一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法与流程

本发明涉及质谱
技术领域：
，特别是一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法。
背景技术：
：基质辅助激光解析离子化质谱(maldi-ms)是一种软电离质谱技术，适合于生物大分子及混合物样本的分析。与其他分析方法相比，maldi-ms具有高灵敏度、高通量的优势，但分析结果受系统误差和测试条件波动的影响较大。为了提高分析结果的准确度，一般需要通过标准品对仪器进行分子量校正。校正方法分为外标法和内标法，外标法是指首先使用分子量校正标准品进行仪器校正，再用经过校正的仪器测试样本；内标法是指将分子量校正标准品添加到待测的样本中，在同一次测试中同时完成对仪器的校正和对样本的分析。外标法是maldi-ms仪器进行分子量校正的主要方法，操作简单，但校正精度低，偏移大。与外标法相比，内标法校正精度高，但需要在每个样本中添加标准品，操作繁琐复杂，成本高，无法实现高通量。此外，在样本中添加外源性多肽，还可能发生离子抑制效应，干扰样本本身的特征峰。目前maldi-ms仪器在微生物鉴定上的应用已较为成熟，微生物鉴定用的分子量标准品通常采用菌落或其提取物。专利cn201510246677从大肠杆菌蛋白提取物中鉴定出18条特征峰作为标准物，改善了校正结果的稳定性，但其采用的校正方法仍然属于外标法，校正精度较低。专利cn201611062751、cn201810345905、cn201810345986、cn201810346086公开了适用于微生物鉴定的内标分子量校正方法，选择小于3000da或大于12000da的多肽及其组合作为内标物，避开微生物的分子量区间(3000-13000da)，以避免对图谱的干扰。但该标准品的制备需要购买多肽纯品，成本较高，且需要在每个样本中添加内标物的繁琐操作步骤。与微生物样本相比，生物样本如血清中的多肽或蛋白分子量范围更大(700-20000da)，在设计内标物时，则更难以避开对血清多肽指纹图谱的影响。专利cn201010271826公开了一种血清多肽内标校正检测方法，使用插空法设计内标，使内标多肽的分子量位于血清多肽指纹图谱的无干扰区域。然而该方法设计内标不仅难度较大，而且使得内标分子量范围难以覆盖样本的分子量分布，影响校正精度。专利cn201711053836在改善样本结晶条件的基础上，进一步提供一种样本质谱检测的校正方法，使用生物样本经过磁珠提取的多肽靶分子作为标准品进行分子量校正，以提高maldi-ms检测蛋白样本的准确率。然而该方法在操作上仍然属于外标校正，且没有公开从生物样本中提取的多肽标准品的特征峰，仍然存在不同实验室检测结果的平行性对比问题。目前市面上的商品化多肽标准品购买成本较高，且分子量范围在2000-20000da左右，无法兼顾1000da以下和10000da以上大分子的分子量校正优化，仅适用于微生物鉴定，不适用于分子量分布范围较宽的生物样本肽谱或蛋白谱检测。多肽分子量校正的外标法与内标法都各有弊端。缺少一种能够结合外标法与内标法优势的分子量校正方法，以及适用于多种生物样本肽谱或蛋白谱检测、易于制备的标准品，本发明解决这样的问题。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法，试剂盒适用于maldi离子源质谱仪，并适用于微生物鉴定、多种体液多肽谱活检等应用场合；校正方法能够结合外标法与内标法优势，实现高精度的分子量校正，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。前述一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：3份多肽或蛋白干粉对应10份基质。一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤一，多肽或蛋白干粉标准品的制备：1)将多例样本等体积混合，制备大量标准样本；2)使用微米/纳米结构材料或固相萃取柱处理标准样本获得含有多肽、蛋白质的溶液；3)将含有多肽、蛋白质的溶液冷冻真空干燥，得到多肽或蛋白干粉标准品；步骤二，多肽或蛋白干粉标准品中多肽分子量的测定：1)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品做为内标，制备成含内标的肽标准品溶液；2)将含内标的肽标准品溶液与基质溶液混合后点靶，干燥；3)将靶板放入质谱仪中进行检测，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量；4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰在质谱仪控制软件内建立分子量外标校正列表和分子量内标校正列表；步骤三，按照如下配方配置试剂盒；配方包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量，得到的商业化标准品质谱峰包括1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此确定样本的多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z包括：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，分子量外标校正列表包括：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273。前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，分子量内标校正列表为：740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273。一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，包括：对待测的样本进行外标、内标两步法校正；具体包括如下步骤：步骤一，对待测的样本的多肽或蛋白谱的外标法校正：1)获取多个待测的样本中的多肽、蛋白质；2)用干粉溶解液溶解一份多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液；3)用基质溶解液溶解基质得到基质溶液，分别加入待测样本溶液和肽标准品溶液中，点样到同一块靶板上、干燥；4)上机测试，对肽标准品采谱，调用质谱仪器上的分子量外标校正列表对质谱仪进行分子量校正，完成外标校正后，对待测的样本进行采谱；步骤二，对经过外标法校正并采集的待测的样本质谱数据进一步用内标法校正：1)内标法校正过程为：调用分子量内标校正列表，在样本质谱图中将列表中的参考分子量(referencemass)与对应的检测样本当前分子量(currentmass)的误差按照线性或二次方程曲线拟合建立校正曲线，并应用到整个图谱数据中；误差的计算方法：(currentmass-referencemass)2)使用相对误差ppm值对校正结果进行评估，列出每个校正峰的分子量偏移ppm值；相对误差ppm值的计算方法：前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，微米/纳米结构材料或固相萃取柱包括：多孔硅材料、表面修饰的带有功能基团的多孔硅材料、磁性颗粒、表面修饰的带有功能基团的磁性颗粒或固相萃取柱。