专利名称：一种黑麦1rs染色体特异的est-sts标记引物1、筛选方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1 、 筛选方法及用途，属于基因分子标记研究领域。
技术背景小麦是世界上重要的粮食作物之一，在生产中常常受到各种病害 的威胁，造成产量或品质的下降。小麦的近缘物种黑麦，具有抗病、 高产、耐瘠等许多优良性状。研究表明黑麦1RS染色体上有抗白粉 病、抗条锈病、抗叶锈病、抗杆锈病、抗麦二叉蚜等众多抗性基因， 还有提高产量和适应性的基因。通过远缘杂交和染色体操作技术，可 将黑麦1RS染色体上的这些有益基因导入至普通小麦。黑麦1RS染色体或染色体片段导入普通小麦后，需要对其迸行 鉴定，才可有效利用1RS上的外源优异基因。建立在DNA序列基础 上的分子标记，特别是以PCR为基础的分子标记，以其准确、快捷、 不受植物生长时期限制等优点而被广泛运用。Ko Jong-Min等筛选出 了两个黑麦基因组特异的RAPD (Random amplified polymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA)标记，并获得了两个克隆pSclOC和 pSc20H,原位杂交结果显示它们分布于所有黑麦染色体上(参考文 南犬Jong-Min Ko， Geum-Sook Do, Duck-Yong Suh, et al. 2002. Identification and chromosomal orgnization of two rye genome-specifiRAPD products useftil as introgression markers in wheat. Genome, 45:157-164)。然而RAPD标记稳定性较差，难以在育种中有效利用。 M.Cristina Katto等根据pSc20H克隆设廿了可以鉴定黑麦染色体片段 的以PCR为基础的标记(参考文献M.Cristina Katto， Takashi R. Endo，Shuhei Nasuda. 2004. A PCR-based marker for targeting for small rye segments in wheat background. Genes Genet. Syst" 79.p. 245-250)。刘成等筛选到黑麦特异的RAPD标记，并将其转化为SCAR标记(参考 文献刘成，李光蓉，杨足君，冯娟，周建平，任正隆.2006.黑麦基因 组特异DNA片段的分离与SCAR标记的建立.西北植物学报,26(12): 2434-2438)。然而这些标记对黑麦全基因组均有扩增，不是1R或IRS 染色体特异的，从而无法将黑麦的1R染色体与2R二7R染色体区分开。 Koebner等根据黑麦与小麦rRNA基因间隔区序列差异，合成了黑麦 IR染色体特异引物NOR-Rl,可以鉴定1RS染色体，但对不含有1R染色体上核仁组织区的重组材料用引物NOR-R1将无法鉴定(参考文 南犬Koebner R. M. D. 1995. Generation of PCR-based markers for the detection of rye chromatin in wheat background. Theor Appl Genet, 90: 740-745)。EST (expressed sequence tag,表达序列标签)是指从不同组织来 源的cDNA文库中随机挑选克隆，并对其3'端或5'端进行单轮测序 所获得的短cDNA序列(参考文献Adams M D, Kelley J M, Gocayne J D, Dubnick M, Polymeropoulos M H. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science,252:1651-1656)。由于EST标记直接来源于cDNA，其保守性较高， 特别是在亲缘物种之间具有相对的保守性，所以根据EST所开发的 STS标记(Site tagged s叫uence,位点标签序列，即直接在EST序列 两端设计引物)在物种之间具有较好的通用性(参考文献:LaRotaM, Sorrells M E. 2004. Comparative DNA sequence analysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genome relationships between wheat and rice. Funct Integr Genomics, 4: 3446)。匕匕车交基因组学石开究 表明普通小麦及其近缘物种之间存在共线性，因此可以利用小麦上已 开发的EST序列来研究小麦的亲缘物种。 发明内容本发明利用黑麦属(&^^)与小麦属(7H&,)同属于小麦亚族 (7K^/""e),理论上它们具有较高的共线性关系，定位于小麦第一部 分同源群上的EST序列很可能也存在于黑麦IR染色体的相应部位， 因此设廿以PCR为基础的标记，转化成STS引物，筛选黑麦IRS染 色体特异的分子标记，以快速检测和追踪导入普通小麦背景中的黑麦 IRS染色体。