一个棉纤维优势表达的基因GhFP2及其应用的制作方法

本发明涉及棉花基因鉴定及应用领域，具体涉及一个棉纤维优势表达的基因ghfp2及其应用。

背景技术：
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棉花是世界上最重要的天然纤维作物，与我们的衣食住行息息相关。我国是世界上最大的产棉国和棉花消费国，棉花生产在我国国民经济中占有十分重要的地位。棉纤维是棉花生产的主要产品，其产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益。因此，提高棉纤维的产量和品质一直都是棉花育种的主要目标。然而，由于棉花纤维的产量和品质之间存在负相关关系，严重阻碍了棉花纤维产量和品质的同步改良。传统育种方法难以打破产量和品质的负相关，必须寻找新的途径以达到两者同步改良。

棉花纤维细胞是由胚珠外表皮分化而成的不分枝单细胞毛状突起，其发育由四个重叠但可区分的发育阶段组成，分别是纤维细胞起始、伸长、次生壁合成及脱水成熟。棉花纤维在这四个阶段中的发育情况决定了其产量和品质，纤维细胞的起始决定了最终纤维的数量，纤维细胞的伸长决定了成熟纤维的长度，次生细胞壁合成决定了纤维的强度。因此，克隆棉花纤维发育相关基因，研究基因之间的关系，解析棉花纤维发育的分子机制，不仅具有重要的理论意义，而且对棉花纤维产量和品质改良具有重要的应用价值。

棉花纤维发育过程受到激素水平的调控。油菜素内酯、生长素、赤霉素等激素都在纤维细胞起始和发育过程中起到至关重要的作用。研究证明，外源施加一定浓度的上述激素能够促进棉纤维细胞发育。虽然目前已经在棉花中分离鉴定了一些与激素信号相关的基因，但是这些基因在棉花激素信号传递过程中的功能及其对棉花纤维发育影响的作用机制尚不清楚，一些关键的调控因子也有待克隆鉴定并阐明其功能。因此，研究棉花中激素信号的传递途径，特别是对棉花纤维发育的影响，分离鉴定相关重要调控因子，对于棉花纤维品质改良，具有重要意义。

油菜素内酯(br)作为一种重要的植物激素，在植物的生长发育中发挥着重要的作用。br信号在植物体内的转导是一个复杂的过程。在拟南芥中，br信号由细胞膜受体蛋白bri1接受(sheetal.,2011；hothornetal.,2011)。当缺乏br时，负调控因子bki1结合bri1，抑制其功能(wangetal.,2006；jaillaisetal.,2011)；bin2激酶磷酸化植物特异性的转录因子bes1和bzr1,抑制其dna结合活性(yinetal.,2005；heetal.,2005)。14-3-3蛋白与磷酸化的bes1/bzr1相互作用，使其滞留在细胞质中。当有br信号时，br分子结合bri1的胞外域，促进bri1与bak1相互作用，激活受体激酶活性，bri1激酶促进bki1磷酸化，同时bri1与bki1分离。14-3-3蛋白可以通过两个磷酸化位点的基序与磷酸化的bki1相互作用。细胞质中bki1与14-3-3结合，激活的bri1和bak1间接导致bin2活性的抑制或bsu1的激活或者两种情况同时存在(kimetal.,2011；kimetal.,2009；tangetal.,2008；lietal.,2002)。同时，pp2a使得bes1/bzr1去磷酸化，促使bes1/bzr1在核中大量积累，bzr1结合br合成基因的启动子,抑制br合成基因的表达，从而降低br的水平。非磷酸化状态的bes1也在核中积累,在核中激活br诱导基因的表达(tangetal.,2011)。我们之前的研究表明棉花bzr1蛋白不仅能够结合br合成基因的启动子，反馈抑制br合成基因的表达，还能结合br信号下游的bhlh/hlh转录因子的启动子，抑制这些转录因子的功能，从而维持植物体内br的稳态以及促进棉纤维的发育。随着在模式植物拟南芥中越来越多的bhlh/hlh家族蛋白的功能被揭示，研究者发现在生长素、赤霉素和br这些能够促进细胞伸长的激素信号通路中都有bhlh/hlh家族蛋白的存在，并且这些蛋白之间也存在着一些直接或间接的联系。