前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，样本包括：人或哺乳动物的血清、唾液、尿液、汗液、脑脊液，细菌的裂解液、组织裂解液，细胞裂解液。前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，微米/纳米结构材料富集多个待测的样本中的多肽、蛋白质时，样本、超纯水、微米/纳米结构材料的混合比例为v:v:m＝100-200ul:900-800ul:0.5-1mg。前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，质谱仪为maldi离子源质谱仪。本发明的有益之处在于：本发明的分子量校正标准品的制备方法不仅低成本，且可以根据具体的校准目的选择性的制备校准品；本发明的分子量校正方法具有外标法的操作简便性和内标法的高精度性，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响；本发明的分子量校正试剂盒可以涵盖1000da以下，1000-10000da之间以及10000da以上的肽谱和蛋白谱的分子量校正；本发明的试剂盒可适用于maldi离子源质谱仪，并适用于微生物鉴定、多种体液多肽谱活检等应用场合。附图说明图1是本发明的实施例1的商业化内标品与分子量校正标准品混合后出峰谱图；图2是本发明的实施例1的分子量校正标准品出峰图谱；图3是本发明的实施例1的分子量校正标准品出峰精度；图4是本发明的实施例1的分子量校正标准品出峰稳定性。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤一，多肽或蛋白干粉标准品的制备：1)将多例样本等体积混合，制备大量标准样本；2)使用纳米材料富集标准样本中的多肽、蛋白质，并用洗脱液洗脱；作为一种实施例，洗脱液为30-60％can和0.5-5％tfa；3)将多肽洗脱液冷冻真空干燥，得到多肽或蛋白干粉标准品；步骤二，多肽或蛋白干粉标准品中多肽分子量的测定：1)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品做为内标，制备成含内标的肽标准品溶液；2)将含内标的肽标准品溶液与基质溶液混合后点靶，干燥；3)将靶板放入质谱仪中进行检测，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量；作为一种优选，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量，得到的商业化标准品质谱峰为1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此确定样本的多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273；需要说明的是：本发明的分子量校正标准品列表并未进行穷举，作为一种实施例，还可以是1546.126、3956.030、4209.784、5904.646、9288.273，还可以是740.794、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰在质谱仪控制软件内建立分子量外标校正列表和分子量内标校正列表；作为一种实施例，分子量外标校正列表为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273，共12个校正峰；作为一种实施例，分子量内标校正列表为：740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273，共7个校正峰。步骤三，按照如下配方配置试剂盒；配方包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，包括：对待测的样本进行外标、内标两步法校正；具体包括如下步骤：步骤一，对待测的样本的多肽或蛋白谱的外标法校正；1)使用纳米材料富集多个待测的样本中的多肽、蛋白质，作为一种实施例，样本、超纯水、纳米材料的混合比例为v:v:m＝100-200ul:900-800ul:0.5-1mg。作为一种实施例，微米/纳米结构材料包括：氨基修饰多孔硅材料、羧基修饰多孔硅材料、金属修饰多孔硅材料、氨基修饰磁珠、羧基修饰磁珠、金属修饰磁珠；需要说明的是：本发明并未对微米/纳米结构材料进行穷举，只要是能够适用于本发明的微米/纳米结构材料，都在本发明的保护范围之内；作为一种实施例，样本包括：人或哺乳动物的血清、唾液、尿液、汗液、脑脊液，细菌的裂解液、组织裂解液，细胞裂解液；需要说明的是：本发明并未对生物样本进行穷举，只要是能够适用于本发明的生物样本，都在本发明的保护范围之内。2)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液；3)用基质溶解液溶解基质得到基质溶液，分别加入待测-样本溶液和肽标准品溶液中，点样到同一块靶板上、干燥；4)上机测试，对肽标准品采谱，调用质谱仪器上的分子量外标校正列表对质谱仪进行分子量校正，完成外标校正后，对待测的样本进行采谱；步骤二，对经过外标法校正并采集的待测的样本质谱数据进一步用内标法校正；1)内标法校正过程为：调用分子量内标校正列表，在样本质谱图中将列表中的参考分子量(referencemass)与对应的检测样本当前分子量(currentmass)的误差按照线性或二次方程曲线拟合建立校正曲线，并应用到整个图谱数据中；误差的计算方法：(currentmass-referencemass)2)使用相对误差ppm值对校正结果进行评估，列出每个校正峰的分子量偏移ppm值；相对误差ppm值的计算方法：以下通过实验验证本发明的效果：实施例1：试剂盒，多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为3：10；一，制备人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品：1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800ul混合均匀，并按120ul/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为v:v:m＝100-200ul:900-800ul:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