫有所降低，可使用针对人α-SN(1∶500)的兔多克隆抗体对人α-SN聚集切片进行免疫染色。在4℃孵育过夜之后，将切片与生物素偶联的抗兔二抗孵育，然后再与抗生物素蛋白D-辣根过氧化物酶(HPR)复合物(1∶200，ABC Elite，Vector)孵育。还可以使用生物素偶联的抗兔，抗鼠或抗人的二抗单独对切片进行免疫染色。使用抗鼠二抗进行的实验确定了是否所述抗体是针对进入脑部的人α-SN。使用0.1％溶于50mmol Tris-HCl(pH7.4)的3，3-二氨基联苯胺四氢盐酸(DAB)和使用0.001％H2O2可对反应进行显色，且随后在Entellan的条件下将切片制成载玻片上的标本。使用Quantimet 570C通过光密度分析半定量地测定了免疫反应活性的水平。还通过影像分析对这些切片进行研究从而确定α-SN免疫反应活性包涵体的数量，并且这种可靠的对α-SN聚集物的测定也可作为对接种所产生抗聚集效果的有价值指数(Masliah，et al.(2000))。
利用突触素和微管相关蛋白2(MAP2)双荧光标记的振动切片机切片和LSCM的可视化效果，可以通过在海马，额皮层，颞皮层和基底神经节中分析突触和树突密度来实现对神经变性模式的分析。如前所述(Masliah，et al.(2000))，还可通过测定caudoputamen和黑质(SN)中的酪氨酸羟化酶(TH)免疫活性来实现对神经变性的其他分析。使用LSCM对切片进行显影，并将每个单独影像的阈值相互交换，从而使得在线性范围内显示出像素亮度的TH-免疫活性末端被包括在内。可设定一个比例尺从而将将像素确定至μm比例。然后，这些信息可用来计算有百分之多少的神经纤维网为TH-免疫活性末端所覆盖。这些相同的切片还可以用来测定在所述SN中TH神经元的数量。
为了评估对于免疫作用的免疫反应模式，可在用重组人α-SN和对照免疫原免疫的非转基因和α-SN转基因小鼠的大脑切片中，使用针对人GFAP，MHC IL类Mac I，TNF-α，IL1β和IL6的抗体进行免疫细胞化学和超微结构分析。
iii.行为分析对运动活性而言，将小鼠在rotarod(San Diego)Instruments，(SanDiego，CA)设备上分析2天，如前所述(Masliah，et al.(2000))。在第一天，对小鼠训练5次第一次为10rpm，第二次为20rpm，第三至五次为40rpm。在第二天，每次在40rpm对小鼠进行7次检测。将小鼠单独地放置于圆筒中，并在240秒的时间内将旋转速度从0增加至40rpm。记录小时保持在杆上(跌落潜伏期)的时间长度，并将其用作运动功能的测量。
实施例IV 用α-突触核蛋白片段进行免疫用9种不同区域的α-SN免疫10-13月龄的人α-SN转基因小鼠，从而确定哪一种表位传递了有效的反应。如上所述，将9种不同的免疫原和一种对照进行i.p.注射。所述免疫原包括四种人α-SN台轭合物，通过胱氨酸连接全部轭合于羊抗鼠IgG。α-SN和PBS分别用作阳性和阴性对照。如上所述监测滴度，并在注射的3-12月末处死小鼠。验尸之后确定组织化学，α-SN水平和毒理分析。
i.免疫原的制备轭合α-SN肽的制备使用交联剂硫化-EMCS，通过向α-SN肽加上人工半胱氨酸进行轭合制备了Hα-SN肽轭合物。可使用以下的最终氨基酸序列合成α-SN肽的衍生物。在每一种情况下，通过下划线指明了所插入半胱氨酸残基的位点。
α-突触核蛋白60-72(NAC区)肽NH2-KEQVTNVCGGAWT-COOH(SEQ ID NO54)α-突触核蛋白73-84(NAC区)肽NH2-GVTAVAQKTVECG-COOH(SEQ ID NO55)α-突触核蛋白102-112肽NH2-C-氨基庚酸-KNEEGAPCQEG-COOH(SEQ ID NO56)
α-突触核蛋白128-140肽Ac-NH-PSEEGYQDYEPECA-COOH(SEQ ID NO57)为了制备轭合反应，将10mg羊抗鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories)在10mM硼酸钠缓冲液，pH8.5中透析过夜。然后使用Amicon Centriprep tube将所透析的抗体浓缩至2mL体积。将10mg硫化-EMCS[N-(ε-马来酰亚胺cuproyloxy)琥珀酰亚胺](MolecularSciences Co.)溶解于1ml去离子水中。在搅拌羊抗鼠IgG的前提下逐滴加入40倍摩尔数过量的硫化-EMCS，并随后将所述溶液再搅拌10分钟。将活化的羊抗鼠IgG纯化，并通过用0.1M NaPO4，5mM EDTA，pH6.5平衡的10ml凝胶过滤柱(Pierce Presto Column，obtained fromPierce Chemicals)进行缓冲液交换。将在280nm吸收鉴定的含有组分的抗体合并，并使用1.4mg/OD作为消光系数将其稀释至约1mg/mL的浓度。将40倍摩尔数过量的α-SN肽溶解于20ml的10mM NaPO4，pH8.0中，除非将那10mgα-SN肽先溶解于0.5mL DMSO中，然后用10mMNaPO4缓冲液稀释至20mL。向每种肽溶液中加入10mL活化的羊抗鼠IgG，并在室温振荡4小时。使用Amicon Centriprep tube将所得轭合物浓缩至终体积小于10mL，并随后用PBS进行透析从而进行缓冲液交换并去除游离肽。将所述轭合物通过0.22μm孔径的滤器进行过滤，并随后等分为1mg的组分并冷冻保存于-20℃。可使用BCA蛋白分析(PierceChemicals)，以马IgG为标准曲线测定所述轭合物的浓度。根据轭合肽相对于活化羊抗小鼠IgG的分子量有所增加，记录了轭合作用。
实施例V 使用针对α-突触核蛋白的抗体进行被动免疫如下所述，向每只人α-SN小鼠注射0.5mg溶于PBS的抗α-SN单克隆抗体。对所有抗体药剂都进行了纯化从而具有较低的内毒素水平。可通过向小鼠注射α-SN的片段或较长形式，制备杂交瘤和筛选杂交瘤以获得能够特异性结合所希望α-SN片段而不会结合α-SN的其他非重叠片段的抗体，来制备针对于片段的单克隆抗体根据需要向小鼠ip注射超过4个月的时间段，从而将由ELISA测定的循环抗体浓度滴度维持在高于由ELISA限定的针对于α-SN或其他免疫原的1∶1000。如上所述对滴度进行监测，并在注射6个月末处死小鼠。尸检后进行组织化学，α-SN水平和毒理分析。
实施例VI Syn/APP转基因小鼠的Aβ免疫本实验比较了Aβ免疫对三类转基因小鼠的效果具有α-突触核蛋白转基因(SYN)的转基因小鼠，具有APP转基因的APP小鼠(Games等人)，和通过将所述但转基因小鼠交配产生的双转基因SYN/APP小鼠。双转基因小鼠的描述可见于Masliah et al，PNAS USA 9812245-12250(2001)。这些小鼠代表了同时具有Alzheimer′s和帕金森氏病的个体。表2所示为用于本研究中小鼠的不同分组和年龄，治疗过程以及针对于Aβ的抗体滴度。可以看出，在所有三类小鼠中都产生了明显的滴度。图5所示为通过对治疗对象的大脑切片进行显微检测，确定了在其大脑中由Aβ的淀粉样斑块所覆盖的面积百分数。基本上沉淀都聚集在APP和SYN/APP小鼠中，而不是SYN小鼠或非转基因对照中。所述沉淀大于SYN/APP双转基因小鼠中的沉淀。用Aβ1-42进行免疫降低了在APP和SYN/APP小鼠中的沉淀。图6所示为通过共聚焦激光扫描和光学显微技术检测道德在不同小鼠分组中的突触核蛋白沉淀。突触核蛋白沉淀可在仅用CFA处理的SYN和SYN/APP小鼠中聚集。然而，在使用Aβ1-42和CFA处理的相同类型小鼠中，存在有突触核蛋白沉淀水平的显著降低。这些数据说明用Aβ进行治疗不仅有效地清除了Aβ沉淀，还有效地清除了突触核蛋白。因此，用Aβ或针对其的抗体进行治疗可有效地不仅治疗阿尔茨海默氏病，还可治疗阿尔茨海默氏病和帕金森氏病的组合，以及没有阿尔茨海默氏病的帕金森氏病病人。在SYN/APP小鼠中的抗Aβ抗体滴度与突触核蛋白包涵体形成的降低相关(r＝-0.71，p＜0.01)。