本发明的技,术方案是通过如下手段实现的这种黑麦IRS染色 体特异的EST-STS标记引物1,其特征在于该标记引物是根据小麦 第一部分同源群的EST序列一BE637935为模板设廿而得到的，其序 列为STSWE126 : F: 5，- TCAAGCACGCATTTCAACTC陽3，，<formula>formula see original document page 8</formula>所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1,其特征在于 引物STSwE^扩增出的大小为850bp的特异片段位于黑麦1RS染色 体上。所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1的筛选方法， 其特征包括如下步骤a、 引物的设廿与合成根据小麦第一部分同源群的EST序列， 选取35个碱基数大于300bp的EST序列进行下载，利用Primer Premier5.0软件设廿了35对引物，条件为退火温度50-60°C.引物的 长度18-22bp， GC。/。含量为40-60°/。，预期扩增产物300-600bp ;合成 的引物用超纯水溶解至20,olL—H乍为母液于-20。C冰箱保存，使用 前吸取部分母液用10mM Tris - HC1与ImM EDTA稀释至2|amol /L 作为工作液待用；b、 黑麦染色体特异标记引物的筛选利用步骤a设廿合成的35 对EST-STS引物，分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、 簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果引 物STSWEl26,序列为STSWE126F: 5，- TCAAGCACGCATTTCAACTC -3,和STSWE126R: 5，- ACAGATGTCCAAAGCCCAAC -3，—在帝国 黑麦中扩增出一条大小为850bp的特异带，从而筛选出黑麦染色体组 特异的EST-STS丰示i己弓l物；c、 黑麦1R染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到的
多态性EST-STS引物，分别对普通小麦中国春和一整套中国春-帝国黑麦的二体附加系迸行扩增分析，结果在帝国黑麦与中国舂-帝国黑麦1R二体异附加系中分别扩增出一条大小为S50bp的特异带，确定 黑麦1R染色体特异标记引物；d、黑麦1RS染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到 的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普 通小麦铭贤169和小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13 进行扩增分析，结果洛夫林10、洛夫林13和帝国黑麦能扩增出一条 大小为850bp的特异带,确定黑麦1RS染色体特异标记引物STSWEI26 。所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物的筛选方法，步骤b 所述扩增分析包括在体积为0.2mL的Eppendof管中依次加入约 10 20ng的模板DNA, lxPCR buffer, 1.5mmol L-1 MgCl2， 200mmol I/1 dNTP,左右引物终浓度各为0.2pmo1 L—', 0.5U Taq DNA聚合酶，最 后用无菌蒸馏水补充反应体系至10iiL ;然后将有上述反应液的 Eppendo僧放置在PE2700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应程序 为先94。C预变性3分；再94。C变性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸l 分20秒，循环32次；72。C延伸10分；最后10。C保存；扩增反应结束后对PCR扩增产物进行电泳检测，结果引物STSwE,26在帝国黑麦中扩增出一条大小为850bp的带，而无黑麦基因组的中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这条带，确定STSwEw就是黑麦染色体组特异的标记。所述黑麦1RS染色体特舁的EST-STS标记引物1的筛选方法，所 述PCRr增产物迸行电泳检测步骤为在PCR扩增产物中加入指示 剤2pL，混匀，取其中3^用8%非变性緊丙烯酰胺凝胶电泳检测， 电泳电压为150~180 V，电泳1.5h后，用银染法进行染色，最后将染 色后的胶在凝胶成像仪上观测照相。