一种豇豆抗根腐病的苗期鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于园艺作物抗病性鉴定技术领域，具体设及一种班豆抗根腐病的苗期鉴 定方法，与作物抗病育种中抗性材料的早期快速鉴定技术领域有关。
【背景技术】
[0002] 班豆(学名Vi即a unguiculata)俗称角豆、姜豆、带豆、挂豆角，属于豆科一年生植 物，主要产于热带、亚热带和溫带地区。班豆在我国栽培历史悠久，种植分布面积广，除青海 和西藏外，全国各省市区均有种植。一般W春夏栽培为主，其次是秋季栽培。近年来，随着种 植面积的增长，再加上班豆生长于高溫湿热的环境，易诱发班豆根腐病的发生。
[0003]班豆根腐病由半知菌亚口的茄腐皮镶抱菌[Fusarium solani Schl.]侵染所致。 病菌可在病残体或腐肥及±壤中存活多年，无寄主时可腐生10年W上;种子不带菌，初侵染 源主要是带菌肥料和±壤，通过农具、雨水及灌概水传播蔓延，从伤口侵入致皮层腐烂。± 壤含水量大，±质粘重或反季节栽培时易发病。班豆根腐病早期症状不明显，直到开花结芙 期植株较矮小，病株下部叶片从叶缘开始变黄枯萎，一般不脱落，病株容易拔出，茎的地下 部和主根变成红褐色，病部稍凹陷，有的开裂深达皮层，剖开叶柄或茎蔓，维管束已变褐，侧 根脱落或腐烂，主根全部腐烂，病株枯死，±壤湿度大时，常在病株茎基部产生粉红色霉状 物，即病菌的分生抱子梗和分生抱子。
[0004]培育抗病品种是防治班豆根腐病的重要方法之一，抗性资源的获得对于抗病育种 意义重大，客观、快速地评价班豆品种根腐病抗性的强弱是班豆抗根腐病育种过程中最基 础、最重要的环节。目前关于班豆抗根腐病鉴定还未有人报道。关于抗性鉴定的方法最可靠 的是人工病圃鉴定，该方法被认为是最接近自然实际的鉴定方法，在抗病育种过程中应用 最为普遍。但此鉴定方法依赖于自然发病条件，如果环境条件不适合发病或者病圃病菌分 布不均匀，容易造成抗性误判，历时太长，且具有较强的季节性。班豆苗期鉴定方法简便、迅 速、容易控制外界环境条件。因此摸索一套发病迅速、育苗时间短、管理简便、适合大批量育 种材料的班豆根腐病抗性快速鉴定方法对于评价班豆种植材料的抗病性、培育抗病性新品 种、进行合理品种布局具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种班豆抗根腐病的苗期接种鉴定方法。该方 法简便易行，所需设备较少，结果可靠，能较为准确地反映不同班豆品种对根腐病的抗性表 现。
[0006] 实现本发明的技术方案为：
[0007] -种班豆抗根腐病的苗期接种鉴定方法，包括W下步骤：
[000引A、班豆种子催芽：
[0009] 选择市售和常用栽培的班豆品种作为鉴定对象；
[0010] 挑选巧粒饱满的班豆种子，用纱布包好，在55°C恒溫水浴锅中溫汤浸种2小时，进 行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后33°C恒溫处理，直至得到萌发种 子。
[0011] B、播种与幼苗培育：
[0012] 将萌发的种子播种于育苗基质（简称基质，配方见后），进行培养，得到二叶一屯、的 幼苗。
[0013] C、班豆根腐病菌抱子悬浮液的制备：
[0014] a.选择班豆根腐病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2mmX2mm组 织，用无菌水冲洗干净；
[0015] b.对上述组织进行消毒处理，用70%酒精消毒0.5min，再用0.1 %的升隶溶液消毒 0.5-lmin，然后用无菌水冲洗3次，每次Imin，得到消毒处理后的病组织；
[0016] C.将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25°C恒溫条件下培养；
[0017] d.当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落转 入PDA斜面培养基中（4°C冰箱内胆存备用，或可长期应用），筛选得到鉴定班豆根腐病的指 示菌即班豆根腐病菌JGF，化sarium solani Schl.JGF，于2015年12月4日送中国.武汉.武 汉大学中国典型培养物保藏中屯、保藏，其保藏号为CCTCC N0:M2015723;
[0018] e.从转入菌落的PDA斜面培养基中取CCTCCN0:M2015723的班豆根腐病菌JGF，转 入PDA平板培养基中，25°C恒溫培养7天，得到培养好的班豆根腐病菌JGF;
[0019] f.将培养好的班豆根腐病菌JGF，每皿加10ml灭菌水，用灭菌的载玻片刮取表面菌 丝层，用Ξ层纱布过滤得到分生抱子滤液，用血球计数板调整抱子浓度，得到班豆根腐病菌 JG巧包子悬浮液，抱子悬浮液浓度为6X106个/mL;