表2


实施例VII 对针对淀粉样沉积的抗体活性进行离体筛选分析为了测定抗体对斑块清除的效果，我们建立了活体外分析方法，其中或者使用PDAPP小鼠或者使用人AD大脑的未固定低温保持切片来培养初级小神经胶质细胞。可从新生DBA/2N小鼠(1-3天)的大脑皮层中获得初级小神经胶质细胞。用50μg/ml的DNA酶I(Sigma)在HBSS(Hanks′Balanced Salt Solution，Sigma)中机械性地分离皮层。用100μm的细胞容器(Falcon)过滤所分离的细胞，并在1000rpm离心5分钟。将沉淀重悬于生长培养基(高糖DMEM，10％FBS，25ng/mlrmGM-CSF)中，并以每个T-75培养瓶2个大脑的密度接种所述细胞。7-9天后，将培养瓶在37℃的定轨摇床上以200rpm旋转2小时。以1000rpm离心所述细胞悬液，并在分析培养基中重悬。
将PDAPP小鼠或人AD大脑(＜3小时间隔之内的尸检)的10μm的低温保持切片溶解，在聚赖氨酸包被的圆玻璃盖玻片上制成标本，并放置在24孔组织培养板的小孔中。用含有1％FBS，谷氨酰胺，青霉素/链霉素，和5ng/ml rmGM-CSF(R&D)的H-SFM(杂交瘤无血清培养基，Gibco BRL)分析培养基洗涤两次盖玻片。以2x浓度(5μg/ml终浓度)加入对照或抗Aβ抗体，保持1小时。然后以0.8×106细胞/ml的密度将小神经胶质细胞接种于分析培养基。在湿润的培养箱(37℃，5％CO2)中将所述培养维持24小时或更长时间。在孵育结束时，用4％多聚甲醛固定培养物，并用0.1％Triton-X100进行渗透。用生物素偶联的3D6，然后采用链霉抗生物素蛋白/Cy3轭合物(Jackson IrnmunoResearch)对切片进行染色。通过细胞核染色(DAPI)可以看到外源小神经胶质细胞。采用倒置荧光显微镜(Nikon TE300)对培养物进行观察，并使用具有SPOT软件的SPOT数码相机(Diagnostic instruments)进行显微照相。对Western印迹分析而言，用8M尿素对培养物进行提取，以1∶1在还原tricine样本缓冲液中进行稀释，并上样于16％的tricine凝胶(Novex)。在转移至immobilon之后，将印迹暴露于5μg/ml的pabAβ42然后是HPR-轭合的抗鼠抗体，并用ECL(Amersham)进行显色。
当使用PDAPP大脑切片，在存在针对斑块数量和尺寸显著降低的NAC抗体的条件下进行分析时，可以观察到所述抗体清除活性的指示。针对于NAC的抗体可与含有淀粉样斑块的脑组织和小神经胶质细胞相接触，如上所述。兔血清被用作对照。
在存在有若干针对Aβ的抗体的条件下，可使用PDAPP大脑切片进行相同的分析。将抗体在离体分析中诱导吞噬作用的能力和在被动转移研究中诱导体内斑块附带的能力进行了比较。这些结果说明体内的效力应归因于直接的抗体介导的在CNS内的斑块清除，而离体活性分析是体内效力的预告。(参见，WO 00/72880中实施例XIV的表16和17；以及，WO 0072876中实施例XTV的表16，处于全部目的在此将两个专利全文引用作用参考)实施例VIII 使用α-突触核蛋白进行主动免疫A.材料与方法hα-突触核蛋白转基因小鼠的免疫。对本研究而言，所使用的是在得自血小板生长因子β(PDGFβ)启动子调节控制之下表达hα-突触核蛋白的杂合子转基因小鼠(D系)(Maliah，2000，Science 2871265-69)。之所以这些动物被选中是因为其在大脑中发展了hα-突触核蛋白免疫反应活性的包涵体，以及模拟了LBD某一方面的神经变性和运动缺陷。将实验动物分成2组。对第一组而言，用重组hα-突触核蛋白(n＝10)或单独的佐剂(n＝10)对总共20只年轻的(3月龄)转基因小鼠免疫8个月。对第二组而言，用重组hα-突触核蛋白(n＝10)或单独的佐剂(n＝10)对总共20只年轻的成年(6月龄)转基因小鼠免疫8个月。免疫程序包括用重组hα-突触核蛋白(80μg/ml，100μl)用弗氏完全佐剂(CFA)进行初次注射。两周之后，小鼠接受另一次hα-突触核蛋白(80μg/ml，100μl)用弗氏不完全佐剂的注射，然后每月一次用溶于磷酸缓冲盐水中的hα-突触核蛋白(80μg/ml，100μl)进行再次注射(在随后的7个月中)。如上所述制备和纯化重组hα-突触核蛋白(Masliah et al.，2005，Neuron 46857-68)，并检测内毒素。
抗体滴度的测定和对于hα-突触核蛋白的相对亲和力。使用用每小孔0.4μg纯化的全长α-突触核蛋白包被的96孔微滴定板测定血浆中的hα-突触核蛋白抗体水平。将样本在4℃孵育过夜，然后洗涤，并用羊抗鼠IgG碱性磷酸酶轭合抗体(1∶7500，Promega，Madison，WI)进行孵育。将所述板在激发波长450nm和发射波长550nm的条件下进行读数。以相对荧光单位为纵坐标，血清稀释度为横坐标，将所得结果进行半对数作图。抗体滴度定义为最大抗体结合降低50％时的稀释度。
为了测定在免疫小鼠中产生抗体对于hα-突触核蛋白的相对亲和力，进行了两组实验。在第一个实验中，在多通道设备(Invitrogen，Carlsbad，CA)的小凝胶中对来自未免疫hα-突触核蛋白转基因小鼠的大脑匀浆进行电泳。每条泳道都用来自于各个小鼠的稀释血清进行孵育，印迹至硝酸纤维素上，并与次级兔抗鼠抗体孵育，然后与I125标记的蛋白A孵育(Alford et al.，J.Histochem.Cytochem 42283-287(1994))。对印迹进行显影，并用Phosphorlmager(Molecular Dynamics，Piscataway，NJ)进行分析。使用ImageQuant软件(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)对免疫反应活性条带进行定量。对第二组实验而言，将来自未免疫hα-突触核蛋白转基因小鼠的连续振动切片机切片在来自于每个处理小鼠稀释血清的溶液中进行孵育，然后与生物素偶联的马抗鼠IgG(1∶100，Vector)，抗生物素蛋白D-辣根过氧化物酶(HPR，1∶200，ABC Elite，Vector)孵育，并与含有0.001％H2O2的二氨基联苯胺四氢盐酸(DAB)反应。镜检之后，根据所标记的细胞分隔(神经元细胞体，突触和包涵体)和免疫反应活性的程度(0＝没有，1＝非常轻微，2＝轻微，3＝适中，4＝强烈)对切片进行评分。
hα-突触核蛋白抗体的表位作图。hα-突触核蛋白抗体所识别的表位可通过测定抗体与覆盖全部hα-突触核蛋白序列的重叠线性肽结合的ELISA来确定。具有hα-突触核蛋白(Mimotopes，San Diego，CA)序列的C-末端生物素偶联肽被制备成具有15个氨基酸的长肽，其具有12个残基重叠和一步3个残基每肽。总共43个肽被用来步行hα-突触核蛋白的140个氨基酸序列，最后的肽具有13个氨基酸的重叠和一步2个氨基酸。此外，最后3个肽是重复的，但生物素偶联只发生在肽的N-末端。这样的完成可以改善抗体对肽C-末端的进入，并允许鉴定游离C-末端的特异性抗体。而且，可将这种分析中加入其他特征，从而允许在抗体和hα-突触核蛋白非淀粉样β(Aβ)组分(NAC)区域(61-95)之间相互作用的更彻底检查。因为本分析中的第21个肽已经含有了NAC区域的游离N-末端，可以加上含有NAC区域游离C-末端的其他N-末端生物素偶联肽，从而完整对总共47个肽的分析。