2012年，ikeda等人确定atibh1作为一个负调控因子通过br信号来调控细胞伸长，并筛选到了一些能与atibh1蛋白相互作用的bhlh蛋白，包括pre1、pre3、pre4、pre5、cib1、cbi5、atibh1自身以及ace1、ace2、ace3。ace蛋白在拟南芥中进行显性抑制后会抑制细胞伸长，而过量表达则促进细胞的伸长。进一步的实验表明ace1是一个转录激活子，通过识别下游基因启动子上的g-box(cacgtg)顺式元件而激活下游基因表达，促进细胞伸长。exp8基因启动子活性分析显示，ibh1与ace1的相互作用会抑制ace1与g-box结合，同时也会抑制ace1对靶基因的调控。有趣的是，当在原生质体中同时表达ace1、ibh1和pre时，exp8启动子的活性会重新得到提高，这表明这3个bhlh/hlh蛋白间的相互作用对于其功能是非常重要的(ikedaetal.,2012)。同年bai等人发现了另外一个与atibh1相互作用的bhlh蛋白，命名为athbi1。athbi1与ace1类似，其作为一个转录激活子来调控下游靶基因的表达，促进细胞伸长，该基因功能受到atibh1的抑制，这种抑制同样能通过atpre1与atibh1的相互作用来解除(baietal.,2012)。对athbi1的进一步研究结果显示，athbi1不仅影响植物的生长，还参与植物病害的防御应答(fanetal.,2014)。研究发现hbi1在br信号通路与pti(pamp-triggeredimmunity)通路中有着相反的调控作用，在应答不同的pamp(pathogen-associatedmolecularpattern)时，hbi1表达下调；br处理时，hbi1表达上调，在这个拮抗调控中，研究者还发现并鉴定了可能与hbi1存在功能冗余的两个基因bee2和cib1(malinovskyetal.,2014)。利用基因芯片技术筛选受到br抑制的基因，鉴定了一个与atibh1同源的bhlh蛋白atibl1。ibl1与ibh1功能类似，它们都能抑制细胞伸长。研究还发现ibh1可以直接抑制ibl1表达，同时ibh1与ibl1却又能共同抑制一些其他基因的表达，这些被抑制的基因中包含28个bhlh/hlh家族转录因子基因(zhiponovaetal.,2014)。此外，有研究表明在拟南芥中3个bee蛋白参与br信号通路，作为细胞伸长的正调控因子来发挥功能(danielleetal,.2002)。

综上所述，在植物中bhlh/hlh蛋白参与多种激素(生长素、赤霉素、油菜素内酯、脱落酸)信号通路，形成一个复杂的机制来共同调控细胞伸长，这表明植物bhlh/hlh蛋白在调控细胞伸长方面具有重要功能。同样地，也有研究报道bhlh/hlh转录因子参与棉纤维发育的调控。例如，ghfp1是一个典型的bhlh/hlh转录因子，能够通过促进br生物合成基因的表达来促进棉花的伸长发育(liuetal.,2019)。ghbhlh18过表达能够抑制棉纤维的伸长(gaoetal.,2019)。我们从棉花全基因组水平在棉纤维中分离鉴定了多个响应br信号通路的bhlh/hlh转录因子，表明bhlh/hlh在棉纤维发育过程中发挥着重要的作用(luetal.,2018)。因此，研究探讨棉纤维优势表达的fp2转录因子在纤维品质性状形成中的调控作用，将能够使我们更好地了解棉花bhlh/hlh转录因子如何参与棉纤维内源br激素的调控，以及该基因在棉纤维发育和品质性状形成过程中的功能，进而应用于棉纤维品质的遗传改良。

技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一个新的棉纤维优势表达的fp2基因(ghfp2)全序列及其cdna序列和编码蛋白序列，分析揭示该基因的生物学功能，探索其对纤维发育调控的分子机制，进而应用该基因改良棉纤维，创造棉花优良品种。