所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1的用途，其特 征在于使用标记引物扩增分析lRS易位材料，能够扩增出一条850bp 特异带的材料，即可确定含有黑麦1RS染色体。本发明与已有技术相比较的优点是1 、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物不仅拓宽 了小麦EST的使用范围，同吋为深入研究普通小麦远缘杂种材料提 供了新的工具。2、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物利用普通 PCR技术就可以进行，不需要其他繁琐的程序，可以简单、快速地鉴 定黑麦1RS染色体。3 、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物与模板的 结合能力较强，虽然本研究所使用的退火温度为55°C,但退火温度 在51-58。C均能较好地扩增出目标片段，实验条件要求较为宽松。4 、本发明的黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物序列位于 小麦1B染色体靠近着丝粒区域，根据比较基因组学的原理，该标记 也应该位于1R染色体靠近着丝粒区域，因此可以结合其它1RS染色 体的特异标记鉴定涉及1RS不同断点的材料。
图1 : BE637935的序列以及本发明STSWE126的正向引物和反向 引物的反向互补序列在EST序列上的位置。图2 :用本发明设廿合成的35对EST-STS引物分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组 DNA进行多态性扩增分析，结果只有引物STSwE,26在帝国黑麦中扩 增出大小为850bp的带，而中国春、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增 出这一条带，说明STSwEw是黑麦染色体组特异的标记。图3 :用普通小麦中国春、帝国黑麦及中国春-帝国黑麦1R 7R 二体异附加系共9个材料的DNA为模板，用本发明的引物STSWE126 进行PCR扩增，结果显示只有附加1R染色体的材料能扩增出与帝国 黑麦一样的大小为850bp的特异带，而对照中国春和2R 7R异附加 系没有扩增出这一条特异带，说明这一条带位于黑麦1R染色体上。图4 :用普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通小麦铭贤169、小 麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10和洛夫林13共5个材料的DNA 为模板，用本发明的引物STSw簡进行PCR扩增，结果显示只有洛 夫林10和洛夫林13能扩增出与帝国黑麦一样的大小为850bp的特异 带，说明这一条带位于黑麦1RS染色体上。图5 :用普通小麦小偃6号与"德国白粒"黑麦杂交后代选育的 11个材料的DNA为模板，用本发明的引物STS画26迸行PCR扩增, 其中4个含有1RS染色体的后代材料均扩增出大小为850bp的特异
带，7个不含有黑麦1RS染色体的材料没有扩增出相应的特舁带。图示1 11为小偃6号与"德国白粒"黑麦杂交后代材料，M为分子量 标记DL2000 。
具体实施方式
实施例l 、引物的设廿与筛选1 、 EST序列的获得根据美国农业部网站 (http:〃wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml )发布的小麦表达序列标 签(EST)数据库，查找定位于小麦第一部分同源群不同物理区段的 EST及其序列，选取35个保守性比较强的且碱基数大于300bp的EST 序列进行下载。附图1是其中一个EST—BE637935的碱基序列。2、引物的设廿与合成将步骤1中下载的EST序列—利用Primer Premier 5.0软件对其进行引物的设计_共设廿了 35对引物。引物设 廿的条件为退火温度50-60°C,引物的长度18-22bp, GC。/。含量(鸟 嘌Guanine和胞嘧啶Cytosine占碱基总数的比例)为40-60%,预期 扩增产物300-600bp。设廿的引物由上海联合基因有限公司合成。3 、引物的稀释将步骤2中合成的引物，用超纯水溶解至20pmd L"作为母液于-20。C冰箱中保存，使用前吸取部分母液用lxTE(10mMTris-HCl与lmM EDTA PH = 8.0)稀释至2pmo1 L'1作为工作液待用。4、黑麦特异标记的筛选如果某个引物在黑麦中扩增出与其他 供试材料有差异的带，那么这个引物就是筛选出的黑麦染色体组的特