为了进行所述分析，可将这些生物素偶联肽以5nM的浓度包被过夜沉降至用链霉抗生物素蛋白预包被的ELISA板上(Pierce，Rockford，IL)。然后洗涤所述板，并将稀释至滴度等于6的血清样本加入，孵育1小时。以1∶1000将滴度低于5000的血清样本稀释从而进行这样的孵育。在进行另一个洗涤步骤之后，使用种属特异性的轭合于HPR的二抗，在比色ELISA形式中检测结合的抗体。
组织处理。将小鼠处死，并取出大脑进行如下所述的详细神经化学和神经病理学分析。简言之，将右半脑冷冻并且匀浆从而通过Western印迹测定聚集和非聚集的hα-突触核蛋白免疫反应活性(Masliah，et al.(2000)，上述的)。将左半脑固定于4％多聚甲醛(PFA)中，在振动切片机(Leica，Wetzlar，Germany)上连续切片从而进行免疫细胞化学(ICC)和超微结构分析。
突触体制备和免疫印迹分析。为了确证在转基因小鼠大脑中免疫对于α-突触核蛋白积累的效果，可使用蔗糖梯度制备突触体组分，并采用SDS-PAGE在10％的tris-乙酸聚丙烯酰胺凝胶(NuP AGETM，Invitrogen)上进行分析。可用针对hα-突触核蛋白(LB509，1∶1000，Transduction Laboratories，San Diego，CA)和突触泡蛋白(1∶20，Chemicon，Temecula，CA)的一抗，和标记有HRP的羊抗鼠IgG二抗(1∶5000，SantaCruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)对免疫印迹进行探查，并通过增加的化学发光可视化，并通过Versadoc XL显影装置(BioRad，Hercules，CA)进行分析。
神经病理学和免疫细胞化学分析。简言之，如前所述(Masliah etal.，2000)，上文已提到的，为了调查免疫对hα-突触核蛋白聚集的效果，可将连续切片的，游离飘游的，盲编号的振动切片机切片在4℃，与亲和纯化的抗hα-突触核蛋白特异性抗体孵育过夜，所述抗hα-突触核蛋白特异性抗体是如上所述(Masliah et al.，2000，前述的)，通过用含有氨基酸101-124的合成hα-突触核蛋白免疫兔子制备的。与一抗孵育之后是与生物素偶联的羊抗兔IgG(1∶100，Vector)，抗生物素蛋白D-HPR(1∶200，ABC Elite，Vector)孵育，并与含有0.001％H2O2的DAB四氢盐酸反应。为了测定新皮层中hα-突触核蛋白免疫反应活性包涵体的数量，使用Quantimet 570C(Leica)对切片进行分析。对每一种情况，分析三个切片，并将结果平均，并表达为每平方mm的数量。通过使用针对神经胶质标记，包括CD45(1∶1000，DakoCytomation，Carpinteria，CA)和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP，1∶500，Chemicon)的抗体进行免疫反应切片，完成了更深入的免疫细胞化学分析。
如前所述(Hashimoto et al，，Neuron 32213-223(2001))，实施了双免疫细胞化学分析，来确定免疫对神经末端密度和突触中hα-突触核蛋白积累的影响。出于这一目的，可使用针对hα-突触核蛋白(1∶1000)的多克隆抗体和使用针对突触泡蛋白(Chemicon)的单克隆抗体对振动切片机切片进行双重标记。可使用Tyramide Red(1∶2000，Roche)测定hα-突触核蛋白，而使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的马抗鼠IgG测定突触泡蛋白。对每一中情况而言，都对切片进行重复的免疫标记，并使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)进行分析和NIH Image 1.43软件来计算在新皮层中由突触泡蛋白-免疫反应活性末端所覆盖神经纤维网的面积百分数(Mucke et al.，J.Neurosci 204050-4058(2000))，以及hα-突触核蛋白阳性的突触泡蛋白-免疫反应活性末端的比率。为了确证一抗的特异性，可进行对照实验，其中将切片在缺乏一抗(除去)的条件下孵育过夜，并用20倍过量的对应肽或预免疫血清对一抗预吸附48小时。
所有的切片都在相同的条件下同时处理，为了评估结果的重复性，实验都进行两次。在装有MRC1024 LSCM系统(BioRad，Wattford，UK)使用Zeiss 63X(N.A.1.4)物镜的Axiovert 35显微镜(Zeiss，Germany)上对切片进行成像(Masliah et al.，2000，前述的)。
统计分析。使用两尾不成对的学生氏t-检验对不同组之间进行统计比较。进行线性回归分析以确证变量之间的关系。应用了Bonferroni矫正来解决多重比较。
B.结果抗体滴度，亲和力以及表位作图的表征在两个实验组中在3个时间点(接种后的2周，6个月和9个月)上对抗体滴度进行分析。抗体滴度可在小鼠之间发生相当的差异，在归属于组I的动物中，用hα-突触核蛋白免疫的小鼠中抗体滴度可从200-20,000(表3)。
表3.α-突触核蛋白滴度和免疫印迹亲和力的小节(对滴度的矫正)


在这一组中，平均滴度随时间略有增加。类似的，对组II而言，用hα-突触核蛋白免疫动物表现出的抗体滴度可从200-13,000(表3)。然而，其平均滴度水平在第一次测定时较高，虽后随时间而降低。免疫印迹分析也表明小鼠个体之间对于识别hα-突触核蛋白能力的显著可变性。总而言之，与来自组I的免疫小鼠相比，来自组II小鼠的抗体相对亲和性水平要高一些(表4)。
表4免疫印迹亲和力，神经病理学和滴度之间的相关。

通过ICC，来自hα-突触核蛋白接种小鼠的血清表现出对神经元，神经元内包涵体，和突触前末端具有标记作用。相反，单独用作及处理的小鼠则表现出对细胞体的弥散和非特异性轻微染色。与来自于组I的免疫小鼠相比，来自组II小鼠的血清表现出在转基因小鼠的突触和神经元中识别hα-突触核蛋白的较高亲和力(图4)。
表位作图研究说明在用hα-突触核蛋白接种的小鼠中，抗体最频繁地识别hα-突触核蛋白C-末端区域内的肽表位(图8)。此外，也会偶尔识别针对于其他表位的抗体。相反，使用单独用CFA处理小鼠的血清未测定到任何反应活性或抗体表位。
免疫降低了hα-突触核蛋白的积累并保持了转基因小鼠大脑中的突触密度。
为了测定免疫治疗对hα-突触核蛋白积累的效果，用针对于hα-突触核蛋白的抗体对切片进行标记，并通过明场显微镜或LSCM进行分析。在转基因小鼠中，可在神经纤维网和神经元内包涵体中观察到丰富的hα-突触核蛋白免疫反应活性。与仅使用CFA处理的转基因小鼠相比，两个免疫组的小鼠都表现出在颞皮层中包涵体数量的可比较性降低(约25％)(图9A)。此外，免疫导致了在神经纤维网中hα-突触核蛋白免疫反应活性的降低。当与用CFA单独处理的转基因小鼠进行比较时，来自组II小鼠的这一效果要比来自组I小鼠的这一效果要更明显(图9A)。为了确定是否所述免疫效果的确与抗体诱导神经元hα-突触核蛋白积累或与屏蔽效果相关联，通过比较用CFA单独处理的和hα-突触核蛋白接种转基因小鼠之间的β-突触核蛋白免疫活性水平，进行了对照实验。与β-突触核蛋白的公知分布相一致，其是α-突触核蛋白的亲密同源物(Iwai et al.，Neuron 14467-475(1994))，可在神经纤维网中观察到丰富的β-突触核蛋白免疫反应活性，以及与之相关联的在神经元细胞体，而非在包涵体中检测到的突触前末端和轻微的免疫标记。与用CFA单独处理的转基因小鼠相比，在用hα-突触核蛋白免疫的小鼠中未发现β-突触核蛋白分布和水平的差异。为了进一步研究hα-突触核蛋白抗体效果的特异性，可对用CFA单独处理和用hα-突触核蛋白免疫转基因小鼠的鼠(m)α-突触核蛋白免疫活性水平进行比较。与hα-突触核蛋白相类似，mα-突触核蛋白的免疫反应活性在神经纤维网中也是丰富的，并与神经末端相关联，但却在神经元细胞体和所述包涵体中缺乏。在CFA和hα-突触核蛋白免疫的小鼠中，mα-突触核蛋白的分布和水平都是可比较的。综上，这些研究说明接种特异性地影响了hα-突触核蛋白而不是其他相关的突触分子。