[0020] D、病原菌侵染处理：
[0021] a.用伊子将二叶一屯、的幼苗从所述育苗培养基质中取出（在提苗过程使之自然摩 擦伤根，不需人工剪根来伤根)轻轻提苗并抖动，进行清洗处理，无需进行伤根处理，得到自 然伤根幼苗；
[0022] b.将自然伤根后的幼苗进行侵染班豆根腐病菌处理，放置到班豆根腐病菌JGF抱 子悬浮液中，浸泡30min得到侵染苗，然后将所述的侵染苗移植到装有消毒沙±基质的营养 鉢中，置于溫室大棚中培养，溫度控制在28±2°C，相对湿度控制在85%或W上，进行正常栽 培管理，10d后调查发病情况。
[0023] E、发病调查：
[0024] 分别于侵染处理后的5天、10天、15天、20天，调查所述侵染苗的发病状况，根据班 豆根腐病病情分级标准确定〇、1、2、3、4、5共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指 数，最后根据该病情指数判断所述班豆品种的班豆根腐病抗性分级。
[0025] 上述育苗培养基质及制备方法为:赔石和干河沙按照重量比1:10混匀，再加入福 尔马林溶液后将基质在阳光下高溫炯晒消毒，得到育苗基质。
[00%]表1班豆根腐病病情分级标准
[0027]
[0028] 病情指数(DI)计算方式为：
[0029] 病情指数=S(级数X株数)/(最高级数X总株数）X100,式中S为和。
[0030] 上述的班豆根腐病抗性分级标准如下：
[00川按病情指数(DI)分别划分为，高抗化R):0<DI< 15;抗(R):15<DI<35;中等(M): 35<DI< 55;感(S) :55<DI< 75;高感化S) :DI>75。
[0032] 本发明的试验材料的班豆品种包括台湾春秋红、紫秋班八寸红、祖研黑仁王子九 号等26个品种(品种名称详见表2,但实施方式不限于上述品种）。
[0033] 本发明的PDA平板培养基及制备方法为:去皮马铃馨200g，切成厚约2mm的片，加入 lOOOmL蒸馈水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后 再补足水份至lOOOmM自然抑(不需调整），于121°C高压蒸汽下灭菌30min;之后在超净工作 台上倒平板，得到PDA平板培养基。
[0034] 本发明相比现有技术具有W下有益效果：
[0035] 1、本发明按步骤进行鉴定的方法与大田成株期接种方法相比，避免了气候条件不 适宜、环境中病虫害等因素的影响，苗期在室内进行抗病性鉴定条件较易控制，鉴定周期 短、操作简便、能节省大量人力物力，尤其适合大批量的班豆材料的根腐病抗性鉴定。
[0036] 2、本发明的班豆出苗好，根系发育完整。采用赔石沙±做培养±吸水好，透气，有 利于班豆出苗整齐一致。在苗期鉴定中，需要在班豆两片真叶平展时，取出幼苗接种根腐病 菌抱子悬浮液，要求班豆苗的根系发育良好。
[0037] 3、本发明由于将班豆幼苗先统一在育苗基质中培养至二叶一屯、再进行侵染，班豆 幼苗的长势、大小易于控制，保证了鉴定结果的一致性和可靠性。
[0038] 4、本发明由于采取了合适的侵染时间、调整了根腐病菌抱子悬浮液的浓度，因此 侵染效果较好，侵染苗存活率高、接菌均匀，发病迅速。
【附图说明】
[0039] 图1:在育苗基质培养的待接菌的班豆幼苗。
[0040] 图2:接菌后在PDA培养基中班豆根腐病菌菌落的显微结构图。附图标记说明：图2 中的A图为根腐病菌菌落;图2中的B图为小型分生抱子;图2中的C图为大型分生抱子;图2中 的D图为厚垣抱子。
[0041] 图3:侵染处理后20d，桂星101长豆角的抗病性鉴定结果图。附图标记说明：图3中 的A图为接菌处理盆栽植株发病情况；图3中的B图为接菌处理拔出后植株病根情况；图3中 的C图为未接菌清水处理)的对照。
【具体实施方式】
[0042] 实施例1
[0043] 班豆抗根腐病苗期接种鉴定方法步骤如下：
[0044] A、班豆种子消毒催芽：
[0045] 选择不同类型班豆材料作为鉴定对象(班豆的分类为常用方法），本实施例的接菌 的试验品种包括班豆品种或品系如台湾春秋红、紫秋班八寸红、祖研黑仁王子九号等26个 品种（品种名称详见表2,实施本发明不限于上述品种，上述用于接菌品种为常见栽培品种， 作为抗病性鉴定试验，品种不限于此）；
[0046] 挑选班豆材料的巧粒饱满的种子，用纱布包好，在55°C恒溫水浴锅中溫汤浸种2小 时，进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后33°C恒溫处理，直至种子萌 发露白。
[0047]B、播种与幼苗培育：
[0048] 将萌发的种子播种于装有育苗基质的白色盒子中，进行培养，得到二叶一屯、的幼 苗(见图1);
[0049] 育苗培养基质及制备方法为:赔石和干河沙按照重量比1:10混匀，再加入福尔马 林溶液后将基质在阳光下高溫炯晒