利用步骤3中稀释好的35对EST-STS引物，分别对普通小麦中 国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA 进行多态性扩增分析，具体扩增如下在体积为0.2mL的Eppendof 管中依次加入约10 20ng的模板DNA， lxPCR buffer, 1.5mmol L" MgCl2， 200mmol L" dNTP,左右引物终浓度各为0.2|imol L'1 ， 0.5U 7^ DNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至lO(iL。然后将有上 述反应液的Eppendof管放置在PE2700基因扩增仪上进行扩增反应。 扩增反应程序为先94。C预变性3分；再94。C变性30秒，55。C退火 30秒，72。C延伸1分20秒，循环32次;72。C延伸10分;最后10。C保存。PCR扩增产物检测方法为在PCR扩增产物中加入指示剂(0.25% 溴酚蓝、0.25%甲基绿、40%蔗糖，水余量)2pL,混匀，取其中3pL 用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺N,N'-甲叉双丙烯酰胺 =39:1)电泳检测，电泳电压为150 180 V,电泳1.5h左右后，用银染法进行染色，最后将染色后的胶于凝胶成像仪上观测照相。结果 引物 STSWE126 ( 序列为 STSWE126F: 5，-TCAAGCACGCATTTCAACTC-3，； STSWE126R: 5，-ACAGATGTCCAAAGCCCAAC -3，。)在帝国黑麦中扩增出大小为 850bp的带，而中国舂、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这条带，如图2所示，说明STSwEW就是黑麦染色体组特异的标记。5 、黑麦1RS染色体特异标记的筛选利用步骤4筛选到的多态性EST-STS引物STSWE126,对中国春 和一整套中国舂-帝国黑麦的二体舁附加系(公知公用，参考文献:Driscoll C J， Sears E R， 1971. Individual additions of the chromosomes of "Imperial" rye to wheat. Agron Abstr, 1971:6)迸行PCR扩增反应， 反应条件与扩增程序同步骤4 。 PCR扩增反应后对扩增产物迸行电泳检测，检测方法同步骤4 ，检测后确定引物STSwE,26在帝国黑麦及中国春-帝国黑麦lR二体异附加系中分别扩增出一条大小为850bp的特 异带，而对照中国春与中国春-帝国黑麦2R 7R二体异附加系均没有 扩增出这条相应的特舁带，如图3所示，说明这个标记为黑麦1R染 色体特异标记。然后利用引物STSwE^扩增普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普通 小麦铭贤169、小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林IO和洛夫林13，反 应条件与扩增程序同步骤4 。PCR扩增反应后对扩增产物用迸行电泳 检测，检测方法同步骤4 ,结果显示只有1BL/1RS易位系洛夫林10、 1BL/1RS易位系洛夫林13和帝国黑麦能扩增出一条大小为850bp的 特异带，如图4所示，说明这一个扩增位点位于黑麦1RS染色体上， 引物STSwE!26为黑麦1RS染色体的特异标记。因其扩增出一条特异 带，故命名为黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1 。实施例2、本发明的标记引物在1RS易位材料中的检测应用利用实施例1中筛选到的黑麦1RS染色体特异的标记引物 STSwei26,扩增小偃6号和"德国白粒二黑麦OS. cew"/e丄.cvgerw"" vv/zte)杂交的部分后代材料，反应条件与扩增程序同步骤4 ，扩增反
应后对扩增产物迸行检测，检测方法同步骤4 ,结果在供试的11个材料中，4个材料扩增出大小为850bp的特异带，即可确定含有黑麦 1RS染色体，其它7个材料没有扩增出这一条相应的特异带，即可确 定其不含有黑麦1RS染色体，如图5所示。此结果与基因组原位杂 交鉴定结果一致。本发明列举的实施旨在更进一步地阐明这种黑麦1RS染色体特 异的EST-STS标记引物、筛选方法及用途。而不对本发明的范围构 成任何限制。
权利要求
1.一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1，其特征在于该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列-BE637935为模板设计而得到的，其序列为STSWE126 F5’-TCAAGCACGCATTTCAACTC-3’， R5’-ACAGATGTCCAAAGCCCAAC-3’。
2、 根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引 物1,其特征在于引物STSwE,26扩增出的一条大小为850bp的特异 片段位于黑麦1RS染色体上。