为了进一步确证免疫治疗对神经纤维网完整性的影响，可使用针对突触泡蛋白的抗体或通过电子显微技术对切片进行染色。与非转基因(nontg)小鼠相比，用CFA单独处理的转基因小鼠表现出在突触泡蛋白免疫标记末端数量上平均20％的降低，同时每个突触的突触泡蛋白免疫反应活性水平保持不变(图9B)。相反，来自两组的免疫小鼠表现出了与非转基因对照具有可比性的突触泡蛋白免疫反应活性水平(9B)。使用针对神经胶质标记的抗体，例如GFAP和CD45进行的深入免疫细胞化学分析表明了在用hα-突触核蛋白免疫的转基因小鼠大脑中存在有免疫反应活性逐渐增加的趋势(图9C)。与这些发现相一致，超微结构分析表明在用hα-突触核蛋白免疫的转基因小鼠大脑中，神经纤维网得到了良好地保存，具有完整的突触前末端和树突，以及含有丰富清澈小泡的神经末端并形成了突触后树突。仅有偶尔的电沉积集合物在神经炎过程中得以鉴定出来，而总的线粒体和髓磷脂则保存良好。
为了更好地表征免疫对突触中hα-突触核蛋白聚集的影响，进行了双重免疫细胞化学和采用突触体配方的Western印迹分析。在生理条件下，hα-突触核蛋白主要定位于突触前疖(Iwai et al.，1994，前述的)，并且在LBD和在所述转基因小鼠中，突触中hα-突触核蛋白积累的增加与功能性缺损和突触丧失相关联(Hashimoto et al.，2001，前述的)。为了确证接种对神经末端中hα-突触核蛋白积累的影响，采用针对突触前末端标记突触泡蛋白和hα-突触核蛋白的抗体进行了双重免疫标记研究，并进行了使用突触体药剂进行的WB分析。双重标记切片的共聚焦影像说明，与用CFA单独免疫的hα-突触核蛋白转基因小鼠相比(图9D)，那些用hα-突触核蛋白注射的小鼠表现出了在新皮层中在突触泡蛋白-免疫反应活性神经末端中hα-突触核蛋白积累的降低(图9D)。
与免疫细胞化学研究相一致，免疫印迹分析说明，在用CFA单独处理的转基因小鼠中，存在有丰富的较高分子量的条带，有可能反映了在突触中hα-突触核蛋白免疫反应活性包涵体的积累(图10)。在免疫小鼠中，存在有相当程度的较高分子量hα-突触核蛋白条带积累的降低，但未观察到对mα-突触核蛋白水平的影响。此外，与用CFA单独处理的转基因小鼠相比较，在来自免疫小鼠的突触体药剂中，突触泡蛋白-免疫反应活性的水平是较高的(图10)。综上，这些结果说明免疫治疗可以，通过降低突触中具有潜在毒性hα-突触核蛋白寡聚物的积累，来改善转基因小鼠大脑中的神经元损伤。
免疫的效果依赖于识别突触末端抗体的相对亲和力。
为了更好理解哪种因素能够预测免疫治疗的有效性，可以在hα-突触核蛋白积累的神经病理学标记和抗体滴度以及亲和力之间进行线性回归分析。该分析表明在免疫印迹的相对抗体亲和力与突触中hα-突触核蛋白免疫反应活性水平之间，而非与神经元包涵体的数量具有明显的相关。类似地，由ICC识别突触的相对抗体亲和力与突触中hα-突触核蛋白水平呈逆相关，而与突触泡蛋白-标记的神经末端所占据的面积百分数，而非与神经元包涵体的数量呈直接相关。由免疫印迹和ICC确定的抗体反应活性水平与由ELISA测定的抗体滴度强烈相关。抗体滴度同样与用抗-hα-突触核蛋白抗体标记的神经纤维网面积的百分数，而非与神经元中的包涵体的数量相关(表4)。综上，这些结果说明抗-人α-突触核蛋白抗体的相对免疫印迹反应活性以及在某种程度上抗体的ELISA滴度与神经元人α-突触核蛋白积累的降低相关。
可对抗人-α-突触核蛋白抗体进行内在化并结合转基因小鼠中含有突触和包涵体的神经元。
为了测定运输抗体是否能够识别在转基因小鼠大脑中人α-突触核蛋白积累的特征性神经元位点，可使用马抗鼠IgG抗体进行单重或双重免疫细胞化学分析。公认这些抗体可识别在免疫动物而非在CFA对照中产生的抗-人α-突触核蛋白。对免疫标记切片的明视野数码显微照相结果表明，在用hα-突触核蛋白免疫的小鼠中，生物素偶联的抗鼠IgG广泛地标记了神经元细胞体和神经纤维网中的神经炎过程，在用CFA单独处理的转基因动物中，存在有对血管和类似于小神经胶质细胞的偶发细胞的轻微标记。双重免疫染色实验确证了在免疫的小鼠中，由FITC标记的抗鼠IgG所标记的神经元细胞体具有hα-突触核蛋白免疫反应活性。与用CFA单独处理的转基因小鼠不同，在hα-突触核蛋白免疫的小鼠中，在一些神经元中，抗鼠IgG和hα-突触核蛋白免疫反应活性共同定位于细胞体的外围，在其他区域，这两种标记可在神经炎过程和突触中检测到。而且，在若干含有人α-突触核蛋白的神经元中，可在平均直径尺寸为0.4-0.8μm的颗粒状亚细胞结构中检测到这两种标记。其他的双标记实验说明这些颗粒状结构具有组织蛋白酶D免疫反应活性，说明内在化的抗人α-突触核蛋白抗体可与突触核蛋白在溶酶体中发生反应。与这些发现相一致，超微结构分析说明，在人α-突触核蛋白免疫小鼠的一些神经元中，电沉积片层结构暗示着可对溶酶体和吞噬溶酶体进行鉴定。综上，这些结果说明用人α-突触核蛋白进行免疫可以促进该分子通过激活溶酶体途径而得到降解。
实施例IX 通过施用α-突触核蛋白抗体在体内清除α-突触核蛋白聚集物本实施例证明了可使用识别α-突触核蛋白末端的单克隆抗-α-突触核蛋白抗体完成对神经元内α-突触核蛋白聚集物的清除。将单克隆抗体注射到过量表达人α-突触核蛋白并具有神经元内α-突触核蛋白聚集物的转基因小鼠新生皮层中。与不相关的对照相比，这两种抗体，一种是直接针对α-突触核蛋白N-末端而另一种是针对α-突触核蛋白C-末端的抗体，可将神经元内的α-突触核蛋白聚集物降低高至80％(图11)。
方法。将识别α-突触核蛋白分子和识别无关的同型匹配对照抗体不同表位的单克隆抗体溶解于无菌的磷酸缓冲盐水溶液中(表5)，从而对小鼠进行注射。所使用的动物是在PDGF启动子的转录控制下载大脑中过量表达人野生型α-突触核蛋白的4-8月龄的杂合子转基因小鼠。对每种抗体可使用4-6只不同的转基因小鼠。
表5用于在神经元突触核蛋白病的转基因模型中进行大脑内注射的α-突触核蛋白抗体和对照


对每一只小鼠而言，在麻醉的条件下，将2μl 2mg/ml的抗体溶液立体地注射至右脑半球(同侧)顶骨新生皮层的深层。对每只小鼠而言，将左半球(对侧)作为基线对照。将注射位点缝合，并对小鼠进行监测直至其从麻醉中恢复。实施注射的研究人员并不知道每次所注射的是哪种抗体。注射后两周，根据相关机构的指导处死小鼠。取出大脑，在4％多聚甲醛中固定48小时，并使用Leica振动切片机以40μm的厚度进行冠向(与正中矢状平面成直角的纵面或纵切面)切片。使用多克隆α-突触核蛋白抗体(ELAD W-47，识别α-突触核蛋白氨基酸115-122)进行免疫过氧化物酶染色对每个动物的两个切片(在注射位点附近)进行染色。对每一个切片，在同侧半球的注射位点附近的4个显微视野中(20x物镜)，并且在对侧对照半球的4个对应视野中，计数神经元内的α-突触核蛋白集合物。将每个半球的两个切片上的α-突触核蛋白集合物计数合并。最后，对每一个动物而言，计算两个半球之间总的α-突触核蛋白集合物的计数差异，并以对侧半球和同侧半球之前的％差异进行表示，从而提供了针对每个单独小鼠的α-突触核蛋白抗体对集合物清除的效果。对切片进行盲编码，且当分析完成之时编码已损坏。
根据所注射的抗体，可将小鼠分成三组组1用11A5，8A5或IgG1对照注射小鼠。
组2用9G5，23E8，6H7，或IgG1对照注射小鼠。
组3用4B 1，5C12，IgG2a或IgG2b对照注射小鼠。