我们从棉花纤维中分离鉴定了59个能够响应br应答的bhlh/hlh转录因子，其中有一个基因是ghfp2。通过dna和蛋白质序列分析，利用棉花纤维细胞的转录本(总rna)，分离获得ghfp2全长cdna序列，如seqidno.2所示，基因编码区(orf)从1-600bp，起始密码子atg到终止密码子tag。按照ghfp2cdna序列设计引物，以棉花基因组dna为模板，采用pcr技术扩增获得该基因的dna全长序列，如seqidno.1所示，包含5’启动子区(1-2000bp)、外显子区、3’未翻译区(3’utr,2601-2800bp)，不含有内含子区。该基因编码199个氨基酸，编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.3所示。其在棉纤维伸长发育时期优势表达，而在棉花其他组织中表达相对较低(图1)，进一步的亚细胞定位结果表明ghfp2蛋白定位于细胞核中(图2)，在酵母系统中我们检测了ghfp2的转录激活能力，将构建好的pgbkt7-ghfp2分别转化到酵母菌株ah109和y187中，将在sd/-trp平板上生长的ah109阳性转化子分别划线于sd/-trp/-his平板和sd/-trp/-ade平板，阳性转化子均不能生长，说明ghfp2无转录激活活性。同时，将在sd/-trp平板上生长的y187阳性转化子进行显色反应，检测lacz报告基因是否被激活表达，8小时后菌落未显蓝色，进一步证实ghfp2无转录激活活性(图3)。

为了研究ghfp2的功能，分别构建了ghfp2过量表达(oe)和rnai抑制表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化技术，转化棉花下胚轴外植体，获得转基因棉花植株。提取ghfp2oe和rnai转基因棉花开花10天后的纤维rna，检测在转基因棉花中ghfp2基因表达水平。结果表明，ghfp2过量表达转基因株系(l8、l13、l47和l50)的纤维中ghfp2都不同程度地上调表达，而ghfp2rnai抑制表达株系(l17、l41、l43和l118)纤维中ghfp2表达量降低(图4a)。我们测量分析了成熟棉纤维长度，结果表明，与野生型相比较，ghfp2过量表达转基因棉花纤维长度明显变短，而ghfp2rnai棉花纤维长度显著增加(图4b-c)，但转基因棉花种子大小未发生改变(图4d)。而且，推测该基因可能通过参与br信号通路而调控棉纤维细胞伸长过程，从而影响棉纤维产量和品质。

为了进一步研究ghfp2在棉纤维细胞起始和发育过程中的功能，我们在扫描电镜下观察了ghfp2转基因棉花开花后1天(1dpa)，2天(2dpa)和3天(3dpa)的胚珠表面突起的纤维细胞形态，结果表明转基因株系和野生型纤维细胞起始情况无明显差异，但是开花后2天，过量表达株系的纤维细胞伸长明显受到抑制，而rnai株系的纤维细胞显著长于野生型(图5)。这说明ghfp2不影响棉纤维细胞起始，而是调控棉纤维伸长发育，从而影响棉纤维产量和品质。

本发明的优点：

1.提供了一个新的棉纤维发育相关的ghfp2基因序列及cdna序列和编码蛋白序列。该基因在棉纤维中优势表达，表明该基因可能在调控棉纤维发育过程中起重要作用。

2.与野生型相比，ghfp2过量表达转基因棉花成熟纤维长度显著变短，而rnai株系的纤维细胞显著增长，表明该基因在棉纤维发育过程中发挥负调控功能。

3.ghfp2蛋白定位于细胞核中，无转录激活活性，表明它可能作为一个转录抑制子而负调控下游基因表达，从而影响棉纤维细胞发育和纤维品质。

本发明通过以下附图和实施作进一步阐述，但不限制本发明的范围。

附图说明

图1.rt-pcr分析ghfp2在棉花组织中的表达。其中：a，半定量rt-pcr分析ghfp2在各组织中的表达。结果表明，ghfp2基因在棉纤维中优势大量表达，而在其他组织中表达量较低。b，荧光定量rt-pcr分析ghfp2在棉纤维不同发开花后育时期的表达。1：开花前1天的胚珠；2：开花当天的胚珠；3：开花后1天的胚珠；4：3天的胚珠；5：开花后6天纤维；6：开花后9天纤维；7：开花后12天纤维；8：开花后15天纤维；9：开花后18天纤维；10：开花后21天纤维；11：开花后24天纤维；12：开花后27天纤维。