3、 根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引 物1的筛选方法，其特征包括如下步骤a、 引物的设廿与合成根据小麦第一部分同源群的EST序列， 选取35个碱基数大于300bp的EST序列迸行下载，利用Primer Premier5.0软件设廿了35对引物，条件为退火温度50-60°C ,引物的 长度18-22bp， GC。/。含量为40-60%,预期扩增产物300-600bp ;合成 的引物用超纯水溶解至20,d L—1作为母液于-20。C冰箱中保存，使 用前吸取部分母液用10mMTris-HCl与lmMEDTA稀释到2pmol/L 作为工作液待用；b、 黑麦染色体特异标记引物的筛选利用步骤a设廿合成的35 对EST-STS引物，分别对普通小麦中国春；小麦近缘物种帝国黑麦、簇毛麦、大麦和鹅观草的基因组DNA进行多态性扩增分析，结果引 物STSWE126 (序列为STSWE126F: 5，陽TCAAGCACGCATTTCAACTC -3，禾0 STSWE126R: 5，- ACAGATGTCCAAAGCCCAAC -3，)在帝国 黑麦中扩增出大小为S50bp的特异带，从而筛选出黑麦染色体组特异 的EST-STS标记引物；c、 黑麦1R染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到的 多态性EST-STS引物，分别对中国春和一整套中国春-帝国黑麦的二 体附加系进行扩增分析，结果在帝国黑麦及中国春-帝国黑麦1R二体 异附加系中分别扩增出大小为850bp的特异带，确定黑麦1R染色体特异标记引物；d、 黑麦1RS染色体特异标记引物的筛选利用步骤b中筛选到 的多态性EST-STS引物，分别对普通小麦小偃6号、帝国黑麦、普 通小麦铭贤169和小麦/黑麦1BL/1RS易位系洛夫林10、洛夫林13 进行扩增分析，结果洛夫林10、洛夫林13和帝国黑麦均能扩增出大 小为850bp的特异带，确定黑麦1RS染色体特异标记引物STSWE126。
4、根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1 的筛选方法，其特征在于步骤b所述扩增分析包括在体积为0.2mL 的Eppendof管中依次加入约10 20ng的模板DNA， lxPCR buffer, 1.5mmolL"MgCl2, 200mmol L" dNTP，左右引物终浓度各为0.2iamo1 I/1, 0.5UTaqDNA聚合酶，最后用无菌蒸馏水补充反应体系至10nL ; 然后将有上述反应液的Eppendo僧放置在PE2700基因扩增仪上进行 扩增反应；扩增反应程序为先94。C预变性3分；再94。C变性30秒，55t:退火30秒，72。C延伸l分20秒，循环32次；72。C延伸10分；最后 10。C保存；扩增反应结束后对PCR扩增产物进行电泳检测，结果引物 STSM^6在帝国黑麦中扩增出大小为850bp的特异带，而无黑麦基因 组的中国舂、大麦、簇毛麦和鹅观草没有扩增出这一条带，确定STSwE,26就是黑麦染色体组特异的标记。
5、 根据权利要求4所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1 的筛选方法，其特征在于所述PCR扩增产物迸行电泳检测步骤为 在PCR扩增产物中加入指示剤2)iL，混匀，取其中3^用8%非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180 V,电泳1.5h后，用 银染法进行染色，最后将染色后的胶于凝胶成像仪上观测照相。
6、 根据权利要求1所述黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引 物1的用途，其特征在于使用标记引物扩增分析1RS易位材料， 能够扩增出850bp特异带的材料，即可确定含有黑麦1RS染色体。
全文摘要
本发明提供一种黑麦1RS染色体特异的EST-STS标记引物1，其特征在于该标记引物是根据小麦第一部分同源群的EST序列一BE637935为模板设计而得到的，其序列为STS<sub>WE126</sub>F5’-TCAAGCACGCATTTCAACTC-3’，STS<sub>WE126</sub>R5’-ACAGATGTCCAAAGCCCAAC-3’。引物STS<sub>WE126</sub>扩增出的一条大小为850bp的特异片段位于黑麦1RS染色体上。本发明的标记引物不仅拓宽了小麦EST的使用范围，同时为深入研究普通小麦远缘杂种材料提供了新的工具，利用普通PCR技术就可以进行，不需要其他繁琐的程序，可以简单、快速地鉴定黑麦1RS染色体。
文档编号C12Q1/68GK101165193SQ20071013950
公开日2008年4月23日 申请日期2007年9月28日 优先权日2007年9月28日
发明者安调过, 王春梅, 强 高 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所