结果。本研究的结果如图11和12所示。神经元内的α-突触核蛋白集合物可通过两种单克隆抗体8A5(也称为JH4.8A5)和6H7(也称为JH17.6H7)得以清除，这二种单克隆抗体在PCT专利公开第WO05047860A2号(″α-突触核蛋白的抗体″，申请日为2005年5月26日)和未决的共同专利申请第10/984192号中都有所描述，在此将其二者引作参考。MAb 6H7是从在大肠杆菌中表达的重组人α-突触核蛋白所产生的，并可以识别人和鼠α-突触核蛋白的氨基末端。MAb 6H7还能识别突触核蛋白的融合蛋白，其中所标记的蛋白融合于突触核蛋白的N-末端，说明并不需要游离的氨基末端(尽管其可以是优选的)。MAb 8A5是从纯化的牛突触核蛋白(α和β的混合物)产生的，并且可识别位于人和鼠α-突触核蛋白羧基末端的表位。MAb 8A5可与在氨基酸139终止的截短的突触核蛋白相结合。预实验表明，于轭合于生物素的C-末端相比，8A5对具有游离C-末端的突触核蛋白具有4-5倍的偏好。mAb6H7和mAb 8A5都可以识别β-突触核蛋白。MAb 4B1可以识别突触核蛋白的C-末端区域，并可在Western印迹中与突触核蛋白结合，但却不能识别溶液中的突触核蛋白(即，mAb 4B1不能免疫沉淀突触核蛋白)。图12所示为注射了8A5的小鼠的对侧(左侧实验组，切片内的棕色圆点是α-突触核蛋白集合物)和同侧(右侧实验组)切片。8A5-注射的小鼠和IgG1-注射的对照之间的差异具有统计显著性(p＜0.05，经过非参数Kruskall-Wallis检验，然后是Dunn′s post-hoc检验)。这些结果说明，在诸如PD和DLB的突触核蛋白病中，靶定α-突触核蛋白的C-末端和/或N-末端是治疗有益的。其他检测的抗-α-突触核蛋白抗体(表5，图11)施用并未导致集合物的清除。
本领域所属技术人员应该理解，可在不偏离所附权利要求的精神或范围的前提下对本发明进行诸多改变和修饰。除非在文中另有说明，可将任意步骤，特征，实施方式，或方面与任意的其他内容组合使用。在本说明书中提到的所有出版物和专利申请都在此被全文引用作为相同程度的参考，就像每个单独的出版物或专利申请都被特意地和单独地被指明引作参考那样。
序列表<110>艾兰制药公司加利福尼亚大学董事会<120>突触核蛋白病以及淀粉样变性病的预防和治疗<130>SCT070369-66<140>WO 00/000,000<141>2005-08-09<150>US 11/185,907<151>2005-07-19<150>US 10/915,214<151>2004-08-09<150>US 10/699,517<151>2003-10-31<150>US 10/698,099<151>2003-10-31<150>US 60/423,012<151>2002-11-01<160>57<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>140
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<221>MISC_FEATURE<222>(14)..(16)<223>X＝NAC peptide<400>25
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Xaa Xaa Xaa1 5 10 15<210>26<211>15<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X＝NAC peptide<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)<223>X＝NAC_peptide<400>26Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Xaa1 5 10 15<210>27<211>16<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(3)<223>X＝NAC Peptide<400>27Xaa Xaa Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10 15<210>28<211>15<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(2)<223>X＝NAC Peptide<400>28Xaa Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10 15<210>29<211>106<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(106)<223>X＝NAC peptide<400>29Xaa Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Glu Lys1 5 10 15Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val Gln Tyr20 25 30Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn35 40 45Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His50 55 60Leu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile65 70 75 80Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg85 90 95Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu100 105<210>30<211>77<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(77)<223>X＝NAC peptide<400>30Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val20 25 30Ser Ala Ser His Leu Glu Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe35 40 45Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp50 55 60Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Xaa65 70 75<210>31<211>16<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_EEATURE<222>(1)..(1)<223>X＝NAC peptide
<400>31Xaa Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>32<211>26<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>32Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Ile Ser Gln Ala Val His Ala1 5 10 15Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20 25<210>33<211>43<212>PRT<213>Homo sapiens<400>33Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr35 40