％can、0.5-5％tfa的洗脱液1-1.2ml，振荡10-30min洗脱；4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：1)100-200ul超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3ul/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品proteincalibrationstandardi和peptidecalibrationstandardii(bruker,germany)做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入10ul基质溶液充分混合；3)在maldi-tof靶板上点靶1-2ul，干燥，上机测试；4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化校准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。15)取肽标准品溶液与5-10ul基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试，如附图2所示。以其中一个点样孔做为校准孔，以上文所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。如附图3、4所示，各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273，共12个校准峰。2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；4)算法内标校正：选取740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表1列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。表1序号sample740.81546.12105.54209.85904.67765.69288.31s_01_a_sd54_b1_from_b1_165214.txt320284178378275724362s_01_a_sd54_b5_from_b5_170513.txt228154116268311533293s_01_a_sd54_b12_from_b12_172036.txt21922519729926053329实施例2：与实施例1只有试剂盒的配方不同；试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为1：10；一，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品制备：1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800ul混合均匀，并按120ul/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为v:v:m＝100-200ul:900-800ul:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％can、0.5-5％tfa的洗脱液1-1.2ml，振荡10-30min洗脱；4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：1)100-200ul超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3ul/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入布鲁克标准品做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入30ul基质溶液充分混合；3)在maldi-tof靶板上点靶1-2ul，干燥，上机测试；4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化标准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：1546.126、1619.143、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。5)取2.1标准溶液与5-10ul基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试。以其中一个点样孔做为校准孔，以2.4所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273，共9个校准峰。2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；4)算法内标校正：选取1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表2列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。表2序号sample1546.12105.54209.85904.67765.69288.31a_01_a_sd54_b1_from_b1_sd54_spectrum.txt26412275240820816432a_01_a_sd54_b5_from_b5_sd54_spectrum.txt363124504219553a_01_a_sd54_b12_from_b12_sd54_spectrum.txt89213961429142613344974a_01_a_sd72_b3_from_b3_sd72_spectrum.txt36312186016720595a_01_a_sd72_b7_from_b7_sd72_spectrum.txt2641227502081539实施例3：与实施例1只有试剂盒的配方不同；试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为6：10；一，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品制备：1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800ul混合均匀，并按120ul/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为v:v:m＝100-200ul:900-800ul:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％can、0.5-5％tfa的洗脱液1-1.2ml，振荡