图2.ghfp2蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。其中:a，显微镜明视野下的烟草表皮细胞；b，烟草表皮细胞中ghfp2-gfp信号；c，dapi染色观察鉴定细胞核；d，图片a、b和c的重合照片。

图3.ghfp2转录激活活性分析。其中：a，pgbkt7-ghfp2转化酵母ah109在sd/-trp/-ade培养基上生长情况；b，pgbkt7-ghfp2转化酵母ah109在sd/-trp/-his培养基上生长情况；c，pgbkt7-ghfp2转化酵母y187后lacz报告基因的表达。结果表明ghfp2转化酵母不能在选择培养基上生长，也没有蓝色反应，表明该蛋白不具有转录激活活性。+，正对照；–，负对照。

图4.ghfp2转基因棉花成熟纤维表型分析，其中：a，荧光定量rt-pcr分析ghfp2在野生型(wt)和转基因株系(oe和rnai)中的表达水平。b，转基因棉花和野生型棉花成熟纤维长度测量及统计分析。c，转基因棉花和野生型棉花成熟纤维长度比较。结果表明，与野生型相比，ghfp2过量表达转基因棉纤维变短，而rnai棉纤维长度显著增加。d，转基因棉花和野生型棉花种子大小和形态比较。结果表明转基因棉花与野生型种子大小没有显著差异。wt，野生型；oe，ghfp2过量表达株系；ri，ghfp2rnai株系。

图5.ghfp2转基因棉花纤维细胞起始时期表型分析

在扫描电镜下分别观察野生型(wt)与转基因株系(oe和rnai)胚珠表面纤维细胞形态。左图：野生型；中图：ghfp2过量表达(oe)株系；右图：ghfp2rnai株系。从上到下分别是开花1天棉花胚珠表面纤维细胞形态，开花2天的棉花胚珠表面纤维细胞形态，开花3天棉花胚珠表面的纤维细胞形态。观察结果表明，与野生型相比较，oe株系纤维细胞起始生长迟缓，而rnai株系纤维细胞起始生长增快。

具体实施方式：

一个棉花bhlh/hlh家族新基因ghfp2全长序列的克隆鉴定和功能分析：

1.ghfp2基因序列及cdna的分离鉴定

在棉花全基因组范围内筛查鉴定了59个能够响应br应答的bhlh/hlh转录因子基因，其中一个是ghfp2。通过dna和蛋白质序列分析，利用棉花纤维细胞的转录本(总rna)，分离获得ghfp2全长cdna序列，如seqidno.2所示。按照ghfp2cdna序列设计引物，以棉花基因组dna为模板，采用pcr技术扩增获得该基因的dna全长序列，如seqidno.1所示。

2.rt-pcr分析ghfp2基因的表达

(1)棉花组织的总rna提取(按lur,zhangj,liud,weiyl,wangy,lixb，2018.characterizationofbhlh/hlhgenesthatareinvolvedinbrassinosteroid(br)signalinginfiberdevelopmentofcotton(gossypiumhirsutum).bmcplantbiol.18:304进行)。

(2)半定量pcr研究基因的表达(按lur,zhangj,liud,weiyl,wangy,lixb，2018.characterizationofbhlh/hlhgenesthatareinvolvedinbrassinosteroid(br)signalinginfiberdevelopmentofcotton(gossypiumhirsutum).bmcplantbiol.18:304进行)。结果如图1a所示。

(3)实时荧光定量rt-pcr研究基因的表达(按照lixb,fanxp,wangxl,cail,yangwc,2005.thecottonactin1geneisfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation.plantcell17:859–875进行)。首先，将棉花不同组织(根、下胚轴、子叶、真叶、花瓣、花药、开花前1天胚珠、开花当天胚珠、开花后1天胚珠、开花后3天胚珠和纤维、开花后6、9、12、15、18和20天纤维等)的总rna(2μg/样)用m-mlvrnaseh^-reversetranscriptase(promega)反转录成cdna；然后，以cdna为模板，用基因特异的引物(ghfp2rtp1：gctgttgagcggaagttgaagg和ghfp2rtp2：gacattagagggaaggcgatc)和real-timepcrmastermix(toyobo,japan)进行定量pcr反应。棉花ghubi1基因(genbank序列号：eu604080)作为rt-pcr反应的内标，目标基因每一个循环的扩增都被sybr-green荧光检测。每个基因的表达水平相对值按公式y＝10^δct/3.57×100％计算(其中δct＝ctghubi1–ctghfp2，3.57是利用ghubi1制备的标准曲线y＝–0.28x+9.87中斜率的倒数，表示基因表达相差10倍的pcr循环数)。重复3次，统计分析实验结果。结果如图1b所示。结果表明，ghfp2基因在棉纤维中优势大量表达，而在其他组织中表达量较低。