<210>34<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Conjugate<400>34Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>35<211>28<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Conjugate<400>35Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp1 5 10 15Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu20 25<210>36<211>43<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Conjugate<400>36Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu20 25 30Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu35 40<210>37<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Conjugate<400>37Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>38<211>20<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Conjugate<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X＝cycloheylalanine，tyrosine，or phenylalanine<400>38Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp20<210>39<211>34<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Conjugate<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(24)..(24)<223>X＝cycloheylalanine，tyrosine，or phenylalanine<400>39Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala20 25 30Ala Ala
<210>40<211>34<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X＝cycloheylalanine，tyrosine，or phenylalanine<400>40Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg20 25 30His Asp<210>41<211>20<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>X＝cycloheylalanine，tyrosine，or phenylalanine<400>41Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu1 5 10 15Lys Ala Ala Ala20<210>42<211>24<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>42Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>43<211>24<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>43
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>44<211>24<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>44Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His1 5 10 15Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg20<210>45<211>34<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>45Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg20 25 30
His Asp<210>46<211>27<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>46Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp20 25<210>47<211>34<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>47Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu20 25 30Ala Thr
<210>48<211>27<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>48Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys1 5 10 15Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr20 25<210>49<211>79<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>49Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser20 25 30Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile35 40 45Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro50 55 60Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
65 70 75<210>50<211>56<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>50Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala1 5 10 15Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly20 25 30Ile Thr Glu Leu Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro35 40 45Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu50 55<210>51<211>44<212>PRT<213>Artificial Sequellce<220>