10-30min洗脱；4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：1)100-200ul超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3ul/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品proteincalibrationstandardi和peptidecalibrationstandardii(bruker,germany)做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入5ul基质溶液充分混合；3)在maldi-tof靶板上点靶1-2ul，干燥，上机测试；4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化标准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、4282.591、5004.361、5336.789、7765.637、9288.273。5)取2.1标准溶液与5-10ul基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试。以其中一个点样孔做为校准孔，以2.4所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：740.794、1261.149、1466.466、2105.486、2952.661、5004.361、5336.789、9288.273，共8个校准峰。2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；4)算法内标校正：选取740.794、2105.486、5004.361、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表2列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。表3序号sample740.82105.54209.85004.47765.69288.31b_01_a_og6_a2_from_a2_142031.txt84410323677121721762b_01_a_og6_a8_from_a8_143422.txt84414943677331721763b_01_a_og6_a10_from_a10_144451.txt844103259869017268对比实施例：选择的列表与实施例1不同，其他全部一样。试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为3：10；一，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品制备：1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800ul混合均匀，并按120ul/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为v:v:m＝100-200ul:900-800ul:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％can、0.5-5％tfa的洗脱液1-1.2ml，振荡10-30min洗脱；4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：1)100-200ul超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3ul/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品proteincalibrationstandardi和peptidecalibrationstandardii(bruker,germany)做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入10ul基质溶液充分混合；3)在maldi-tof靶板上点靶1-2ul，干燥，上机测试；4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化校准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。5)取2.1标准溶液与5-10ul基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试。以其中一个点样孔做为校准孔，以2.4所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：1546.126、3956.030、4209.784、5904.646、9288.273，共5个校准峰。2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；4)算法内标校正：选取740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表1列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。表4序号sample740.81546.12105.54209.85904.67765.69288.313s_03_a_sg4_h6_from_h6_175010.txt315722847783786387254414s_03_a_sg4_h8_from_h8_175147.txt184122848416083115332915s_03_a_sg4_h11_from_h11_180312.txt1841291577860861353329结果分析：通过实施例1-3的结果可知，本发明的配方范围的试剂盒均能实现精准的分子量外标、内标校准。多肽或蛋白干粉溶液与基质溶液体积配比为3：10为最佳配方，原因是质谱峰出峰最多，分子量校正更加全面，更加精准。其他配方的多肽浓度太低或太高，均会影响质谱出峰，从而降低校准能力。通过实施例1和对比实施例可知：本发明选择的列表覆盖的分子量校准范围更广，校准精度更高。分子量校准为非线性关系，无法对校准范围外的质谱峰实现精确校准。本发明的分子量校正标准品的制备方法不仅低成本，且可以根据具体的校准目的选择性的制备校准品；分子量校正方法具有外标法的操作简便性和内标法的高精度性，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响；试剂盒可适用于maldi离子源质谱仪，并适用于微生物鉴定、体液肽谱等应用场合。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12