3.ghfp2蛋白的亚细胞定位分析

构建p2300-ghfp2:egfp植物表达载体，将该载体通过电转化法转入农杆菌感受态菌株gv3101中，再通过注射法转化烟草表皮细胞。将转化的烟草叶片培养64小时后，置于共聚焦显微镜下观察叶表皮细胞的gfp荧光信号。结果表明，荧光信号主要分布在烟草表皮细胞的细胞核中。

4.在酵母体内检测ghfp2蛋白的转录激活活性

构建pgbkt7-ghfp2载体，分别转化在酵母感受态菌株y187和ah109细胞，并涂布在sd/-trp平板上。将检测得到的ah109阳性转化子分别划线于sd/-trp/-his平板和sd/-trp/-ade平板，如果能够在sd/-trp/-his平板和sd/-trp/-ade平板上正常生长，说明ghfp2具有转录激活活性，否则表明其无转录激活活性。同时，将在sd/-trp平板上生长的y187阳性转化子进行显色反应，检测lacz报告基因是否被激活表达，具体的操作步骤如下：在培养皿中用5mlzbuffer/x-gal溶液浸湿透一张无菌滤纸，挑取新鲜培养的酵母单菌落至另一张无菌滤纸上，于液氮中冷冻15秒后，置于室温融化。小心将带酵母的滤纸放到浸湿的滤纸上，置于30℃培养箱中，8小时内菌落出现蓝色的为阳性，表明该蛋白具有转录激活活性，而不显蓝色则表明该蛋白不具有转录激活活性。

结果分别如图3a,b,c所示。结果表明：ghfp2转化酵母不能在选择培养基上生长，也没有蓝色反应，表明该蛋白不具有转录激活活性。+，正对照；–，负对照。

5.ghfp2转基因棉花纤维细胞起始发育观察和成熟纤维表型分析构建rdl1启动子驱动的pbi-ghfp2过量表达(oe)和pbi-ghfp2抑制表达(rnai)载体，转化农杆菌lba4404。利用农杆菌浸染棉花下胚轴外植体，共培养2天后，将下胚轴转移到选择培养基上培养，诱导并筛选到转化愈伤组织。将该愈伤组织经过6–8个月的继代培养后，诱导分化出胚性愈伤组织和体细胞胚，体细胞胚进而萌发再生为转基因棉花幼苗。将棉花幼苗移栽至土中，生长发育至开花结实。提取棉花基因组dna，利用pcr技术检测鉴定转基因棉花植株。提取开花10天后的棉花纤维细胞rna，利用定量rt-pcr技术分析转基因棉花中ghfp2基因表达水平。然后，选择不同表达水平的转基因棉花株系进行表型分析。用扫描电镜观察开花1–3天后的棉花胚珠表面纤维细胞的突起和伸长生长情况。测量野生型和转基因株系的成熟棉纤维长度，并进行统计分析。见图4和图5，图4结果表明，与野生型相比，ghfp2过量表达转基因棉纤维变短，而rnai棉纤维长度显著增加；图5的观察结果表明，与野生型相比较，oe株系纤维细胞起始生长迟缓，而rnai株系纤维细胞起始生长增快。

序列表

＜110＞华中师范大学

＜120＞一个棉纤维优势表达的基因ghfp2及其应用

＜160＞3

＜210＞1

＜211＞2800bp

＜212＞dna

＜213＞棉花(gossypiumhirsutum)

＜400＞1

ttagagggaaggtaaagaaaaatgttgagacatagtcttaaaatcacaagcaaataattg60

ggtagatggaggtattcctatttacattgcattttcaatcccatgataatttaatttatt120

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＜210＞2

＜211＞800bp

＜212＞dna

＜213＞棉花(gossypiumhirsutum)

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＜213＞棉花(gossypiumhirsutum)

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