<223>Fusion protein<400>51Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
20 25 30Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu35 40<210>52<211>51<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>52Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp20 25 30Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe35 40 45Arg His Asp50<210>53<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Fusion protein<400>53Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe1 5 10 15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu20<210>54<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>54Lys Glu Gln Val Thr Asn Val Cys Gly Gly Ala Val Val Thr1 5 10<210>55<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>55Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Cys Gly1 5 10<210>56<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X＝amino-heptanoic acid
<400>56Xaa Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Cys Gln Glu Gly1 5 10<210>57<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>ACETYLATIONX＝Aecylated proline<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>X＝Aecylated proline<400>57Xaa Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Cys Ala1 5 10
权利要求
1.影响预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或者α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或者处于患该疾病危相中的病人施用有效量的抗体，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
2.权利要求2的方法，其中的抗体特异性结合人α突触核蛋白的1-10残基内的表位。
3.权利要求1或2的方法，其中抗体是单克隆抗体。
4.权利要求3的方法，其中的抗体是嵌合抗体。
5.权利要求3的方法，其中的抗体是人抗体。
6.权利要求3的方法，其中的抗体是人源化抗体。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中的抗体与小鼠单克隆抗体6H7竞争结合人α-突触核蛋白。
8.权利要求7的方法，其中的抗体是小鼠单克隆抗体6H7的人源化形式。
9.影响预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或者α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或者处于患该疾病的危相中的病人施用有效量的抗体，所述抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
10.权利要求9的方法，其中抗体特异性结合人α突触核蛋白的120-140残基内的表位。
11.权利要求9或10的方法，其中的抗体是单克隆抗体。
12.权利要求11的方法，其中的抗体是嵌合抗体。
13.权利要求11的方法，其中的抗体是人抗体。
14.权利要求11的方法，其中的抗体是人源化抗体。
15.权利要求9-14任一项的方法，其中的抗体与小鼠单克隆抗体8A5竞争结合人α-突触核蛋白。
16.权利要求10的方法，其中的抗体是小鼠单克隆抗体8A5的人源化形式。
17.前述权利要求任一项的方法，其中的抗体是人IgG1同种型的抗体。
18.前述权利要求任一项的方法，其中的抗体与药用载体一起作为药物组合物施用。
19.前述权利要求任一项的方法，其中的抗体以0.0001到100mg/kg，优选至少1mg/kg体重抗体的剂量施用。
20.前述权利要求任一项的方法，其中的抗体在至少6个月的时间内多剂量施用。
21.前述权利要求任一项的方法，其中的抗体经腹膜内，口服，皮下，头盖骨内，肌内，局部，鼻内或者静脉内施用。
22.影响预防或者治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或者α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或者处于患该疾病危相中的病人施用有效量的第一抗体以及施用第二抗体，所述第一抗体特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位，所述第二抗体特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
23.权利要求22的方法，其中第二抗体特异性结合人α-突触核蛋白的120-140残基内的表位。
24.前述权利要求任一项的方法，其中的疾病是帕金森氏症。
25.药物组合物，包括特异性结合α-突触核蛋白的1-40残基内的表位的嵌合或人源化抗体以及药用载体。
26.权利要求25的药物组合物，其中的抗体特异性结合α-突触核蛋白的1-20残基内的表位。
27.权利要求26的药物组合物，其中的抗体特异性结合α-突触核蛋白的1-10残基内的表位。
28.药物组合物，包括特异性结合α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的嵌合或人源化抗体以及药用载体。
29.权利要求28的药物组合物，其中的抗体特异性结合α-突触核蛋白的120-120残基内的表位以及药用载体。
30.由杂交瘤JH17.6H7.1.54.28(ATCC登录号PTA-6910)或JH4.8A5.25.7.36(ATCC登录号PTA-6909)产生的单克隆抗体。
31.杂交瘤JH17.6H7.1.54.28(ATCC登录号PTA-6910)或JH4.8A5.25.7.36(ATCC登录号PTA-6909)的细胞。
32.影响预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或处于患该疾病的危相中的病人施用多肽，所述多肽包括有效诱导免疫原性应答的α-突触核蛋白的免疫原性片段，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的，由此影响疾病的预防或治疗。
33.权利要求32的方法，其中的免疫原性片段包括SN130-136并且包含不超过α突触核蛋白的总共40个的连续残基，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
34.权利要求33的方法，其中的免疫原性片段选自SN124-140，SN125-140，SN126-140，SN127-140，SN128-140，SN129-140，SN130-140，SN131-140，SN132-140，SN133-140，SN134-140，SN135-140，SN136-140，SN137-140，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN124-139，SN125-139，SN126-139，SN127-139，SN128-139，SN129-139，SN130-139，SN131-139，SN132-139，SN133-139，SN134-139，SN135-139，SN136-139，SN137-139，SN124-138，SN124-138，SN125-138，SN126-138，SN127-138，SN128-138，SN129-138，SN130-138，SN131-138，SN132-138，SN133-138，SN134-138，SN135-138，SN136-138，S SN124-137，SN125-137，SN126-137，SN127-137，SN128-137，SN129-137，SN130-137，SN131-137，SN132-137，SN133-137，SN134-137，SN135-137，SN124-136，SN125-136，SN126-136，SN127-136，SN128-136，SN129-136，SN130-136，SN131-136，SN132-136，SN133-136和SN134-136，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
35.影响预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或处于患该疾病的危相中的病人施用多肽，所述多肽包括有效诱导免疫原性应答的α-突触核蛋白的免疫原性片段，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-40残基内的表位的抗体，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的，由此影响疾病的预防或治疗。
36.权利要求35的方法，其中的免疫原性片段包括SN1-5并且包含不超过α突触核蛋白的总共40个的连续残基，所述残基是根据SEQID NO1编号的。
37.权利要求35的方法，其中的免疫原性片段选自SN1-5，SN1-6，SN1-7，SN1-8，SN1-9，SN1-10，SN1-11，SN1-12，SN1-13和SN1-14，SN1-15，SN1-16，SN1-17，SN1-18，SN1-19和SN1-20。
38.影响预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或处于患该疾病的危相中的病人施用多肽，所述多肽包括有效诱导免疫原性应答的α-突触核蛋白的免疫原性片段，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的，其中α-突触核蛋白的免疫原性片段无α突触核蛋白的至少25-69残基，70-140残基，41-140残基或25-140残基，由此影响疾病的预防或治疗。
39.权利要求32-38任一项的方法，其中的免疫原性片段与载体连接形成结合物。
40.影响预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或处于患该疾病的危相中的病人施用有效诱导免疫原性应答的多肽或多肽的组合，所述免疫原性应答包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体以及特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体，其中所述多肽或多肽的组合不诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的25-69残基内的表位的抗体的免疫原性应答。
41.影响预防或治疗特征在于在脑中聚集Lewy体或α-突触核蛋白的疾病的方法，该方法包括给患有或处于患该疾病的危相中的病人施用包括α-突触核蛋白的第一免疫原性片段的多肽，以及施用包括α-突触核蛋白的第二免疫原性片段的多肽，所述第一片段有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体的免疫原性应答，所述第二片段有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答。
42.筛选药剂来测定该药剂是否具有用于治疗特征在于Lewy体的疾病的活性的方法，包括将药剂与倾向于发展特征在于Lewy体疾病的转基因非人动物接触；测定该药剂是否影响与对照转基因非人动物相比特征发展的程度或速度；其中该药剂是(i)诱导特异性结合人α突触核蛋白的70-140残基内的至少一个表位的抗体的α突触核蛋白的片段；(ii)诱导特异性结合人α突触核蛋白的1-20残基内的至少一个表位的抗体的α突触核蛋白的片段；(iii)特异性结合人α突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体；或(iv)特异性结合人α突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体，所述残基是根据SEQ ID NO1编号的。
43.前述权利要求任一项的方法，其中的疾病是帕金森氏症。
44.药物组合物，包括α-突触核蛋白的第一免疫原性片段以及药用载体，所述第一片段有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的1-20残基内的表位的抗体的免疫原性应答。
45.权利要求44的药物组合物，进一步包括α-突触核蛋白的第二免疫原性片段，所述第二片段有效诱导包括特异性结合人α-突触核蛋白的70-140残基内的表位的抗体的免疫原性应答，其中第二免疫原性片段不同于第一免疫原性片段。
46.使单克隆抗体8A5或单克隆抗体6H7人源化的方法，包括测定单克隆抗体的CDR区域的氨基酸序列；选择受体抗体；以及产生包括来自单克隆抗体的CDRs以及来自受体抗体的可变区骨架的人源化抗体。
47.产生单克隆抗体8A5或单克隆抗体6H7的嵌合形式的方法，包括测定单克隆抗体的轻链以及重链可变区的氨基酸序列；选择重链以及轻链恒定区；产生包括含有与轻链恒定区融合的轻链可变区的轻链以及包括与重链恒定区融合的重链可变区的重链的嵌合抗体。
全文摘要
本发明提供了用于治疗与突触核蛋白病相关的疾病的改良的药剂和方法，所述疾病特征在于在病人脑中包含α－突触核蛋白的Lewy体。这样的方法需要施用诱导针对Lewy体的有益免疫原性应答的药剂。该方法尤其适用于预防和治疗帕金森氏症。
文档编号C12P21/08GK101052417SQ200580027022
公开日2007年10月10日 申请日期2005年8月9日 优先权日2004年8月9日
发明者戴尔·B·申克, 埃利泽·马斯利亚, 曼纽尔·J·布蒂尼, 塔梅·J·奇莱科特, 爱德华·罗肯施泰因, 卡特·多拉·盖姆斯 申请人:艾兰制药公司, 加利福尼亚大学董事会